一株生防枯草芽胞桿菌桿菌霉素l分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株生防枯草芽胞桿菌Bs916胞外抗菌脂肽桿菌霉素L及其分離純化方法。桿菌霉素L的分子量為1020.6和1034.6，屬于相差一個亞甲基的同系物。其分離純化的方法是：首先通過基因敲除構(gòu)建Bs916合成泛革素能力喪失的突變株BFM；其次從BFM的發(fā)酵液中采用酸沉淀和甲醇抽提制備桿菌霉素L的粗提物，再次經(jīng)過NH2和C18層析柱分離純化桿菌霉素L。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜分析表明制備的桿菌霉素L達(dá)到電泳純和色譜純。純化的桿菌霉素L對開發(fā)為抗真菌藥物具有較高的研究和應(yīng)用價值，也可用作為生物化學(xué)上的標(biāo)準(zhǔn)品使用。CGMCC No080820020930
【專利說明】 一株生防枯草芽胞桿菌桿菌霉素L分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一株生防枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis Bs916的胞外脂肽抗生素桿菌霉素L的分離純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽胞桿菌是植物和土壤生態(tài)中的優(yōu)勢生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。由于枯草芽胞桿菌胞外能產(chǎn)生豐富的抗菌代謝產(chǎn)物，同時由于其具有生長速度快，存活時間長，對酸、堿、高溫、紫外線以及電磁輻射等不良環(huán)境的耐受能力強(qiáng)，營養(yǎng)要求簡單，安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛的應(yīng)用于植物真菌病害和細(xì)菌病害的防治。
[0003]枯草芽胞桿菌分泌的抗菌代謝產(chǎn)物主要有三大類，其一是通過核糖體合成途徑合成的多肽類小分子化合物；其二是通過非核糖體合成途徑的合成的脂肽類抗生素；其三是合成的一些非蛋白質(zhì)性質(zhì)的雜合抗生素。
[0004]脂肽類抗生素是一類由親水性環(huán)狀短肽頭部和長鏈?zhǔn)杷灾舅嵛膊拷M成的雙親性次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌活性和溶血性能，在醫(yī)藥、農(nóng)藥和工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用價值。脂肽類抗生素根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異可分為表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和泛革素(Fengycin)三大家簇。
[0005]表面活性素家簇結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是由7個氨基酸殘基的多肽鏈通過酯鍵與含有13?15個碳原子β_羥基脂肪酸交聯(lián)形成內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)的極性化合物。表面活性素表現(xiàn)出較強(qiáng)溶血活性、抑制細(xì)菌和病毒的活性。伊枯草素家簇結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是由7個氨基酸殘基的多肽鏈與含有14?17 β -氨基脂肪酸鏈相連形成的化合物。伊枯草素也具有較強(qiáng)的溶血活性和強(qiáng)的抗真菌活性。泛革素家簇結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是由10個氨基酸殘基的多肽鏈通過酯鍵與含有14?18個β -羥基飽和或非飽和的脂肪酸交聯(lián)形成內(nèi)酯環(huán)。泛革素的溶血作用沒有表面活性素和伊枯草素強(qiáng)烈，但表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗真菌活性和弱的抗細(xì)菌和病毒活性。
[0006]脂肽抗生素的理化性質(zhì)穩(wěn)定，如:熱穩(wěn)定好，在121°C高壓滅菌30min，活性還能保持在95% ;對胰蛋白酶、蛋白酶K等多種蛋白酶不敏感；對氯仿等有機(jī)溶劑具有耐受性；抗紫外照射。脂肽抗生素具有如此高的穩(wěn)定性，與其分子量小和特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。
[0007]目前通過構(gòu)建產(chǎn)脂肽抗生素缺失突變株及突變株抗菌性能的研究表明脂肽抗生素是枯草芽胞桿菌拮抗病原真菌的主要因子。一株具有優(yōu)良拮抗性能的枯草芽胞桿菌菌株通常能同時合成分泌表面活性素、伊枯草素和泛革素；其中任一一種脂肽類抗生素合成能力的缺失都會導(dǎo)致突變株抗真菌活性不同程度的下降；當(dāng)其中兩種或者三種脂肽類抗生素合成能力的全部缺失，會極大的降低或者導(dǎo)致突變株完全喪失抗真菌活性。表面活性素、伊枯草素和泛革素對植物病原真菌具有協(xié)同增效作用。
[0008]桿菌霉素L是脂肽類抗生素伊枯草素家族的一種，通過構(gòu)建桿菌霉素L合成能力喪失突變株，及對桿菌霉素L的生物學(xué)功能研究表明桿菌霉素L不僅是生防枯草芽胞桿菌抗真菌的關(guān)鍵因子之一，桿菌霉素L基因族的突變還能影響枯草芽胞桿菌生物I吳的形成，感受態(tài)的形成及定殖能力等生命現(xiàn)象。桿菌霉素L在醫(yī)藥、工業(yè)和農(nóng)業(yè)上作為抗真菌制劑在具有潛在的應(yīng)用前景，因此建立一種高效的分離方法純化桿菌霉素L的方法具有重要的價值。
[0009]通常篩選到的一株高產(chǎn)桿菌霉素L的枯草芽胞桿菌菌株，其還能分泌泛革素和表面活性素，由于這三類脂肽類化合物的理化性質(zhì)相近，因此不容易通過簡單的純化方法將它們分開，特別是將桿菌霉素L和泛革素。
[0010]枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis Bs916是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院20世紀(jì)90年代分離的生防菌，對水稻紋枯病具有很好的防治效果，已經(jīng)成功進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)10多年，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。該菌株于2002年09月30日在中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC N0.0808。經(jīng)過前期研究表明Bs916能分泌產(chǎn)生桿菌霉素L、泛革素和表面活性素三類脂肽抗生素，是Bs916具有抗真菌活性的關(guān)鍵因素。本發(fā)明通過構(gòu)建基因突變株和色譜分離技術(shù)相結(jié)合建立一種從Bs916中分離純化桿菌霉素L的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于:提供枯草芽胞桿菌抗菌脂肽桿菌霉素L，以及一種枯草芽胞桿菌胞外抗菌脂肽桿菌霉素L的分離純化方法。
[0012]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:枯草芽胞桿菌抗菌脂肽桿菌霉素L，其特征在于:從枯草芽胞桿菌Bs916的泛革素基因突變株BFM的胞外產(chǎn)物中分離純化后獲得；通過電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜測定包含有分子量為1020.6、和1034.6等相差一個亞甲基(-CH2)的桿菌霉素L同系物。
[0013]一種枯草芽胞桿菌胞外抗菌脂肽的分離純化方法，其特征在于:
[0014]a、以氯霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記基因，泛革素合成基因部分核酸序列作為單交換同源片段，構(gòu)建整合敲除載體pSG1164-Fen ;將構(gòu)建的整合敲除載體轉(zhuǎn)化至枯草芽胞桿菌Bs916，構(gòu)建泛革素基因簇突變株BFM。突變株BFM合成泛革素的能力喪失，但保持合成分泌產(chǎn)生桿菌霉素L的能力。
[0015]b、將雙突變株BFM轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，在28°C、180r / min條件下振蕩培養(yǎng)72h，發(fā)酵液離心除去菌體，用濃鹽酸調(diào)至pH2.0沉淀過夜。8000g離心25min得到沉淀,沉淀采用甲醇抽提，抽提物經(jīng)0.22 μ mol.L-1微孔濾膜后，即為粗制備的桿菌霉素L樣品。
[0016]C、將粗提物采用去離子水稀釋為含30%甲醇水溶液，pH值調(diào)至7.0，然后上樣于NH2固相萃取柱,分別用含50%甲醇水溶液，100%甲醇,含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脫。在紫外光0D21Onm處檢測，其中在含1%甲酸甲醇洗脫溶液中檢測到桿菌霉素L。
[0017]d、將含1%甲酸甲醇洗脫溶液的pH值調(diào)至7.0，氮?dú)獯蹈蓾饪s、再用去離子水稀釋為30%甲醇水溶液，然后上樣于C18固相萃取柱；采用梯度洗脫30%，50%，70%，90%甲醇水溶液洗脫。在紫外光0D210nm處檢測，其中在含70%甲醇水洗脫溶液中檢測到桿菌霉素L0
[0018]e、將70%甲醇水洗脫溶液氮?dú)獯蹈珊笤傧♂尀?0%甲醇水溶液，再上樣于C18固相萃取柱；采用10倍柱體積的50%，55%，60%，65%，70%，75%甲醇水溶液梯度洗脫，其中在60 %、65 %洗脫液得到目標(biāo)化合物桿菌霉素L。合并60 %、65 %洗脫液氮?dú)獯蹈蓾饪s后真空干燥，得到桿菌霉素L的純品。
[0019]f、提取的桿菌霉素L采用Tricine-SDS-PAGE檢測，已經(jīng)達(dá)到電泳純，即只有一條帶。提取的桿菌霉素L高效液相色譜的檢測條件為:采用α8(5μπι;25(Λ74.6πιπι;VYDAC218TP ；VYDAC, Hesperia, CA)柱;流動相為乙腈:水:三氟乙酸(40:60:0.5vol /vol);流速為ImL.min-1 ;紫外檢測波長為210nm ;已經(jīng)達(dá)到色譜純。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明建立了一種從生防枯草芽胞桿菌Bs916中分離純化獲得胞外抗菌脂肽桿菌霉素L的方法。該方法通過基因敲除和色譜分離建立了高效快速制備高純度的桿菌霉素L樣品的技術(shù)體系。桿菌霉素L純品具有抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、對蛋白酶不敏感、對高壓和有機(jī)溶劑都具有一定耐受性的特點(diǎn)，對于開發(fā)廣譜抗真菌藥物具有極高的研究和應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1桿菌霉素L化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖
[0022]圖2泛革素合成操縱子單交換突變示意圖
[0023]圖3桿菌霉素L的Tricine-SDS-PAGE電泳圖
[0024]圖4桿菌霉素L的高效液相色譜分析
[0025]圖5電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜對桿菌霉素L同系物的解析圖
[0026]圖6桿菌霉素L的溶血活性
[0027]圖7桿菌霉素L對西瓜枯萎抗菌活性

【具體實(shí)施方式】
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[0028]下面用實(shí)施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0029]實(shí)施例1桿菌霉素L和泛革素合成基因突變株的構(gòu)建
[0030]采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法從枯草芽胞桿菌Bs916基因組DNA中擴(kuò)增泛革素合成基因部分片段IFenA，擴(kuò)增片段經(jīng)過酶切和酶連接克隆至pSG1164質(zhì)粒載體，構(gòu)建單交換敲除質(zhì)粒載體pSGl 164-Fen ;構(gòu)建的單交換敲除質(zhì)粒載體pSGl 164-Fen通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至野生型枯草芽胞桿菌Bs916，篩選正確的轉(zhuǎn)化子，獲得泛革素合成基因的突變株BFM。
[0031 ] 實(shí)施例2桿菌霉素L粗提物的制備
[0032]將生防枯草芽胞桿菌Bs-916的突變株BFM轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中(所述的LB培養(yǎng)液，為胰蛋白胨1g / L，酵母粉5g / L，氯化鈉5g/L，ρΗ7.0，在28°C、180r / min條件下振蕩培養(yǎng)72h。發(fā)酵液在4°C，5000r / min，離心30min除去菌體，對上清夜用濃鹽酸調(diào)至pH2.0沉淀過夜。8000r / min離心25min得到沉淀,沉淀采用甲醇抽提,抽提物經(jīng)0.22 u mol.L 1微孔濾I旲后，即為粗制備的桿囷霉素L樣品。
[0033]實(shí)施例3桿菌霉素L的純化
[0034]將粗提物采用去離子水稀釋為含30%甲醇水溶液，pH值調(diào)至7.0，然后上樣于NH2固相萃取柱，分別用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脫，在1%甲酸甲醇洗脫溶液中含有目標(biāo)化合物。
[0035]將含1%甲酸甲醇洗脫溶液的pH值調(diào)至7.0，氮?dú)獯蹈蓾饪s后用去離子水稀釋為30%甲醇水溶液，然后上樣于C18固相萃取柱；采用3倍柱體積的30%，50%，70%，90%甲醇水溶液梯度洗脫，其中在含70%甲醇水洗脫液中得到桿菌霉素L的純品，純度為95%，共10mg0
[0036]70%甲醇水洗脫液氮?dú)獯蹈蓾饪s后用再稀釋為40%甲醇水溶液，重新上樣于C18固相萃取柱；采用10倍柱體積的50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %甲醇水溶液梯度洗脫，其中在60%洗脫液、65%洗脫液得到目標(biāo)化合物桿菌霉素L同系物A、B的純化物。上述洗脫液氮?dú)獯蹈蓾饪s后真空干燥，分別得到桿菌霉素L的純品80mg，純度約為98%。
[0037]實(shí)施例4桿菌霉素L的Tricine-SDS-PAGE電泳
[0038]Tricine-SDS-PAGE中分離膠濃度為16.5 %，夾層膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%。將桿囷霉素L純品l.0yg和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品10 μ L上樣于凝I父中加樣孔，然后在4 C中，IlOV電泳4小時；電泳后凝膠采用考馬斯亮藍(lán)染色，然后采用乙酸:甲醇:水(I:1:8)溶液脫色至呈現(xiàn)出清晰的條帶。
[0039]實(shí)施例5桿菌霉素L的高效液相色譜分析
[0040]提取的桿菌霉素L高效液相色譜的檢測條件為:采用α8(5μπι;25(Λ74.6_;VYDAC218TP ；VYDAC, Hesperia, CA)柱;流動相為乙腈:水:三氟乙酸(40:60:0.5vol /vol);流速為0.5mL *min-l ;紫外檢測波長為210nm。桿菌霉素L同系物A的保留時間分別為12.4min ;桿菌霉素L同系物B保留時間為15.8min。
[0041 ] 實(shí)施例6桿菌霉素L的質(zhì)譜分析
[0042]將分離純化后的桿菌霉素L甲醇溶解后，通過電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜Q-T0F2，在正離子方式下測定結(jié)果顯示桿菌霉素L包含有2個主要的質(zhì)荷比峰(m / z)，即1021.6和1035.6，它們是分子量為1020.6和1034.6，屬于相差一個亞甲基(一 CH2)的桿囷霉素L冋系物A和B。
[0043]實(shí)施例7桿菌霉素L的溶血活性
[0044]取不同濃度的桿菌霉素L溶液滴加至含5%新鮮綿陽血細(xì)胞的血清瓊脂平板中，37 0C培養(yǎng)至呈現(xiàn)透明溶血圈。
[0045]實(shí)施例8桿菌霉素L的抗菌性能
[0046]采用平板對峙法和帶毒平板法測定桿菌霉素L對水稻紋枯病、西瓜枯萎病菌都具有一定的抑制效果，抑制的IC5tl分別為3.5μ g / ml和12.2μ g / ml。
【權(quán)利要求】
1.一株枯草芽胞桿菌胞外脂肽抗生素桿菌霉素L，其特征在于:從枯草芽胞桿菌胞外產(chǎn)物中分離純化后獲得；通過電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜測定，分子量為1021.5、1035.5和1049.5等相差一個亞甲基(-CH2)的桿菌霉素L同系物。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一株枯草芽胞桿菌胞外桿菌霉素L的分離純化方法，其特征在于: a、從保藏號為CGMCCN0.0808的枯草芽胞桿菌B.subtilis916中構(gòu)建脂肽抗生素泛革素合成缺失的突變株BFM ； b、從雙突變株BFM的發(fā)酵液中采用酸沉淀甲醇抽提分離表面活性素的粗提物； C、將粗提物采用去離子水稀釋為含30%甲醇水溶液，pH值調(diào)至7.0，然后上樣于NH2固相萃取柱，分別用含50%甲醇水溶液，100%甲醇,含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脫，在紫外光210nm處檢測，其中在含1%甲酸甲醇洗脫溶液中檢測到桿菌霉素L ； d、將含I%甲酸甲醇洗脫溶液的pH值調(diào)至7.0,氮?dú)獯蹈蓾饪s、再用去離子水稀釋為30 %甲醇水溶液，然后上樣于C18固相萃取柱；采用梯度洗脫30 %，50 %，70 %，90 %甲醇水溶液洗脫，在紫外波長210nm處檢測，其中在含70%甲醇水洗脫溶液中檢測到桿菌霉素L ； e、將70%甲醇水洗脫溶液氮?dú)獯蹈珊笤儆萌ルx子水稀釋為40%甲醇水溶液，再上樣于C18固相萃取柱；采用10倍柱體積的50%，55%，60%，65%，70%，75%甲醇水溶液梯度洗脫，其中在60^^65%洗脫液得到目標(biāo)化合物表面活性素，合并60^^65%洗脫液氮?dú)獯蹈蓾饪s后真空干燥，得到桿菌霉素L的純品； f、提取的桿菌霉素L采用Tricine-SDS-PAGE檢測，已經(jīng)達(dá)到電泳純，即只有一條帶。提取的桿菌霉素L高效液相色譜的檢測條件為:采用C18 (5 μ m ；250by4.6mm ；VYDAC218TP ；VYDAC, Hesperia, CA)柱；流動相為乙腈:水:三氟乙酸(40:60:0.5vol / vol);流速為ImL.HiirT1 ;紫外檢測波長為210nm ;已經(jīng)達(dá)到色譜純。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種枯草芽胞桿菌胞外桿菌霉素L的分離純化方法，其特征在于:從保藏號為CGMCC N0.0808的雙突變株BFM中分離脂肽粗提物是:將突變株BFM轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，在28°C、180r / min條件下振蕩培養(yǎng)72h，發(fā)酵液離心除去菌體，用濃鹽酸調(diào)至pH2.0沉淀過夜，8000g離心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物經(jīng).0.22 u mo I.L 1微孔濾I旲后，即為粗制備的桿囷霉素L樣品。
【文檔編號】C07K7/56GK104513294SQ201310444933
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】羅楚平, 陳志誼, 王曉宇, 劉永鋒, 劉郵洲, 張榮勝, 周華飛 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院