一種豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗及其制備方法。該疫苗含有三種B細(xì)胞表位，其賴氨酸為核心基質(zhì)構(gòu)建表位單體相同的四分支肽，并串聯(lián)一個(gè)通用T輔助細(xì)胞（Th）表位，分子量為13kDa，該表位肽命名為PCVCP98-156-228；該疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高效價(jià)的病毒中和性抗體。本發(fā)明的表位肽疫苗具有價(jià)廉、安全、特異性強(qiáng)、容易保存和應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，將在防控豬圓環(huán)病毒病發(fā)揮重要作用。本發(fā)明方法通過表位肽的預(yù)測(cè)、篩選，表位肽疫苗的設(shè)計(jì)，表位肽的合成、純化及鑒定，以及表位肽疫苗的制備四個(gè)步驟制備出一種豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）表位肽疫苗，該方法原料易得、成本較低、容易控制，具有較好的操作性，適應(yīng)推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)表位肽疫苗及其制備方法。[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]1、豬圓環(huán)病毒病已成為當(dāng)前生豬的三大主要疫病之一:
豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的重要病原，該病于 1997年在加拿大西部首次被證實(shí)，相繼北美、歐洲及亞洲多數(shù)國家均有本病流行的報(bào)道。PCV2還與其他幾種疾病有關(guān)，如豬皮炎與腎病綜合征(TONS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、豬先天性振顫、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎等，目前將與PCV2感染有關(guān)的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus associated disease,PCVD)。感染 PCV2 的豬可導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)損傷和免疫缺陷，引起機(jī)體抵抗力下降，使感染豬對(duì)其他病原的易感性增高，造成多種疾病的并發(fā)或繼發(fā)感染，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害。2008年第20屆國際豬病大會(huì)上，人們將其列為當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號(hào)疫病。PCVAD被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為是繼豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的最重要的豬傳染病。
[0004]PCV2還與其他幾種疾病有關(guān)，如豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、豬先天性振顫、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎等，目前將與PCV2感染有關(guān)的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus associated disease, PCVD)。感染PCV2的豬可導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)損傷和免疫缺陷，引起機(jī)體抵抗力下降，使感染豬對(duì)其他病原的易感性增高，造成多種疾病的并發(fā)或繼發(fā)感染，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005]2、豬圓環(huán)病毒 2 型(porcine circovirus type 2, PCV2)疫苗研究現(xiàn)狀:
PCV2每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但是尚無有效的治療方法，而疫苗免疫是控制該病的有效途徑，國內(nèi)外研究者都在該病的疫苗研制上投入了大量工作，但由于病毒增殖緩慢、無CPE出現(xiàn)，PCVl和PCV2往往混合存在，因此其分離培養(yǎng)較困難，難以大量獲得純病毒，造成了全病毒苗難以開發(fā)。而新型亞單位疫苗因結(jié)構(gòu)單一，不用病毒培養(yǎng)而具有成本低、靶向明確和安全穩(wěn)定的特點(diǎn)成為當(dāng)前PCV疫苗研究的重點(diǎn)。PCV2的0RF2基因編碼的Cap蛋白具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物后能產(chǎn)生較好的中和抗體，證明了其應(yīng)用于亞單位疫苗研制的價(jià)值。國外學(xué)者把0RF2片段插入到昆蟲桿狀病毒中，研制了具有免疫原性的重組蛋白苗，目前已投入使用，但是由于其工藝要求高，相應(yīng)的佐劑昂貴，在我國難以推廣使用。目前，國內(nèi)已有商品化PCV2全病毒滅活疫苗上市，申請(qǐng)?zhí)?ZL200810024423.1)。但滅活疫苗所提供的免疫力較弱，為完成全程免疫，需要進(jìn)行多次接種，免疫劑量大，生產(chǎn)成本高；而且滅活疫苗中含有大量非保護(hù)性抗原成分，副作用較大并存在病毒滅活不充分帶來的風(fēng)險(xiǎn)。而國外已有4種PCV疫苗投入使用，兩種滅活苗和兩種重組苗，梅里亞和英特威的需要免疫兩次，柏林格和富道的需要免疫一次，但目前為止，僅柏林格在中國成功注冊(cè)銷售，價(jià)格為每頭份30元，部分豬還需要加強(qiáng)免疫一次，所以其昂貴的價(jià)格大大增加了養(yǎng)豬成本，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。美國聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司已開展PCV2亞單位疫苗的研究，在多個(gè)實(shí)施方案中，此肽抗原包括衣殼蛋白從約第47位氨基酸至第202位氨基酸的氨基酸。選擇的肽鏈較長，合成成本較高，且尚屬于研究初級(jí)階段，申請(qǐng)的專利尚未授權(quán)(專利受理號(hào)201080068977.7)。
[0006]表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，正確而詳細(xì)地繪制蛋白質(zhì)表位圖譜(包括抗原限制成分位)對(duì)疾病的診斷及預(yù)后判定、設(shè)計(jì)疫苗分子結(jié)構(gòu)及免疫干預(yù)治療等至關(guān)重要。根據(jù)B細(xì)胞表位的特征，先預(yù)測(cè)抗原表位，再合成肽段，在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證，是一種省時(shí)、省力和經(jīng)濟(jì)的方法。目前，口蹄疫作為第一個(gè)獸用多肽疫苗已批準(zhǔn)上市，開始廣泛應(yīng)用，并取得了較好的免疫效果，顯示了多肽疫苗在動(dòng)物疫病的防控方面具有極大的潛力。PCV2每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但是尚無有效的治療方法，而疫苗免疫是控制該病的有效途徑，國內(nèi)外研究者都在該病的疫苗研制上投入了大量工作，但由于病毒增殖緩慢、無CPE (細(xì)胞病變)出現(xiàn)，PCVl和PCV2往往混合存在，因此其分離培養(yǎng)較困難，難以大量獲得純病毒，造成了全病毒苗難以開發(fā)。而新型亞單位疫苗因結(jié)構(gòu)單一，不用病毒培養(yǎng)而具有成本低、靶向明確和安全穩(wěn)定的特點(diǎn)成為當(dāng)前PCV疫苗研究的重點(diǎn)。PCV2的0RF2基因編碼的Cap蛋白具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物后能產(chǎn)生較好的中和抗體，證明了其應(yīng)用于亞單位疫苗研制的價(jià)值。國外學(xué)者把0RF2片段插入到昆蟲桿狀病毒中，研制了具有免疫原性的重組蛋白苗，目前已投入使用，但是由于其工藝要求高，相應(yīng)的佐劑昂貴，在我國難以推廣使用。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)目前 國產(chǎn)上市的全病毒滅活疫苗有一定的保護(hù)作用，但副作用大、安全性差的問題，以及進(jìn)口的重組亞單位疫苗和嵌合病毒滅活疫苗，免疫原性較好、但價(jià)格昂貴的問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有價(jià)廉、安全、特異性強(qiáng)、容易保存和應(yīng)用安全的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)表位肽疫苗。
[0009]本發(fā)明還提供所述豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)表位肽疫苗的制備方法。
[0010]實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗，其特征在于，該疫苗含有三種B細(xì)胞表位，其賴氨酸為核心基質(zhì)構(gòu)建表位單體相同的四分支肽，并串聯(lián)一個(gè)通用T輔助細(xì)胞(Th)表位，分子量為13 kDa，該表位肽命名為PCV CP98_156_228 ;
所述三種B細(xì)胞表位具體氨基酸序列如下:B98 IRKVKV7B156 YHSRYFT, B228 DPPLNP ； 所述表位肽結(jié)構(gòu)如下:
IRKVKVGGG'fHSRYFTGGGDPPLNP ,
lRKVVWi3GGYHSRYFTOGGDPPLNP ,."
lRKVKVi3GGYHSRYFTGGGDPPLNP \ ,> K"KKJ SlSElKGVfVHKlEGlLf





丨."
tRKVKV6i3GYHSRYfT6GGDPPLNP ,
進(jìn)一步，所述豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗的制備方法，包括如下步驟:
O表位肽的預(yù)測(cè)、篩選:選用PCV2b (國內(nèi)90%PMWS豬群均因PCV2b感染)CAP蛋白作為候選抗原，對(duì)其氨基酸序列采用BcePred和DNAStar軟件進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)；結(jié)合PCV2b CAP B細(xì)胞表位，篩選出3種抗原指數(shù)較高的表位，即98-103aa(命名為B98)，156_162aa(命名為B156)，228-233aa(命名為B228) ;3種表位具體氨基酸序列如下:B98 IRKVKVjB156 YHSRYFT, B228DPPLNP ；
2)表位肽疫苗的設(shè)計(jì):
以步驟I)所選序列為基礎(chǔ)，賴氨酸為核心基質(zhì)構(gòu)建表位單體相同的四分支肽，同時(shí)串聯(lián)一個(gè)通用型Th表位，該表位肽命名為PCVCP98_156_228，結(jié)構(gòu)式如上；
3)多肽的合成、純化及鑒定:
用多功能多肽合成儀分別合成表位肽PCV CP98_156_228，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜(MS)檢測(cè)，高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)純度；
4)表位肽疫苗的制備:
首先，將上述步驟3)合成的表位肽PCV 0?98_156_228用0.01M，pH7.4 PBS (磷酸鹽緩沖液)稀釋到100ug/ml,過濾,制得水相；
然后，選擇油乳劑在121°C下滅菌15min得到油相；所述油乳劑為Span-80, Tween-80或Arlacel-80中的一種；
再之，在乳化器中加入油相，在80-100r/min下攪拌2min后，加入同等質(zhì)量的水相采用8500r/min的速度攪拌6min，制得油包水乳劑；
最后，將所得油包水乳劑在無菌條件下定量分裝，得豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗成品。
[0011]進(jìn)一步，步驟3)中，(I)表位肽的合成具體步驟為:
①選擇RinkAmide-AM Resin樹脂作為載體,與表位肽C段氨基酸相連接,合成方向是C端向N端延伸；
②將步驟①中與樹脂載體相連的氨基酸脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，裸露出活性氨基，與下一個(gè)氨基酸相連接；
③游離出的COOH(保護(hù)氨基酸原料中本身存在的)進(jìn)行活化后與步驟②中的裸露氨基相交聯(lián)；
④將步驟②步驟③循環(huán)進(jìn)行，直至指定表位肽序列合成片段為全保護(hù)的KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂，再連接下一個(gè)氨基酸原料Fmoc-Lys (Dde) -OH,形成Fmoc-Lys (Dde) - KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂；
⑤用20%哌啶脫除步驟④得到的表位肽中的Fmoc基團(tuán)，用含2%水合肼的DMF脫除其Dde基團(tuán)，得到主鏈和側(cè)鏈氨基；
游離的氨基與下一個(gè)Fmoc-Lys (Dde) -OH的C端羧基進(jìn)行偶聯(lián)；
⑥偶聯(lián)完畢后，重復(fù)脫除Fmoc和Dde的步驟，得到全保護(hù)的肽樹脂；
⑦加入保護(hù)性氨基酸，進(jìn)入“偶聯(lián)-去保護(hù)-偶聯(lián)”循環(huán)步驟，得到最終的全保護(hù)多肽；
⑧將多肽從載體上洗脫下來，三氟乙酸(TFA)脫除保護(hù)基；
⑨以乙醚將多肽從TFA中析出，清洗，形成固體相粗品表位肽；
(2)表位肽的純化、鑒定:
①將步驟(1)，即上面的整個(gè)反應(yīng)步驟①-⑨，得到的粗表位肽進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，并采用反相液相色譜進(jìn)行純化；②將質(zhì)譜與反相液相色譜聯(lián)合使用，對(duì)粗表位肽進(jìn)行純化；
③將液相色譜中純化的目標(biāo)峰放置于凍干機(jī)中凍干；
④凍干后的產(chǎn)品再次采用質(zhì)譜檢測(cè)確認(rèn)是否正確，用液相色譜進(jìn)行純度檢測(cè)。
[0012]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗，包含有三種B細(xì)胞表位，用MAP (Multipleantigenic peptide system,多重抗原肽結(jié)構(gòu))連接4個(gè)分支，并串聯(lián)有一個(gè)通用性Th表位，分子量為13 kDa，使用固相自動(dòng)肽合成儀化學(xué)合成表位肽。PCV2表位肽疫苗主要由I份多肽和1份弗氏佐劑組成。該疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高效價(jià)的病毒中和性抗體。本發(fā)明的表位肽疫苗具有價(jià)廉、安全、特異性強(qiáng)、容易保存和應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，將在防控豬圓環(huán)病毒病發(fā)揮重要作用。
[0013]2、由于PCV2 0RF2編碼的CAP蛋白，是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有較好的免疫原性，PCV2 CAP蛋白免疫動(dòng)物后能產(chǎn)生較好的中和抗體，所以本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗以PCV2 CAP蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用Kyte- Doolittle的親水性方案，Emini方案,Karplus方案和Jameson-wolf抗原指數(shù)方案，輔以對(duì)CAP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域分析，并結(jié)合吳玉章氨基酸抗原指數(shù)計(jì)算方法預(yù)測(cè)CAP蛋白的B細(xì)胞表位，其預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性高。[0014]3、本發(fā)明方法通過表位肽的預(yù)測(cè)、篩選，表位肽疫苗的設(shè)計(jì)，多肽的合成、純化及鑒定，以及表位肽疫苗的制備四個(gè)步驟制備出一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)表位肽疫苗，該方法原料易得、成本較低、容易控制，具有較好的操作性，適應(yīng)推廣應(yīng)用。
[0015]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗中MAP結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖2為本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗PCV2 CAP蛋白的氨基酸序列。
[0018]圖3為圖2中CAP蛋白的親水性分析，按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)分析PCV2病毒CAP蛋白分子的親水性區(qū)域。
[0019]圖4為圖2中CAP蛋白的表面可能性區(qū)域，按Emini方案預(yù)測(cè)CAP蛋白氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)的表面可能性。
[0020]圖5為圖2中CAP蛋白的抗原指數(shù)，按Jameson-wolf方案預(yù)測(cè)CAP蛋白序列中抗原指數(shù)較高的區(qū)段。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0023]一、豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)與分析:
PCV2 0RF2是編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白-Cap蛋白的基因，該蛋白具有良好的抗原性，可引起感染豬產(chǎn)生很高的抗體水平，可以作為疫苗候選抗原。本發(fā)明選用PCV2b (國內(nèi)90%PMWS豬群均因PCV2b感染)CAP蛋白作為候選抗原，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分析。[0024]PCV2 CAP蛋白的氨基酸序如下(由基因組序列推導(dǎo))共有233個(gè)氨基酸殘基，檢索自 GenBank,序列編號(hào)為 AAF35305.1。
[0025]I MTYPRRRYRR RRHRPRSHLG QILRRRPffLV HPRHRVRffRR KNGIFNTRLS RTFGVTVKRT
61 TVRTPSffAVD MMRFNINDFL PPGGGSNPRS VPFEYYRIRK VKVEFffPCSP ITQQDRQVQS
121 SAVILDDNFV TKATALTYDP YVNYSSRHTI TQPFSYHSRY FTPKPVLDST IDYFQPNNKR
181 NQLffLRLQTA GNVDHVGLGT AFENSIYDQE YNIRVTMYYQ FREFNFKDPP LNP
基于PCV2 CAP蛋白的氨基酸序列，按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)分析PCV2病毒CAP蛋白分子的親水性區(qū)域，預(yù)測(cè)結(jié)果見圖1。按Emini方案預(yù)測(cè)CAP蛋白氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)的表面可能性，預(yù)測(cè)結(jié)果見圖2。以及按Jameson-wolf方案預(yù)測(cè)CAP蛋白序列中抗原指數(shù)較高的區(qū)段，預(yù)測(cè)結(jié)果圖3。經(jīng)抗原指數(shù)，親水性指數(shù)和蛋白質(zhì)表面可能性指數(shù)篩選出的氨基酸區(qū)段中(抗原指數(shù)> 0，親水性指數(shù)> O,以及氨基酸的表面可能性指數(shù)^ I)，如果其內(nèi)部或附近具有柔性結(jié)構(gòu)，則較有可能是B細(xì)胞表位。綜合分析以上預(yù)測(cè)結(jié)果，CAP蛋白較有可能為B細(xì)胞表位的區(qū)段位于N端第4-18，23-28，32-41，57-64，85-90，96-103，156-163，175-182，205-212 區(qū)段和第 224-233 區(qū)段。結(jié)果參見表 I。
[0026]表1 PCV2 CAP蛋白的B細(xì)胞表位區(qū)域的平均抗原性指數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗，其特征在于，該疫苗含有三種B細(xì)胞表位，其賴氨酸為核心基質(zhì)構(gòu)建表位單體相同的四分支肽，并串聯(lián)一個(gè)通用T輔助細(xì)胞(Th)表位，分子量為13 kDa，該表位肽命名為PCV CP98_156_228 ； 所述三種B細(xì)胞表位具體氨基酸序列如下:B98 IRKVKV7B156 YHSRYFT，B228 DPPLNP ； 所述表位肽結(jié)構(gòu)如下:
2.如權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: O表位肽的預(yù)測(cè)、篩選: 選用PCV2b CAP蛋白作為候選抗原，對(duì)其氨基酸序列采用BcePred和DNAStar軟件進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)；結(jié)合PCV2b CAP B細(xì)胞表位，篩選出3種抗原指數(shù)較高的表位，即98-103aa(命名為 B98), 1 56_162aa(命名為 B156)，228_233aa (命名為 B228) ;3 種表位具體氨基酸序列如下:B98 IRKVKV, B156 YHSRYFT, B228 DPPLNP ； 2)表位肽疫苗的設(shè)計(jì): 以步驟I)所選序列為基礎(chǔ)，賴氨酸為核心基質(zhì)構(gòu)建表位單體相同的四分支肽，同時(shí)串聯(lián)一個(gè)通用型Th表位，該表位肽命名為PCVCP98_156_228，結(jié)構(gòu)式如上； 3)多肽的合成、純化及鑒定: 用多功能多肽合成儀分別合成表位肽PCV CP98_156_228，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，高效液相色譜檢測(cè)純度； 4)表位肽疫苗的制備: 首先，將上述步驟3)合成的表位肽PCV CP98_156_228用0.01M, pH7.4 PBS稀釋到IOOug/ml，過濾，制得水相； 然后，選擇油乳劑在121°C下滅菌15min得到油相；所述油乳劑為Span-80, Tween-80或Arlacel-80中的一種； 再之，在乳化器中加入油相，在80-100r/min下攪拌2min后，加入同等質(zhì)量的水相采用8500r/min的速度攪拌6min，制得油包水乳劑； 最后，將所得油包水乳劑在無菌條件下定量分裝，得豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒2型表位肽疫苗的制備方法，其特征在于，步驟3)中，(I)表位肽的合成具體步驟為: ①選擇RinkAmide-AM Resin樹脂作為載體,與表位肽C段氨基酸相連接,合成方向是C端向N端延伸； ②將步驟①中與樹脂載體相連的氨基酸脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，裸露出活性氨基，與下一個(gè)氨基酸相連接；③游離出的COOH進(jìn)行活化后與步驟②中的裸露氨基相交聯(lián)； ④將步驟②步驟③循環(huán)進(jìn)行，直至指定表位肽序列合成片段為全保護(hù)的KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂，再連接下一個(gè)氨基酸原料Fmoc-Lys (Dde) -0H,形成Fmoc-Lys (Dde) - KKISISEIKGVIVHKIEGILF-樹脂； ⑤用20%哌啶脫除步驟④得到的表位肽中的Fmoc基團(tuán)，用含2%水合肼的DMF脫除其Dde基團(tuán)，得到主鏈和側(cè)鏈氨基； 游離的氨基與下一個(gè)Fmoc-Lys (Dde) -OH的C端羧基進(jìn)行偶聯(lián)； ⑥偶聯(lián)完畢后，重復(fù)脫除Fmoc和Dde的步驟，得到全保護(hù)的肽樹脂； ⑦加入保護(hù)性氨基酸，進(jìn)入“偶聯(lián)-去保護(hù)-偶聯(lián)”循環(huán)步驟，得到最終的全保護(hù)多肽； ⑧將多肽從載體上洗脫下來，三氟乙酸(TFA)脫除保護(hù)基； ⑨以乙醚將多肽從TFA中析出，清洗，形成固體相粗品表位肽； (2)表位肽的純化、鑒定: ①將步驟(1)，即上面的整個(gè)反應(yīng)步驟①-⑨，得到的粗表位肽進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，并采用反相液相色譜進(jìn)行純化； ②將質(zhì)譜與反相液相色譜聯(lián)合使用，對(duì)粗表位肽進(jìn)行純化； ③將液相色譜中純化的目標(biāo)峰放置于凍干機(jī)中凍干； ④凍干后的產(chǎn)品再次采用質(zhì)譜檢測(cè)確認(rèn)是否正確，用液相色譜進(jìn)行純度檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C07K1/04GK103536912SQ201310457212
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】吳勝昔, 吳玉章, 曾政, 熊仲良, 蔡家利, 梁望旺, 藺露, 董春霞 申請(qǐng)人:重慶理工大學(xué), 中國人民解放軍免疫學(xué)研究所, 重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心