一種長效重組人促卵泡激素融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長效重組人促卵泡激素融合蛋白(Human?follicle-stimulating?hormone-Fc?fusion?protein，簡稱hFSH-Fc)及其制備方法，該重組hFSH-Fc蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包括hFSHβ亞基、CTP、hFSHα亞基、柔性肽接頭和人IgG2Fc變體，其體內(nèi)半衰期比現(xiàn)有人促卵泡激素更長，副作用更小。本發(fā)明還涉及重組hFSH-Fc融合蛋白組合物在制備治療和/或預(yù)防不孕不育癥的藥物中的用途。
【專利說明】一種長效重組人促卵泡激素融合蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種長效重組人促卵泡激素融合蛋白、其制備方法及應(yīng)用。該融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，其療效優(yōu)于現(xiàn)有的人促卵泡激素。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，世界范圍內(nèi)不孕癥率高達(dá)15%，成為繼癌癥和心腦血管疾病之外，嚴(yán)重影響人類健康的第三大疾病。我國不孕癥人數(shù)占生殖婦女人數(shù)10%以上，且其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。人促卵泡素(Human follicle-stimulating hormone,簡稱hFSH)是目前市場常見的用于治療男女不孕癥藥物的主要成份，我國目前市場包括人尿來源的FSH藥物和重組FSH。
[0003]尿源hFSH存在病毒污染、原料來源有限、采集困難、含量低及純化過程復(fù)雜等問題，歐美等發(fā)達(dá)國家普遍不接受尿源產(chǎn)品上市和銷售。相比而言，重組hFSH在其純度、抗原性、安全性、無病毒感染等方面具有尿源hFSH無法比擬的優(yōu)點。hFSH是一種糖基化蛋白，SDS-PAGE檢測其分子量為43KD。作為一種治療藥物，保證其生物活性，必要的條件是具有正確的三維結(jié)構(gòu)和糖基化修飾。具有完善翻譯后修飾功能是哺乳動物細(xì)胞被選作大多數(shù)生物藥蛋白表達(dá)宿主的主因。其中，中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO)是用于真核生物外源基因表達(dá)最為成功的宿主細(xì)胞，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達(dá)，很多藥物已投放市場，如ΕΡ0、G-CSF等。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點，如擁有完備的翻譯后加工過程，包括糖基化、羥基化，使表達(dá)的外源真核基因產(chǎn)物能夠保持其天然結(jié)構(gòu)及活性，且使表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分離純化。
[0004]雖然目前已有利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的重組藥物hFSH上市，但仍然存在如下問題:首先，其半衰期短，臨床上為了達(dá)到有效的治療效果，需要頻繁給藥，給患者帶來極大痛苦。例如，當(dāng)用于排卵時，患者必須每日1-2次肌肉內(nèi)或皮下注射hFSH，通常需要注射8-12天甚至更長時間。這種治療方案常伴有不良的副作用，包括對神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的刺激和毒副作用，并導(dǎo)致常見的并發(fā)癥如卵巢過度刺激綜合征，表現(xiàn)為卵巢增大、全身毛細(xì)血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重組hFSH表達(dá)量低，制備過程復(fù)雜和生產(chǎn)成本巨大。另外，hFSH是具有兩條單鏈(α鏈和β鏈)的糖基化蛋白，鏈間以非共價鍵連接，兩條鏈的正確折疊才能保證hFSH的生物活性。如何在蛋白表達(dá)和純化過程中保持兩條鏈的正常結(jié)合是一個挑戰(zhàn)。針對現(xiàn)有重組hFSH及同類產(chǎn)品的缺陷，本發(fā)明利用優(yōu)化的分子生物學(xué)技術(shù)、細(xì)胞生產(chǎn)和純化工藝開發(fā)新型的重組hFSH產(chǎn)品，以延長半衰期、保持其生物活性、提高重組hFSH蛋白表達(dá)水平，從而增加其藥效、降低副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種重組人促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulatinghormone-Fc fusion protein,簡稱hFSH-Fc)、其制備方法及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中重組hFSH表達(dá)量低、純化難、體內(nèi)半衰期短的問題。
[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種重組hFSH-Fc融合蛋白，該融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSHβ亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭(Linker，簡稱 L)和人 IgG2Fc 變體(vIgG2Fc)，如 SEQ ID NO:2 所示(hFSH β -CTP-hFSH a -L_vIgG2Fc氨基酸序列)，上述融合蛋白簡述為hFSH-Fc。
[0007]所述的hFSHP亞基的氨基酸序列去除了常規(guī)hFSHP亞基中的1_18位氨基酸殘基，如SEQ ID NO:5所示。
[0008]所述的CTP(carboxy_terminal peptide,羧基端肽)的氨基酸序列來自HCG β鏈羧基末端的28-34個氨基酸殘基，優(yōu)選CTP為來自HCG β鏈羧基末端的33個氨基酸殘基序列，如SEQ ID NO:4所示。
[0009]所述的hFSHa亞基的氨基酸殘基序列去除了常規(guī)hFSH a亞基中的1_24位氨基酸殘基，如SEQ ID N0:3所示。
[0010]所述的肽接頭含有2-20個氨基酸殘基，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基，優(yōu)選的肽接頭氨基酸序列為
[0011]GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
[0012]所述的人IgG2Fc變體為含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
[0013]以下具體介紹本發(fā)明的人IgG Fe變體、肽接頭和CTP功能:
[0014]IgG Fe 變體
[0015]IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，它們的半衰期可高達(dá)21天，而Fe片段是IgG保持體內(nèi)較長半衰期的主要原因，同時具有穩(wěn)定蛋白的作用。
[0016]Fe來自免疫球蛋白的Fe區(qū)域，F(xiàn)e在消滅病原體的免疫防御中具有重要作用。IgG的效應(yīng)子功能由Fe介導(dǎo)，通過兩種主要機制:(I)與細(xì)胞表面Fe受體(FcyRs)的結(jié)合，通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補體成分Cl的Clq部分的結(jié)合，引發(fā)依賴于補體的細(xì)胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)中，人IgG2與Fe Y Rs幾乎不結(jié)合，而和Clq的結(jié)合作用很弱。對于人的醫(yī)療用途而言，重組融合蛋白的Fe區(qū)域必須不能介導(dǎo)不良效應(yīng)子功能，從而才不會裂解或除去這些細(xì)胞。因此，hFSH-Fc的Fe區(qū)域必須是非裂解性的，即在結(jié)合Fe Y Rs和Clq而觸發(fā)效應(yīng)子功能方面，F(xiàn)e最好是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產(chǎn)生hFSH-L-Fc重組二聚化蛋白。為了得到非裂解性的Fe，必須使天然Fe區(qū)域中的一些氨基酸突變，以減少其效應(yīng)子功能。
[0017]通過分析IgG同種型的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CH2區(qū)域氨基末端附近的Fe部分顯示在IgG Fe與Fe Y Rs的結(jié)合中起作用，而與Clq結(jié)合至關(guān)重要的部分位于人IgG的CH2區(qū)域羧基端附近。人IgG2不結(jié)合Fe Y Rs,但與Clq存在較弱結(jié)合,為了最大化減少Fe與Clq的結(jié)合而介導(dǎo)的細(xì)胞毒性⑶C活性，本發(fā)明使用人IgG2Fc變體(vIgG2Fc):含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如圖1)，該Fe變體比天然IgG2Fc表現(xiàn)出最小化的效應(yīng)子功能，更適于制備重組hFSH-Fc融合蛋白。
[0018]肽接頭
[0019]連接肽的長度對重組二聚化蛋白的活性非常重要。已有人報道了促紅細(xì)胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，與EPO單體相比，含有2個完整的EPO區(qū)域(相隔3到7個氨基酸肽接頭)的重組二聚化蛋白表現(xiàn)出減弱的活性(參見Qiu H等，J Biol Chem,273:11173-11176，1998)。然而，當(dāng)這兩個EPO區(qū)域間的肽接頭的長度為17個氨基酸時，二聚體EPO分子的體外和體內(nèi)生物活性明顯提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem, 274:24773-24778，1999 ;美國專利N0.6，187，564)。這可能解釋為重組二聚化蛋白兩部分間增加的連接肽，使該分子的兩部分能分別行使其功能(參見Ashkenazi A等，Curr Opin inImmunol,9:195-200,1997)。
[0020]本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，首次設(shè)計了一種獨特的絞鏈區(qū)肽接頭來降低空間位阻效應(yīng)，可以制得hFSH α鏈的C端與Fe變體偶聯(lián)的重組二聚化蛋白，中間有柔軟的肽接頭。此重組二聚化蛋白不僅不會導(dǎo)致hFSH的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高h(yuǎn)FSH-Fc重組二聚化蛋白的生物活性。優(yōu)選肽接頭的氨基酸殘基序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
[0021]CTP
[0022]糖基化對于蛋白的活性和半衰期有重要作用，蛋白上的糖基化位點有兩類，包括O-糖肽鏈和N-糖肽鏈。CTP是一段來自HCG β鍵羧基末端的28-34個氨基酸殘基，有文獻報道HCG較hFSH相對長的半衰期，主要來源于此CTP肽段。它含有O-連接的糖基化位點，可以增加蛋白的糖基化水平，提高蛋白的活性和延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。
[0023]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白具有以下特征:該重組融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSH β亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭和人IgG2Fc變體。人IgG2Fc變體具有延長體內(nèi)半衰期和穩(wěn)定蛋白的作用，F(xiàn)e變體是非裂解性的，可最大化減少與Fe Y Rs和Clq結(jié)合而觸發(fā)的效應(yīng)子功能，有效抑制細(xì)胞毒性ADCC和⑶C途徑，從而降低細(xì)胞毒副作用 。CTP可提高蛋白活性及延長體內(nèi)半衰期，其無免疫原性，通過CTP連接hFSH的a鏈和β鏈，不僅無副作用，且可以使兩條鏈之間有一定的位阻，有利于其正確折疊而不影響功能。通過柔軟的肽接頭進行hFSHa鏈的C端與Fe變體的偶聯(lián)，能夠維持、甚至提高重組hFSH-Fc融合蛋白的生物活性。
[0024]本發(fā)明首次將CTP、肽接頭和人IgG2Fc變體有序地連接到hFSH中而形成新型的重組hFSH-Fc融合蛋白，該融合蛋白中人IgG2Fc變體、CTP和肽接頭的位置排列能維持hFSH正確的空間構(gòu)型，而不影響其生物活性，并可顯著延長半衰期，臨床應(yīng)用時可減少注射頻率，降低現(xiàn)有治療方案中產(chǎn)生的毒副作用。
[0025]本發(fā)明另一個目的是提供一種重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，該制備方法包括:
[0026](I)構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達(dá)載體；
[0027](2)重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)；
[0028](3)高密度細(xì)胞培養(yǎng)重組hFSH-Fc融合蛋白；
[0029](4)重組hFSH-Fc融合蛋白的純化制備。
[0030]具體來說，構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc蛋白的基因表達(dá)載體步驟為:采用人工合成方法獲得編碼重組hFSH-Fc融合蛋白基因進行了密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(如SEQID NO:1所示)，插入到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，獲得含有hFSH-Fc目的基因表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-hFSH-Fc (圖4)。基因的核苷酸序列優(yōu)化是基于哺乳動物宿主細(xì)胞偏愛的密碼子來選擇設(shè)計。[0031]所述的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體可采用市售的但不限于，如:p⑶NA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體，優(yōu)選，pCDNA3。
[0032]重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)步驟為:將含有hFSH-Fc蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到合適的哺乳動物宿主細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
[0033]所述的哺乳動物宿主細(xì)胞包括CH0、HEK293、C0S、BHK、NS0和Sp2/0細(xì)胞。優(yōu)選，CHO細(xì)胞；更優(yōu)選，已馴化適應(yīng)無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的DHFR(Dihydrofolate Reductase,二氫葉酸還原酶)缺陷型CHO細(xì)胞(簡稱CHO DHFR-)。
[0034]所述的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔轉(zhuǎn)染法。 [0035]所述的篩選方法是先利用篩選標(biāo)記進行篩選，然后用擴增選擇性標(biāo)記可提高表達(dá)量并獲得穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株。篩選標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一個合適的選擇性抗性標(biāo)記，如ZEO (Zeocin,博來霉素)、G418 (氨基糖苷類抗生素)、PUR(puromycin,嘌呤霉素)、HYP(Hygromycin,潮霉素)，優(yōu)選的抗性基因為ZEO ;篩選標(biāo)記也可為本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一個突光標(biāo)記基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein,綠色突光蛋白)、RFP (RedFluorescent Protein,紅色突光蛋白)，優(yōu)選的突光標(biāo)記基因為GFP。擴增選擇性標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase,谷氨酰胺合成酶)序列，優(yōu)選的擴增選擇性基因是DHFR。由于CHO-DHFR-細(xì)胞自身缺失二氫葉酸還原酶(DHFR)，無法自身合成四氫葉酸,所以必須在添加了次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸腺喃唳(Thymidine)和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。而通過目的基因與DHFR基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不合上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長的細(xì)胞克隆，更為重要的是由于DHFR可被葉酸類似物MTX (Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，DHFR基因必須擴增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細(xì)胞系；又由于與DHFR基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細(xì)胞染色體上的同一區(qū)域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴增而擴增，可得到大量表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞克隆。
[0036]高密度細(xì)胞培養(yǎng)重組hFSH-Fc融合蛋白的步驟為:將上述篩選到的穩(wěn)定細(xì)胞株轉(zhuǎn)入搖瓶或生物反應(yīng)罐進行大規(guī)模培養(yǎng)，特別是，本發(fā)明通過對細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得高表達(dá)重組hFSH-Fc融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法可實現(xiàn)高密度細(xì)胞培養(yǎng)、重組蛋白質(zhì)量和產(chǎn)量提升、重組蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。
[0037]所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化包括降溫培養(yǎng)法，具體來說，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到I X IO7個/mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養(yǎng)直至表達(dá)產(chǎn)量不再增加。該方法可以提高表達(dá)蛋白的活力水平及重組蛋白的累積產(chǎn)量。
[0038]所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法還包括在培養(yǎng)基中加入特殊的添加劑，優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mM ManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。該方法可使重組hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20 %。
[0039]重組hFSH-Fc融合蛋白的純化制備步驟為:
[0040]DProtein A親和層析:離心,收集上清,根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性,利用親和Protein A柱層析。
[0041]2)疏水層析柱純化:采用疏水層析柱，根據(jù)重組hFSH-Fc融合蛋白的疏水性不同，進一步去除上述Protein A純化后目標(biāo)蛋白中的雜質(zhì)。
[0042]所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B, Phenyl Sepharose CL-4B。優(yōu)選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
[0043]本發(fā)明所公開的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，表達(dá)產(chǎn)量高且因與IgG2Fc變體的偶聯(lián)，所形成的重組蛋白可以通過Protein A親和層析得到高效便捷的純化。經(jīng)疏水層析進一步純化后得到的融合蛋白純度達(dá)到98%以上。此外，本發(fā)明所公布的重組hFSH-Fc融合蛋白中α鏈和β鏈可正確折疊在一起，避免了 α-α 二聚體、β-β 二聚體的出現(xiàn)，大大簡化了純化步驟，降低了生產(chǎn)成本。
[0044]本發(fā)明的還一個目的是提供了一種含有重組hFSH-Fc融合蛋白的藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發(fā)明所述的重組hFSH-Fc融合蛋白。
[0045]具體來說，所述的藥物組合物含有有效量(如0.000001-90wt % ;較佳的0.l-50wt% ;更佳的，5-40wt% )的本發(fā)明的重組長效hFSH-Fc融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將有效量的本發(fā)明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH 通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。
[0046]所述的藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于):蔗糖、甘露醇、吐溫20 (Tween20)、蛋氨酸、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、及其組合物。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0047]本發(fā)明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于:所述的融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。
[0048]本發(fā)明的再一個目的是重組hFSH-Fc融合蛋白在治療和/或預(yù)防人不孕不育癥中的應(yīng)用。
[0049]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，從而改善了藥物動力學(xué)和藥效，與現(xiàn)有hFSH比較，在臨床應(yīng)用上可減少患者注射次數(shù)，降低副作用，減輕患者痛苦和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
[0050]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白及其制備方法的優(yōu)點概括如下:
[0051]1、本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白是由CTP、肽接頭和人IgG2Fc變體(vIgG2Fc)與hFSH有序偶聯(lián)形成的新型融合蛋白，維持了 hFSH的正確空間構(gòu)型，可顯著延長蛋白的體內(nèi)半衰期，大大提高h(yuǎn)FSH在CHO細(xì)胞中的表達(dá)量，且其體外和體內(nèi)活性與現(xiàn)有天然hFSH類似。
[0052]2、二聚化單鏈hFSH-Fc融合蛋白的α鏈與β鏈以共價鍵正確折疊，避免形成α-α 二聚體和β-β 二聚體，大大簡化了純化工藝，降低生產(chǎn)成本。
[0053]3、本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，其半衰期是現(xiàn)有重組hFSH的4倍以上，在臨床應(yīng)用上可減少患者注射次數(shù)，降低現(xiàn)有治療方案產(chǎn)生的副作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1.顯示了人IgG2及其變體的絞鏈區(qū)和CH2區(qū)域的氨基酸序列的比對。比較這三部分氨基酸序列:氨基酸區(qū)域228、234-237和330-331。其變體的氨基酸突變以粗斜體顯示。氨基酸殘基編號是根據(jù)EU編號體系標(biāo)定。
[0055]圖2.顯示了重組hFSH-Fc單鏈及二聚化結(jié)構(gòu)示意圖。a)單鏈hFSH-Fc ；b) 二聚化的 hFSH-Fc。
[0056]圖3.顯示了在pCDNA3表達(dá)載體內(nèi)HindII1-EcoRI片段的hFSH-Fc的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。重組hFSH-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導(dǎo)肽(1-18)、hFSHβ鏈、CTP、成熟hFSHa鏈、肽接頭、IgG2Fc變體(vIgG2Fc)。成熟的重組hFSH-Fc融合蛋白含有成熟 hFSH β 鏈(19-129)、CTP (130-162)、成熟 α 鏈(163-254)、肽接頭(255-270)和 IgG2Fc變體(vIgG2Fc) (271-493)。
[0057]圖4.顯示了所構(gòu)建編碼hFSH-Fc融合蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒圖譜。該表達(dá)質(zhì)粒全長9063bp，含有10個主要基因片斷，包括1.CMV啟動子；2.目標(biāo)基因hFSH-Fc ；3.1RES ；
4.Zeocin抗性篩選基因；5.BGH終止子；6.SV40啟動子-,1.DHFR擴增基因；8.SV40終止子；
9.氨節(jié)青霉素抗性基因(Ampicillin) ; 10.ColEl復(fù)制起點(Ori)。
[0058]圖5.顯示了在7L生物反應(yīng)器中重組hFSH-Fc細(xì)胞株表達(dá)分泌hFSH-Fc蛋白的累積趨勢曲線圖。
[0059]圖6.Western bloting結(jié)果顯示了重組hFSH-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中的成功表達(dá)。非還原膠，Lanel:尿來源的hFSH(約43kDa) ；Lane2:本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白(約 140kDa)。
[0060]圖7.顯示了單鏈和二聚化hFSH-Fc在還原條件和非還原條件下的10% SDS-PAGE電泳圖譜。a)非還原膠，二聚化hFSH-Fc (約140kDa) ；b)還原型膠，單鏈hFSH-Fc (約70kDa)。
[0061]圖8.顯示了本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白、重組hFSH和人尿hFSH在大鼠體內(nèi)的代謝曲線。
【具體實施方式】
[0062]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0063]實施例1.構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達(dá)載體
[0064]基因序列設(shè)計是基于CHO細(xì)胞偏愛密碼子進行優(yōu)化，采用人工合成的方法合成經(jīng)過優(yōu)化的含有編碼hFSH蛋 白β鏈的信號肽及其成熟肽段、CTP和hFSHa鏈成熟肽段的融合基因，將所合成的756bp DNA片段插入轉(zhuǎn)移載體如PUC57中的EcoRV限制性酶切位點間，獲得了 hFSH質(zhì)粒(phFSH)，使用DNA測序方法驗證插入序列的正確性。
[0065]分別人工合成含有BamHI (5’端)和EcoRI (3’端)酶切位點的編碼柔性肽接頭(Linker，簡稱“L”)和人IgG2Fc變體(vIgG2Fc)片段的融合基因L-vIgG2Fc。將獲得的融合基因片段分別插入到轉(zhuǎn)移載體如PUC19的BamHI和EcoRI位點間，得到含F(xiàn)e變體的質(zhì)粒pL_vIgG2Fc、。通過DNA測序驗證L_vIgG2Fc的基因序列。為制備hFSH_L_Fc融合基因,用限制性內(nèi)切酶SpeI和BamHI雙酶切phFSH質(zhì)粒，凝膠電泳后膠回收編碼hFSH蛋白β鏈的信號肽及其成熟肽段、CTP和hFSHa鏈成熟肽段的融合基因片段，經(jīng)純化的上述基因片段插入到pL-vIgG2Fc質(zhì)粒中肽接頭的5'-端，T4連接酶連接構(gòu)成phFSH-L_vIgG2Fc質(zhì)粒。所構(gòu)建的融合基因由hFSH β、CTP、hFSH α、肽接頭和Fe變體基因組成，其單鏈結(jié)構(gòu)如圖2a所示，二聚化結(jié)構(gòu)如圖2b所示。
[0066]限制性內(nèi)切酶Spel/EcoRI雙酶切phFSH-L_vIgG2Fc質(zhì)粒，DNA凝膠純化得到hFSH-L-vIgG2Fc片段。將純化好的hFSH-L-Fc片段插入到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒如P⑶NA3 (Invitrogen)的相應(yīng)酶切位點間，最終獲得含融合基因表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-hFSH-L-vIgG2Fc，簡稱為pCDNA3-hFSH_Fc質(zhì)粒，如圖4所示。該質(zhì)粒含哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源基因蛋白所需的啟動子CMV;該質(zhì)粒還含有兩種選擇性標(biāo)記基因，從而在細(xì)菌中可以具有氨芐青霉素抗性，在哺乳動物細(xì)胞中可以具有博來霉素(zeocin)抗性。此外，當(dāng)宿主細(xì)胞是DHFR基因表達(dá)缺陷型時，P⑶NA3表達(dá)載體所含有的小鼠的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在時，能共擴增pFSH-Fc融合基因和DHFR基因。
[0067]用CTP肽段連接hFSH的α鏈和3鏈，可便于兩條鏈正確折疊。通過肽接頭(較佳地為柔性接頭)進行hFSH和Fe片段的偶聯(lián)可提高蛋白的生物活性，對本發(fā)明而言，優(yōu)選的是長度為約20個或更少(但不能少于2個)氨基酸的肽接頭，當(dāng)然由I個氨基酸構(gòu)成的肽接頭也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，宜使用含有或由2個或更多選自以下氨基酸構(gòu)成的肽接頭:甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。本發(fā)明實施例的肽接頭含有Gly-Ser肽構(gòu)件，其氨基酸序列為 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0068]實施例2.重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)
[0069]將實施例1構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-hFSH-L-Fc轉(zhuǎn)染入DHFR酶缺陷型CHO宿主細(xì)胞(CH0-DHFR_)，圖2b顯示了重組二聚化hFSH-Fc融合蛋白的示意圖。采用電穿孔法進行轉(zhuǎn)染，使用 960 μ Fd 電容的Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA)，將其電場設(shè)置為250V，在比色杯內(nèi)的2~5 X IO7個細(xì)胞中加入10 μ g用PvuI線性化的質(zhì)粒DNA。在轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基改成含100 μ g/mL Zeocin抗性標(biāo)記基因的生長培養(yǎng)基，獲得經(jīng)抗性初篩的轉(zhuǎn)染子。采用westemblotting的方法,用抗hFSH抗體檢測hFSH-Fc的表達(dá)。利用DHFR擴增選擇性標(biāo)記基因提高重組二聚化蛋白的表達(dá)水平，為此在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，用DHFR基因共擴增轉(zhuǎn)染的重組二聚化蛋白基因。用極限稀釋法亞克隆能在高達(dá)ΙΟμΜ/mL MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子。對亞克隆細(xì)胞系的分泌率作進一步分析。篩選分泌水平超過約10 (較佳地約20) μ g/ΙΟ6 (即百萬)個細(xì)胞/24小時的細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定高表達(dá)重組hFSH-Fc融合蛋白的細(xì)胞株。
[0070]實施例3.重組hFSH-Fc融合蛋白的生產(chǎn)和純化
[0071]將實施例2得到的高產(chǎn)量細(xì)胞株，首先在培養(yǎng)皿中進行無血清馴化培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到搖瓶中進行懸浮馴化培養(yǎng)，馴化過程中同時進行培養(yǎng)基的篩選，加入不同的成分觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)、生長趨勢，以及表達(dá)產(chǎn)物的活性和唾液酸等生化指標(biāo)，優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)條件為:基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mM ManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)，該方法可使重組hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20%。馴化成功后，進行細(xì)胞擴增，擴增到足夠量，進行7L生物反應(yīng)器監(jiān)測培養(yǎng)，在細(xì)胞密度超過IXlO7個/mL時開始降溫至33°C培養(yǎng)，批次生長周期為20天。用Iml ProteinA柱層析對重組蛋白進行初步純化，測定重組hFSH-Fc融合蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，重組hFSH-L-vIgG2Fc細(xì)胞株表達(dá)的累積產(chǎn)量為1.87g/L(圖5)。
[0072]重組hFSH融合蛋白的純化包括以下步驟:
[0073]DProtein A親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和層析方法，將上清液加樣到磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)平衡的Protein A柱；待重組融合蛋白結(jié)合于ProteinA后，用PBS洗滌該柱，直至0D280值低于0.01，再用20mM pH為4.0的醋酸鈉緩沖液洗脫結(jié)合的重組FSH-Fc融合蛋白，最后用ρΗΙΟ.0的IM Tris-HCl緩沖液中和活性收集液。純化的hFSH-Fc蛋白純度可達(dá)到95%以上。
[0074]2)疏水柱層析:用超濾方法將上述protein A活性收集液更換為20mMTris-HCl-L5M NaCl (pH8.0)緩沖液，將該樣品加樣到用 2OmM Tris-HCl-1.5MNaCl (pH8.0)平衡過的phenyl_6Fast Flow柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mMTris-HCl-L 35M NaCl (ρΗ8.0)淋洗，最后用 20mM Tris-HCl-0.5M NaCl (ρΗ8.0)緩沖液洗脫。
[0075]Western bloting結(jié)果顯示了重組hFSH-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中的成功表達(dá)，如圖6所示，在非還原條件下SDS-PAGE膠電泳圖譜，人尿來源的hFSH(商業(yè)產(chǎn)品)和本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白分別在43kDa和140kDa顯示相對應(yīng)的目標(biāo)蛋白雜交條帶,驗證了本發(fā)明得到的重組hFSH融合蛋白中含有hFSH蛋白。圖7是純化的hFSH-Fc融合蛋白在還原和非還原條件下的SDS-PAGE膠電泳圖譜。結(jié)果顯示，純化的hFSH-Fc蛋白純度可達(dá)到98%以上，hFSH-Fc在還原條件下的分子量為非還原條件下分子量的50%。
[0076]實施例4.重組hFSH-Fc融合蛋白的體內(nèi)外活性測定
[0077]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白的體外活性(免疫原活性)采用B10CHECK (美國)公司生產(chǎn)的FSH酶免疫定量檢測試劑盒檢測，方法參考試劑盒說明書。體內(nèi)活性采用2010版《英國藥典》中的卵巢增重法進行檢測。蛋白質(zhì)含量測定使用LOWRY定量法。取HCG制劑，加0.1%白蛋白磷酸鹽緩沖液(pH7.2±0.2)溶液，制成含有70IU/mlHCG的供試品稀釋液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示量、重組hFSH、人尿hFSH和重組hFSH-Fc融合蛋白估計效價,用供試品稀釋液(PH7.2±0.2)將標(biāo)準(zhǔn)品、重組hFSH、人尿hFSH和重組hFSH-Fc融合蛋白配制成含F(xiàn)SH1.67IU/ml劑量的溶液。選用19~28日齡，年齡相差不得超過3日，體重相差不得超過10克的Wistar雌鼠，分為標(biāo)準(zhǔn)品、重組hFSH(商業(yè)產(chǎn)品)組、人尿hFSH組和重組hFSH-Fc組，每組6只動物。大鼠頸后皮下注射，每天注射兩次，每次注射體積為0.2ml，連續(xù)注射三天，每天在相同時間給藥。最后一次注射給藥24小時后，按照給藥順序采用脫白法處死動物，取卵巢，剝離吸干表面水分后稱重，記錄器官重量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品卵巢增重采用量反應(yīng)平行線法計算重組hFSH、人尿hFSH和重組hFSH-Fc的活性。測得重組hFSH-Fc融合蛋白、重組hFSH和人尿hFSH的體外活性分別為10105、9928和9321IU/ml，其體內(nèi)活性分別為10230、8190和9051IU/ml，結(jié)果表明，本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白具有體內(nèi)外生物學(xué)活性。
[0078]實施例5.重組hFSH-Fc融合蛋白的藥代動力學(xué)測定
[0079]分為重組hFSH-vIgG2Fc、人尿hFSH和重組hFSH給藥組，每組選用體重200_250g的雄性wistar大鼠5只，分別按15IU/kg給予皮下注射。重組hFSH組和人尿hFSH組在給藥后 l、2、3、4、6、8、12、36、56h 取血，重組 hFSH-Fc 組在給藥后 1、2、4、8、12、24、56、120、176、200、264、340h取血，3000rpm離心5min后，吸取血清，_20°C保存。采用ELISA試劑盒(BIOCHECK，美國)測定各時間點血漿中FSH免疫活性。使用PKSolver2.0軟件，通過統(tǒng)計矩法計算各組主要藥代動力學(xué)參數(shù)。各組藥代動力學(xué)曲線如圖8所示，半衰期結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，重組hFSH和人尿hFSH在大鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為11.35± 1.0h和
12.7 ±2.8h，而等劑量本發(fā)明重組hFSH-Fc融合蛋白的消除半衰期為47.24 ±13.92h，是重組hFSH和人尿FSH的4倍以上。
[0080]表1本發(fā)明重組hFSH-Fc的半衰期
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種重組hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSHP亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭和人IgG2Fc變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的hFSHP亞基的氨基酸序列是去除了常規(guī)hFSHii亞基中的1-18位氨基酸殘基之后的hFSHii SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；其中所述的CTP的氨基酸序列是來自HCG β鏈羧基末端的28-34個氨基酸殘基，優(yōu)選CTP為來自HCG β鏈羧基末端的33個氨基酸殘基序列，如SEQ ID NO:4所示；其中所述的hFSHa亞基的氨基酸殘基序列是去除了常規(guī)hFSHa亞基中的1_24位氨基酸殘基之后的hFSHa SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；其中所述的肽接頭含有2_20個氨基酸，所述肽接頭存在于hFSH a亞基和人IgG2Fc變體之間，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸，優(yōu)選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的人IgG2Fc變體為含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQID NO:1 所示。
6.—種權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其步驟包括: 1)構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達(dá)載體: 采用人工合成方法獲得編碼hFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，獲得含有hFSH-Fc融合蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒； 2)重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá): 將含有hFSH-Fc融合蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到哺乳動物宿主細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)hFSH-Fc蛋白的細(xì)胞株； 3)高密度細(xì)胞培養(yǎng)重組hFSH-Fc融合蛋白: 將上述篩選到的穩(wěn)定細(xì)胞株轉(zhuǎn)入搖瓶或細(xì)胞反應(yīng)罐進行大規(guī)模培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到I X IO7個/mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養(yǎng)直至表達(dá)產(chǎn)量不再增加； 4)重組hFSH-Fc融合蛋白的純化制備: a)ProteinA親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明融合蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和Protein A柱層析； b)疏水層析柱純化:經(jīng)疏水層析純化進一步去除上述ProteinA純化后目標(biāo)蛋白中的雜質(zhì)； 所述的疏水柱包括 Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B, Phenyl Sepharose CL-4B。優(yōu)選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟I)中所述的基因表達(dá)載體為 pCDNA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT 或 pCMV-DHFR，優(yōu)選，pCDNA3 ;其中步驟2)中所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔轉(zhuǎn)染方法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)融合，優(yōu)選，電穿孔轉(zhuǎn)染方法；所述的哺乳動物宿主細(xì)胞包括CH0，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0細(xì)胞，優(yōu)選，CHO細(xì)胞，更優(yōu)選，DHFR酶缺陷型CHO懸浮細(xì)胞(CHO DHFR-)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟3)中還包括在培養(yǎng)基中加入添加劑，優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mMManNAc (N-乙?；?D-氨基甘露糖)。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1-8任 意一項權(quán)利要求所述的重組hFSH-Fc融合蛋白。
10.權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白在制備治療不孕不育癥藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/22GK103539860SQ201310529896
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】侯永敏, 李強, 吳茂柏, 廖莎, 張玉杰, 徐楨琦 申請人:廣州優(yōu)聯(lián)康醫(yī)藥科技有限公司