一種簡易提取卵黃抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡易提取卵黃抗體的方法，所述的提取方法包括以下步驟：1）將蛋黃與蛋白分離；2）在上述的蛋黃中依次加入PBS緩沖液和氯仿，得混合液，將混合液在-15-25℃下冷凍3-8h后移至30-40℃下解凍，反復凍融三次以上；3）將上述反復凍融后的混合液放入37℃水浴鍋中水浴25-35min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；4）將上述的混勻液在2-8℃下靜置3-5h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。本發(fā)明的方法工藝簡單，易于操作，提取率高，成本低，適宜于工業(yè)化大量生產(chǎn)時使用。
【專利說明】一種簡易提取卵黃抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用禽蛋制備卵黃抗體的方法，尤其涉及一種簡易提取卵黃抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卵黃抗體是從免疫禽蛋中提取出的針對特定抗原的抗體，是一種具有較強免疫功能的蛋白質(zhì)，多為IgG。禽類免疫后在其卵黃中產(chǎn)生的大量高純IgG，其對某些禽類疫病具有明顯治療和緊急預防作用。[0003]目前提取卵黃抗體的方法有很多種:
1、酸化水提取法:將卵黃與純化水按一定比例混合后，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值，通過靜置離心收集上清液，來達到收集卵黃抗體的效果。但是這種方法收集的卵黃抗體含量較低，不能完全體現(xiàn)卵黃的真正抗體含量。而且需要用到4000-6000r/min離心，比較耗費財力物力。
[0004]2、聚乙二醇提取法:將卵黃與PBS緩沖液按一定比例混合后，加入一定比例的聚乙二醇粉末，然后靜置，10000r/min離心。聚乙二醇溶于水中不會發(fā)熱、升溫，不會引起蛋白質(zhì)變性，沉淀蛋白質(zhì)的時間較短且不影響離心處理，并有促進蛋白質(zhì)結(jié)晶的作用，但聚乙二醇易溶于水，目前尚沒有辦法去除，對畜禽的危害迄今也尚無確切定論。而且需要用到10000r/min離心,更耗費財力物力。
[0005]3、辛酸萃取法:向用酸化水法提取的IgY溶液中緩慢加入終濃度為1%的正辛酸，攪拌lOmin，放入冰箱中冷凍lOmin，抽濾得IgY溶液。該方法與聚乙二醇法相似，但辛酸在水中溶解度極低(0.062g/L)，因此在水溶性物質(zhì)中辛酸殘留量極微。但是這種方法需要冷凍抽濾，而且抗體含量不是很高。
[0006]4、普通氯仿提取法:將卵黃、生理鹽水、氯仿按一定的比例混勻后室溫放置30min,3000r/min離心20min,溶液分成3層，下層為有機溶劑，中間層為變性脂蛋白，上層為提取的IgY溶液。這種方法需要使用到離心機，而且不一定100%能分層，在室溫低下非常難析出大量的IgY溶液。
[0007]因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，選用一種即能分離出含有大量卵黃抗體又要工藝簡單能夠適于工業(yè)化生產(chǎn)的提取卵黃抗體的方法成了一個技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的為提供即能夠分離出含有大量卵黃抗體，又能適宜工業(yè)化生產(chǎn)的工藝簡單，節(jié)省人力物力的一種簡易提取卵黃抗體的方法。
[0009]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種簡易提取卵黃抗體的方法，所述的提取方法包括以下步驟:
1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)；
2)在上述的蛋黃中依次加入PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為0.5-3:0.5-2:1-2，將混合液在-15-25°C下冷凍3_8h后移至30_40°C下解凍，反復凍融二次以上；
3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴25-35min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；
4)將上述的混勻液在2-8°C下靜置3-5h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
[0010]優(yōu)選地，所述的提取方法包括以下步驟:
1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)；
2)在上述的蛋黃中依次加入PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為2:2:1，將混合液在-20°C下冷凍4h后移至35°C下解凍，反復凍融三次以上；
3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴30min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；
4)將上述的混勻液在4°C下靜置4h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
[0011]進一步，所述的PBS緩沖液的pH值為7.2-7.6。
[0012]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，通過在分離的蛋黃中依次加入PBS緩沖溶液和氯仿，經(jīng)過反復凍融、水浴和靜置步驟， 得到上清液即為含卵黃抗體的液體，不需經(jīng)過復雜的工藝，也不需要往蛋黃中加入難分離的成分，還不需要使用離心機等大型的設(shè)備，本發(fā)明的方法工藝簡單，易于操作，提取率高，成本低，適宜于工業(yè)化大量生產(chǎn)時使用。
【具體實施方式】
[0013]下面將結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明:
一種簡易提取卵黃抗體的方法，所述的提取方法包括以下步驟:
1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)；
2)在上述的蛋黃中依次加入PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為0.5-3:0.5-2:1-2，將混合液在-15-25°C下冷凍3_8h后移至30_40°C下解凍，反復凍融二次以上；
3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴25-35min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；
4)將上述的混勻液在2-8°C下靜置3-5h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
[0014]優(yōu)選地，所述的提取方法包括以下步驟:
1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)；
2)在上述的蛋黃中依次加入PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為2:2:1，將混合液在-20°C下冷凍4h后移至35°C下解凍，反復凍融三次以上；
3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴30min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；
4)將上述的混勻液在4°C下靜置4h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
[0015]進一步，所述的PBS緩沖液的pH值為7.2-7.6。[0016]實施例1
揚州康威的非免蛋進行檢查 提取卵黃抗體:
1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)；
2)在上述的蛋黃中依次加入pH值為7.2為PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為2:2:1，將混合液在-20°C下冷凍4h后移至35°C下解凍，反復凍融三次以上；
3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴30min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；
4)將上述的混勻液在4°C下靜置4h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
[0017]檢測:
用血凝抑制實驗檢測非免蛋雞新城疫病抗體，結(jié)果幾何平均值為2°_2，符合規(guī)定；用血凝抑制實驗檢測非免蛋雞流行性感冒病抗體，結(jié)果為全陰性符合規(guī)定，兩種檢測結(jié)果均與廠家報告一致。
[0018]實施例2
江蘇保康的非免蛋進 行檢查 提取卵黃抗體:
1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)；
2)在上述的蛋黃中依次加入pH值為7.4為PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為3:2: 2，將混合液在-15°C下冷凍8h后移至30°C下解凍，反復凍融三次以上；
3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴35min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；
4)將上述的混勻液在2°C下靜置3h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
[0019]檢測:
用血凝抑制實驗檢測非免蛋雞新城疫病抗體，結(jié)果幾何平均值為2°_4，符合規(guī)定；用血凝抑制實驗檢測非免蛋雞流行性感冒病抗體，結(jié)果為全陰性符合規(guī)定，兩種檢測結(jié)果均與廠家報告一致。
[0020]實施例3
取市場買的普通蛋進行檢查 提取卵黃抗體:
1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)；
2)在上述的蛋黃中依次加入pH值為7.6為PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為0.5:0.5:1.5，將混合液在-25°C下冷凍3h后移至40°C下解凍，反復凍融二次以上；
3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴25min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液；4)將上述的混勻液在8°C下靜置5h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
[0021]檢測: 用血凝抑制實驗檢測非免蛋雞新城疫病抗體，結(jié)果幾何平均值為28 ;用血凝抑制實驗檢測非免蛋雞流行性感冒病抗體，結(jié)果幾何平均值為25。上清液蛋白含量為1.03mg/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種簡易提取卵黃抗體的方法，其特征在于:所述的提取方法包括以下步驟: 1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)； 2)在上述的蛋黃中依次加入PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為0.5-3:0.5-2:1-2，將混合液在-15-25°C下冷凍3_8h后移至30_40°C下解凍，反復凍融二次以上； 3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴25-35min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液； 4)將上述的混勻液在2-8°C下靜置3-5h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡易提取卵黃抗體的方法，其特征在于:所述的提取方法包括以下步驟: 1)將蛋黃與蛋白分離，并將蛋黃置于容器內(nèi)； 2)在上述的蛋黃中依次加入PBS緩沖液和氯仿，得混合液，所述蛋黃、PBS緩沖液和氯仿的體積比為2:2:1，將混合液在-20°C下冷凍4h后移至35°C下解凍，反復凍融三次以上； 3)將上述反復凍融后的混合液放入37°C水浴鍋中水浴30min，水浴的過程中要輕輕搖動容器，使蛋黃、PBS緩沖液和氯仿進一步混合均勻得混勻液； 4)將上述的混勻液在4°C下靜置4h，混勻液分層，取得上層的上清液即為含卵黃抗體的液體。`
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種簡易提取卵黃抗體的方法，其特征在于:所述的PBS緩沖液的PH值為7.2-7.6。
【文檔編號】C07K16/02GK103554251SQ201310558667
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】陳景容, 賴道華, 陳晟生, 詹先強 申請人:福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司