抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽及其制備方法和用途，本發(fā)明的多肽包括多肽序列“SPHSG”為：YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL；或與該多肽序列同源性相似、功能相同的另一種多肽序列“MRSP”為：YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。本發(fā)明為該多肽在涂層球囊和涂層支架中的應用提供實驗依據(jù)。與傳統(tǒng)的涂層藥物相比，作為Mfn2自身的小片斷，該多肽不具有化學藥物的毒副作用和免疫原性，實用性也優(yōu)于雷帕霉素，因此具有很廣泛的應用前景和較大的臨床應用價值。
【專利說明】抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種作用于血管平滑肌細胞的多肽及其衍生物，具體是指一種抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]動脈粥樣硬化疾病已成為危害人類健康的第一殺手，且其發(fā)病率逐年快速上升，發(fā)病年齡日益年輕化。對于嚴重冠狀動脈粥樣硬化病變通常需要進行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI),目前PCI已成為我國動脈粥樣硬化疾病十分重要的治療方法，2010年我國植入冠脈內(nèi)支架數(shù)量已達30余萬例，血管內(nèi)支架已成為最常用的血管內(nèi)植入物。在上世紀80年代末至90年代初期，經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)血管成形術(Percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)是治療冠心病的重要手段。然而，PTCA術后冠脈發(fā)生再狹窄的發(fā)生率高達30~50%，且約有20%的患者在6個月內(nèi)需要再次行血運重建術。1986年金屬裸支架(bare metal stent, BMS)問世,使支架術后再狹窄發(fā)生率顯著降低。但由于BMS采用的支架平臺為不銹鋼(316L)，其組織相容性相對較差，大量研究顯示BMS再狹窄率高達20~30%。2003年藥物洗脫支架(drug elutingstents, DES)的問世，降低了 PCI術后心血管事件的發(fā)生率。第一代DES西羅莫斯洗脫(sirolimus-eluting)支架 Cypher 和紫杉醇洗脫(paclitaxel-eluting)支架獲得了良好的早期療效，支架術后再 狹窄率降至10%左右。但由于第一代DES選用的藥物細胞毒性較高，支架涂層不可吸收且組織生物相容性差，延緩支架的內(nèi)皮化，具有引發(fā)晚期支架內(nèi)血栓(late angiographic stent thrombosis, LAST)形成的風險。因此，第二代 DES 支架平臺多采用生物相容性較高的鈷鉻合金和藥物涂層材料，并采用新的抗細胞增殖藥物，如西羅莫斯衍生物佐他莫司、依維莫司、他克莫司、吡美莫司等。目前已用于臨床的第二代DES主要有Endeavor支架(佐他莫司)和Xience V支架(依維莫司)。其中,Xience V支架米用的涂層藥物為較低毒性的依維莫司，應用具有更好的生物相容性及藥物控釋功能的涂層(偏氟乙烯-六氟丙烯共聚物等)，涂層載藥的25%于支架植入后的第一天釋放，在I個月內(nèi)釋放75%，到達4個月時藥物幾乎完全釋放，極少引起宿主反應，內(nèi)皮細胞能快速的遷移并完全覆蓋支架表面，可縮短抗血小板治療時間半年以內(nèi)，顯著降低心腦血管事件發(fā)生率至6.8%。后續(xù)的SPIRIT 1-1V以及FUTURE1-1II等大型臨床研究顯示，其有效性和安全性均優(yōu)于西羅莫司洗脫支架。然而，第二代DES的支架晚期血栓事件年發(fā)生率為0.4~0.6%，有一定的再狹窄發(fā)生率，依然存在很多不足。另外，藥物涂層支架抑制血管平滑肌細胞增生、抑制內(nèi)皮細胞愈合，導致在狹窄時間上的延遲和晚期血栓形成，易產(chǎn)生支架貼壁不全或產(chǎn)生血管瘤等，且不適合用于所有患者，包括對支架涂層藥物過敏的患者，以及涂層藥物局部應用的安全有效劑量和時間窗、藥物代謝衰減后血管平滑肌增殖是否存在反跳現(xiàn)象等技術問題還有待研究。如何進一步提高抗血管再狹窄的效果成為亟待解決的問題，而要解決這些問題，重點在于優(yōu)選可降解支架涂層材料和新的抗細胞增生藥物，以提高第二代藥物涂層支架的組織相容性和血液相容性。[0003]血管再狹窄是PCI引起去內(nèi)皮化及機械性擴張引起血管損傷，觸發(fā)血管平滑肌細胞的異常增殖和基質合成(內(nèi)膜增生)。目前，臨床上所應用的支架涂層藥物雖然可以顯著降低血管再狹窄的發(fā)生率，但總體的再狹窄發(fā)生率仍較高，治療復雜病變，如分叉病變、慢性完全閉塞性病變的再狹窄率則更高。究其原因，可能與其主要通過抑制Ras下游的信號轉導通路(如PI3K-AKT-mT0R)發(fā)揮抗細胞增殖作用有關。因此，有效的抑制局部血管平滑肌細胞增殖是防止支架術后再狹窄的關鍵措施。前期的研究中首次發(fā)現(xiàn)線粒體融合素基因2 (Mitofusin2，Mfn2，)是VSMCs胞漿中Ras蛋白的負向調控因子，通過抑制Ras-Raf-MAPK信號路徑，使VSMC生長停滯于GO-Gl期而抑制其增殖；通過Ras-PI3K-Akt信號傳導路徑而促進細胞凋亡，nature cell biology 述評專家認為 HSG (hyperplasia suppressor gene增殖抑制基因)可為心腦血管增生性疾病提供新的防治方法。
[0004]Mfn2基因作為新近發(fā)現(xiàn)的一個基因，廣泛分布于人體的心、腦、腎、肺、肝及血管壁等各種組織中。Mfn2基因的cDNA (complementary DNA互補DNA)全長為4161bp,其開放閱讀框編碼含有757個氨基酸的蛋白質，利用計算機軟件分析蛋白質結構與功能得知，該基因存在多個結構位點:p21RAS特性結構(77-92氨基酸)、GTP結合位點(98-117氨基酸)、GTP結合功能區(qū)(117-264氨基酸)、PKA/PKG磷酸化位點(106、156、442氨基酸)，跨膜區(qū)(599-644氨基酸)。利用構建的攜帶大鼠全長Mfn2cDNA基因的重組腺病毒(Adv_Mfn2)，感染培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs),可明顯抑制ERKI/2的磷酸化水平，將細胞生長阻斷在細胞周期的G0/G1期，對VSMCs增殖抑制率約為45%。進一步采用球囊損傷大鼠頸動脈造成再狹窄模型，將Adv-Mfn2注入損傷的血管壁，可明顯抑制血管中膜和內(nèi)膜VSMCs的增殖，抑制率分別為82%和97.2%，內(nèi)膜和中膜的比值降低了 90%。由此可見，Mfn2是Ras基因的一個新的負向調控因子，亦是細胞增殖通路上一個新的調控點，因此又稱之為增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene, HSG),它對于血管增殖性疾病的防治具有重要的意義。本研究組進一步的研究表明，Mfn2也能有效促進VSMCs的凋亡。Mfn2的表達在氧化應激誘導的VSMCs凋亡過中顯著增加；高表達Mfn2可使培養(yǎng)的大鼠VSMCs的凋亡率達85% ;應用siRNA技術沉默Mfn2基因表達，則可有效減少氧化應激和高表達Mfn2所致的VSMCs凋亡。動物實驗結果也表明，轉染Adv_Mfn2至大鼠球囊損傷的血管壁，VSMC s的凋亡率可達18%。Western blot (蛋白質免疫印跡)檢測結果顯示，Mfn2可顯著下調磷酸化Akt的表達，抑制Bcl-2的表達，促進Bax的表達，進而經(jīng)由線粒體凋亡途徑誘導VSMCs凋亡。此外，Mfn2可以抑制由氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的VSMCs增殖，并延緩大鼠動脈粥樣硬化的進程。另有研究發(fā)現(xiàn)，過表達Mfn2可以通過PI3K-Akt (Akt protein kinase B蛋白激酶B)和線粒體凋亡途徑誘導心肌細胞凋亡,抑制Mfn2的表達則可減少氧化應激誘導的心肌細胞凋亡。除此之外，高表達Mfn2還可以誘導多種腫瘤細胞，如A549 (肺癌細胞)、MCF-7 (乳腺癌細胞)、HT-29 (結腸癌細胞)、HeLa (宮頸癌細胞)、膀胱癌細胞等發(fā)生凋亡。上述這些研究都提示，Mfn2可望作為細胞增殖性疾病防治的新祀點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是要提供一種不僅具有抗VSMCs增殖的作用、還可以顯著誘導血管平滑肌細胞的凋亡、并可以更有效的發(fā)揮抗血管成形術后的再狹窄的作用的抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽及其制備方法和用途。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽，該多肽包括多肽序列“GYLSKVRGISEVL” ；或與該多肽序列同源性相似、功能相同的另一種多肽序列“DVKGYLSKVRGISEVL”。為了讓多肽具有穿過細胞膜進入細胞的功能，在多肽序列N端加入TAT穿膜肽，從而合成多肽序列“SPHSG”為:YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL ;或與該多肽序列同源性相似、功能相同的另一種多肽序列“MRSP”為:YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。
[0007]隨著穿膜肽研究的進展，未來會存在眾多穿模性更強的穿膜序列，如目前有在TAT穿膜肽基礎上改進的PTD4穿膜肽，其序列為“YARAAARQARA”。在本發(fā)明多肽序列前面加入PTD4穿膜肽后有可能進一步增強其誘導細胞凋亡和抑制增殖的效果。[0008]本發(fā)明還提供了抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽的制備方法，它包括如下步驟:
[0009](I)多肽合成是從C末端合成到N末端的，選擇連有第一個氨基酸的2氯三苯甲基樹脂，用一個帶有砂芯的反應柱，裝入0.1mmol (毫摩爾)的樹脂，先用DMF (二甲基甲酰胺)，DCM (三氯甲烷)沖洗，浸泡20分鐘；
[0010](2)按照序列依次選用Fmoc (芴甲氧羰?；?保護的氨基酸，按照氨基酸，HOBT羥基苯并三氮唑，DIC (日本DIC公司，中文名稱為迪愛生投資有限公司)樹脂摩爾比4: 6:
4: I的量，用DMF5毫升溶解，添入反應柱，反應I個小時；
[0011](3)反應完畢，用茚三酮檢測液檢測，如果是樹脂無色呈陰性，即認為偶聯(lián)完全，可以進行下一步，如果是樹脂藍色呈陽性，重復此步實驗；
[0012](4)偶聯(lián)完畢，用20%的哌啶溶液沖洗樹脂依次，并浸泡10分鐘，用以脫去FMOC
(芴甲氧羰?；?保護基團，重復兩次；
[0013](5)依據(jù)合成序列依次加入保護氨基酸，直至最后一個氨基酸偶聯(lián)完畢，并用哌啶脫保護；
[0014](6)合成的后處理:把樹脂從合成反應柱中取出，放入一底部有燒結玻璃濾片的玻璃容器中，分別依次用DMF (二甲基甲酰胺)，DCM (二氯甲烷)，MeOH (甲醇)，DCM和MeOH的體積是樹脂體積的5-10倍，沖洗樹脂；
[0015](7)樹脂沖洗完畢，另取一帶玻璃塞的試管，配置20毫升裂解試劑，配置方式如下:
[0016]①:加17.5毫升TFA (三氟乙酸)于試管中；(TFA有強腐蝕性和揮發(fā)性，應在通風廚中操作);
[0017]②:加新鮮的重蒸酚0.5克；
[0018]③:加thioanisole (苯硫基甲燒)I毫升；
[0019]④:加anisole (苯甲醚)0.4毫升;
[0020](8)輕微震蕩混勻，加入放入樹脂的玻璃容器中，反應2.5小時，待反應完畢，用真空抽濾的辦法分離樹脂和裂解試劑。把裂解試劑放入一球形燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)的辦法減壓蒸去液體物質，只留下固體；
[0021](9)另取100毫升的冷乙醚加入球形燒瓶中，此時有大量的白色沉淀物質，為粗多肽；離心分離乙醚和多肽，丟棄上清乙醚，多肽繼續(xù)用冷乙醚洗滌，離心，得到多肽粗品，凍干機凍干；[0022](10)用 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)高壓液相色譜)純化處理。
[0023]本發(fā)明還提供一種上述的多肽在冠脈支架和球囊涂層中的應用，該多肽可以提供制備新型冠脈涂層球囊和涂層支架所需的一種新藥物。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點在于:與目前主要的支架涂層藥物依維莫司相比，MRSP和SPHSG可以直接抑制Ras，其抑制點更高，因此效果也更明顯，因而可用于研制多肽涂層球囊與涂層支架，從而成為防治血管再狹窄等血管增殖性疾病的新靶點。另外，MRSP和SPHSG不僅具有抗VSMCs增殖的作用，還可以顯著誘導血管平滑肌細胞的凋亡，可以更有效的發(fā)揮抗血管成形術后的再狹窄的作用。而且由于MRSP和SPHSG是人體Mfn2自身的小分子蛋白片段，沒有一般化學藥物的毒副作用，卻具有化學藥物不可比擬的生物相容性和血液相容性，能有效抗血管成形術后的再狹窄，提高支架植入術后的長期療效和安全性，是抗細胞增生藥物洗脫支架較為理想的新型低細胞毒涂層藥物。
[0025]本發(fā)明多肽在冠脈支架涂層中的應用與傳統(tǒng)的涂層藥物相比，作為Mfn2自身的小片斷，該多肽不具有化學藥物的毒副作用和免疫原性，實用性和安全性也優(yōu)于雷帕霉素或紫杉醇等傳統(tǒng)涂層支架，因此具有很廣泛的應用前景和較大的臨床應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的流式圖。
[0027]圖2是本發(fā)明采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的柱狀圖。
[0028]圖3是本發(fā)明的Caspase3酶活性檢測結果圖。
[0029]圖4是本發(fā)明的TUNEL (原位末端轉移酶標記技術)比色法檢測細胞凋亡的鏡下圖。
[0030]圖5是本發(fā)明的TUNEL (原位末端轉移酶標記技術)比色法檢測細胞凋亡率的柱狀圖。
[0031]圖6是本發(fā)明的Western Blot方法檢測磷酸化Akt (p-AKT)的表達水平。
[0032]圖7是本發(fā)明的Western Blot方法檢測磷酸化Akt (p-AKT)的表達水平的各組相對灰度比值。
[0033]圖8是本發(fā)明的細胞計數(shù)法檢測各組對細胞增殖的抑制作用的曲線圖。(CBS作為陽性對照，檢測MRSP和SPHSG對細胞增殖的抑制作用)
[0034]圖9是本發(fā)明的細胞計數(shù)法檢測各組對細胞增殖的抑制作用的曲線圖。(Rapamycin作為陽性對照，檢測MRSP和SPHSG對細胞增殖的抑制作用)
[0035]圖10是本發(fā)明的CCK-8法檢測各組對細胞增殖的抑制作用的曲線圖。(CBS作為陽性對照，檢測MRSP和SPHSG對細胞增殖的抑制作用)
[0036]圖11是本發(fā)明的CCK-8法檢測各組對細胞增殖的抑制作用的曲線圖。(Rapamycin作為陽性對照，檢測MRSP和SPHSG對細胞增殖的抑制作用)
[0037]序列表1為“ SPHSG”序列。
[0038]序列表1I為“MRSP”序列。
【具體實施方式】[0039]以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0040]本發(fā)明抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽，該多肽包括多肽序列“SPHSG”為:YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL ;或與該多肽序列同源性相似、功能相同的另一種多肽序列“MRSP”為:YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。制備本發(fā)明的多肽的方法步驟如下:
[0041]1、多肽合成是從C末端合成到N末端的，選擇連有第一個氨基酸的2氯三苯甲基樹脂，用一個帶有砂芯的反應柱，裝入0.1mmol的樹脂，先用DMF，DCM沖洗，浸泡20分鐘。
[0042]2、依次選用(按照序列)Fmoc保護的氨基酸，按照氨基酸，HOBT, DIC樹脂摩爾比4:6:4:1的量，用DMF5毫升溶解，添入反應柱，反應I個小時。
[0043]3、反應完畢，用茚三酮檢測液檢測，如果是陰性(樹脂無色)，即認為偶聯(lián)完全，可以進行下一步，要是陽性(樹脂藍色)，重復此步實驗。
[0044]4、偶聯(lián)完畢，用20%的哌啶(DMF)溶液沖洗樹脂依次，并浸泡10分鐘，用以脫去FMOC保護基團，重復兩次。
[0045]5、依次加入保護氨基酸(依據(jù)合成序列)。直至最后一個氨基酸偶聯(lián)完畢，并用哌淀脫保護。
[0046]6、合成的后處理:把樹脂從合成反應柱中取出，放入一底部有燒結玻璃濾片的玻璃容器中，分別依次用DMF (二甲基甲酰胺)，DCM (二氯甲烷)，MeOH (甲醇)，DCM和MeOH的體積是樹脂體積的5-10倍，沖洗樹脂。
[0047]7、樹脂沖洗完畢，另取一帶玻璃塞的試管，配置20毫升裂解試劑，配置方式如下:`[0048](I)加17.5毫升TFA (三氟乙酸)于試管中；(TFA有強腐蝕性和揮發(fā)性，應在通風廚中操作);
[0049](2)加新鮮的重蒸酚0.5克；
[0050](3)加 thioanisolel 毫升；
[0051](4)加 anisole0.4 毫升。
[0052]8、輕微震蕩混勻，加入放入樹脂的玻璃容器中，反應2.5小時。待反應完畢，用真空抽濾的辦法分離樹脂和裂解試劑。把裂解試劑放入一球形燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)的辦法減壓蒸去液體物質，只留下固體。
[0053]9、另取100毫升的冷乙醚加入球形燒瓶中，此時有大量的白色沉淀物質，為粗多肽。離心分離乙醚和多肽，丟棄上清乙醚，多肽繼續(xù)用冷乙醚洗滌，離心，得到多肽粗品，凍干機凍干。
[0054]10、用HPLC純化處理。
[0055]對上述制備的多肽的醫(yī)學實驗結果如下:
[0056]實驗例一:流式細胞術檢測平滑肌細胞的凋亡
[0057]1、取第4-9代的大鼠VSMCs，準確計數(shù)后按5X IO5個細胞/孔接種于六孔板中，加A 2ml DMEM (dulbecco's modified eagle medium細胞培養(yǎng)基)高糖培養(yǎng)基,每組可設3個復孔，于37°C、5%C02的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
[0058]2、同步化，吸棄各個實驗孔內(nèi)的培養(yǎng)基,無菌PBS (phosphate buffer solution磷酸鹽緩沖液)洗2次，注意操作要輕柔，盡量避免將細胞吹起，然后用移液槍分別向各個實驗孔內(nèi)加入2ml無血清DMEM培養(yǎng)基。按25 μ mo I/L的濃度分別向各實驗組加入SPHSG、MRSP和NC (無效對照)，空白組只加無血清的培養(yǎng)基，混合均勻后置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24h。
[0059]3、作用細胞24h、48h、72h收集細胞，由于有部分已經(jīng)凋亡的細胞漂浮于細胞培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基也應一并被收集。
[0060]4、將收集的細胞懸浮液置于15ml無菌離心管中，注意應漿細胞收集完全，以免影響細胞凋亡率的檢測，然后1000rpm，6min，4°C離心，棄上清。用已經(jīng)1ml預冷的PBS緩沖液洗一次，再次離心，棄上清。1mllXBinding Buffer重懸細胞(Binding Buffer結合緩沖液)，吹打輕柔使細胞均勻分布，離心1000rpm,6min,4°C,棄上清。1OOu 11 XBindingBuffer重懸細胞。
[0061]5、加 5 ul Annexin V PE (Annexin V Phycoerythrin 藻紅蛋白標記的膜聯(lián)蛋白V)到細胞懸液中，室溫，靜置10-15min，待反應完全后避光加入5 U17-AAD(7-Aminoactinomycin D氨基放線菌素D),輕柔混勻,4°C冰箱避光放置。
[0062]6、4h內(nèi)用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。
[0063]7、結果顯示:如圖1和圖2所示，SPHSG和MRSP作用平滑肌細胞后48h和72h，與空白對照組Control及無效對照組NC相比，有顯著的促進平滑肌細胞凋亡的效應(P<0.05),且時間越長，凋亡效果越明顯；作用細胞48h后，Control組和NC組的細胞凋亡率分別為(7.7±0.7) %和(8.9±1.5) %，兩組間無明顯統(tǒng)計學差異(P > 0.05)，MRSP組凋亡率為(20.9±0.8) %，SPHSG組凋亡率為(28.0±1.9) %，較MRSP組明顯增加(P < 0.05);作用細胞72h后，Control組和NC組的細胞凋亡率分別為(12.0±0.5) %和(13.45±0.4) %，兩組間無明顯統(tǒng)計學差異(P > 0.05)，MRSP組凋亡率為(33.0±1.5) %，SPHSG組凋亡率為(48.7 ± 6.3 ) %，較MRSP組明顯增加(P < 0.05 )，兩組間有統(tǒng)計學差異。
[0064]實驗例二:Caspase3酶活性檢測
[0065]1、取第4-9代的大鼠VSMCs，準確計數(shù)后按1 X 1O6個細胞/孔接種于60mm細胞培養(yǎng)皿中，加入3ml DMEM高糖培養(yǎng)基，每組可設3個復孔，于37°C、5%C02的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
[0066]2、同步化，吸棄各個實驗孔內(nèi)的培養(yǎng)基，無菌PBS洗2次，注意操作要輕柔，盡量避免將細胞吹起，然后用移液槍分別向各個實驗孔內(nèi)加入3ml無血清DMEM培養(yǎng)基。按25 u mo l/L的濃度分別向各實驗組加入SPHSG、MRSP和NC，空白組只加無血清的培養(yǎng)基，混合均勻后置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h。
[0067]3、在細胞未進入晚期凋亡的時候收集細胞，將細胞收集完全。
[0068]4、將收集的細胞懸浮液置于15ml無菌離心管中，離心450g，10min，4°C，棄上清，用2ml冷PBS緩沖液洗一次，再次離心，棄上清。
[0069]5、向細胞沉淀中加入1Oul細胞裂解液，將細胞反復吹打均勻后，反復凍融3次，使細胞完全裂解，然后將已經(jīng)裂解的細胞懸液置于冰上，孵育15min。
[0070]6、離心細胞懸液，15000g，20min，4°C，收集細胞提取物，即細胞上清。在96孔板中配制反應體系，如下表:
[0071]
【權利要求】
1.一種抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽，其特征在于:該多肽包括多肽序列“SPHSG”為:YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL ;或與該多肽序列同源性相似、功能相同的另一種多肽序列 “MRSP” 為:YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。
2.如權利要求1所述的抑制細胞增殖并誘導其凋亡的多肽的制備方法，它包括如下步驟: (1)多肽合成是從C末端合成到N末端的,選擇連有第一個氨基酸的2氯三苯甲基樹月旨，用一個帶有砂芯的反應柱，裝入0.1mmol的樹脂，先用二甲基甲酰胺、三氯甲烷沖洗，浸泡20分鐘； (2)按照序列依次選用芴甲氧羰?；Ｗo的氨基酸，按照氨基酸，羥基苯并三氮唑，DIC樹脂摩爾比4: 6: 4: I的量，用二甲基甲酰胺5毫升溶解，添入反應柱，反應I個小時； (3)反應完畢，用茚三酮檢測液檢測，如果是樹脂無色呈陰性，即認為偶聯(lián)完全，可以進行下一步，如果是樹脂藍色呈陽性，重復此步實驗； (4)偶聯(lián)完畢，用20%的哌啶溶液沖洗樹脂依次，并浸泡10分鐘，用以脫去芴甲氧羰?；Ｗo基團，重復兩次； (5)依據(jù)合成序列依次加入保護氨基酸，直至最后一個氨基酸偶聯(lián)完畢，并用哌啶脫保護； (6)合成的后處理:把樹脂從合成反應柱中取出，放入一底部有燒結玻璃濾片的玻璃容器中，分別依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇，二氯甲烷和甲醇的體積是樹脂體積的5-10倍，沖洗樹脂； (7)樹脂沖洗完畢，另取一帶玻璃塞的試管，配置20毫升裂解試劑，配置方式如下: ①:加17.5毫升三氟乙酸于試管中； ②:加新鮮的重蒸酚0.5克； ③:加苯硫基甲燒I毫升； ④:加苯甲醚0.4毫升； (8)輕微震蕩混勻，加入放入樹脂的玻璃容器中，反應2.5小時，待反應完畢，用真空抽濾的辦法分離樹脂和裂解試劑；把裂解試劑放入一球形燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)的辦法減壓蒸去液體物質，只留下固體； (9)另取100毫升的冷乙醚加入球形燒瓶中，此時有大量的白色沉淀物質，為粗多肽；離心分離乙醚和多肽，丟棄上清乙醚，多肽繼續(xù)用冷乙醚洗滌，離心，得到多肽粗品，凍干機凍干; (10)用高壓液相色譜純化處理。
3.如權利要求1所述的多肽在冠脈支架和球囊涂層中的應用。
【文檔編號】C07K19/00GK103613669SQ201310571421
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權日:2013年11月13日
【發(fā)明者】郭小梅, 糜濤, 錢翠平, 白靜, 劉純, 劉曉雯, 彭穩(wěn)中, 陳光慧 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院