長效重組絨促性素及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組人絨促性素融合蛋白(Human?chorionic?gonadotrophin-Fc?fusion?protein，簡稱HCG-Fc)及其制備方法，該HCG-Fc蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包括HCGβ亞基、HCGα亞基、柔性肽接頭和人IgG?Fc變體，與現(xiàn)有絨促性素相比，其體內(nèi)半衰期更長、生物利用度更高，可大大減少用藥次數(shù)和劑量。本發(fā)明還涉及重組HCG-Fc融合蛋白組合物在制備動物繁殖領(lǐng)域藥物中的用途。
【專利說明】長效重組絨促性素及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和獸藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及重組長效人絨促性素融合蛋白、其制備方法及應(yīng)用。該融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，生物利用度顯著增加，大大減少動物繁殖用藥次數(shù)和劑量。
【背景技術(shù)】
[0002]人絨促性素(Human chorionic gonadotrophin,簡稱HCG)是動物繁殖領(lǐng)域常用的藥物主要成分，現(xiàn)有上市HCG主要為人尿中提取的生化品種，可用于魚類和畜類的促排卵和催產(chǎn)。目前我國市場上的HCG主要為孕婦尿液中提取的產(chǎn)品，存在病毒污染、原料來源有限、采集困難、含量低及純化過程復(fù)雜等缺陷。另外，因檢測方法及病毒滅活技術(shù)的局限性以及一些不可預(yù)知的新致病病毒感染時有發(fā)生，并不能完全杜絕生化提取產(chǎn)品發(fā)生病毒污染的可能性。
[0003]相比而言，重組HCG在其純度、抗原性、安全性、無病毒感染等方面具有生化HCG產(chǎn)品無法比擬的優(yōu)點。迄今為止，還未有重組HCG產(chǎn)品用于獸藥領(lǐng)域。HCG是一種糖基化蛋白，SDS-PAGE檢測其分子量為50KD。另外，HCG是具有兩條單鏈(α鏈和β鏈)的糖基化蛋白，鏈間以非共價鍵連接，兩條鏈的正確折疊才能保證HCG的生物活性。如何在蛋白表達和純化過程中保持兩條鏈的正常結(jié)合是一個挑戰(zhàn)。作為一種治療藥物，保證其生物活性，必要的條件是具有正確的三維結(jié)構(gòu)和糖基化修飾。具有完善翻譯后修飾功能是哺乳動物細胞被選作大多數(shù)生物藥蛋白表達宿主的主因。其中，中國倉鼠卵巢細胞(Chinese HamsterOvary Cell，簡稱CH0)是用于真核生物外源基因表達最為成功的宿主細胞，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達，很多人用重組蛋白藥物已上市。與其它表達系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點，如擁有完備的翻譯后加工過程，包括糖基化、羥基化，使表達的外源真核基因產(chǎn)物能夠保持其天然結(jié)構(gòu)及活性，且使表達產(chǎn)物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分離純化。`
[0004]目前已有利用CHO細胞生產(chǎn)的人用藥物重組HCG上市，但仍然存在如下問題:首先，現(xiàn)有方法生產(chǎn)的重組HCG表達量太低，制備過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本太高；其次，其半衰期短，需要頻繁注射給藥，特別是在魚類的催產(chǎn)過程中，頻繁的抓取親魚容易對親魚造成鱗片脫落、病毒入侵等傷害。因此，利用分子生物學(xué)和細胞培養(yǎng)方法，開發(fā)具有生物活性和更長半衰期的重組HCG藥物是本領(lǐng)域的一個挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供重組人絨促性素融合蛋白(Human chorionic gonadotrophin-Fcfusion protein,簡稱HCG-Fc)及其制備方法及應(yīng)用，該重組HCG-Fc融合蛋白應(yīng)用于動物繁殖領(lǐng)域，與現(xiàn)有生化提取產(chǎn)品活性類似，且具有純度高、半衰期顯著延長等特點。
[0006]本發(fā)明的一個目的是提供重組HCG-Fc融合蛋白，該融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含HCGii亞基、HCGa亞基、肽接頭(Linker，簡稱 L)和人 IgG Fe 變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc 和 vlgGlFc)，如 SEQ ID NO:2、4 和 6 所示(HCG β -HCG a -vIgG2Fc、HCG β -HCG α -vIgG4Fc、HCG β -HCG α -vlgGlFc 氨基酸序列)，優(yōu)選的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 (HCG β -HCG a -vIgG2Fc)，上述融合蛋白統(tǒng)稱為HCG_Fc。
[0007]所述的HCGii亞基的氨基酸序列去除了完整HCGii亞基中的1_20位氨基酸殘基，即成熟HCGii亞基的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0008]所述的HCG α亞基的氨基酸殘基序列去除了完整HCG α亞基中的1_24位氨基酸殘基，即成熟HCGa亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0009]所述的肽接頭含有2-20個氨基酸殘基，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基，優(yōu)選的肽接頭氨基酸序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerο
[0010]所述的人IgG Fe變體包括:(I)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；(2)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；(3)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgGl絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。優(yōu)選的人IgGFc變體是，含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
[0011]以下具體介紹本發(fā)明的人IgG Fe變體、肽接頭功能:
[0012]IgG Fe 變體
[0013]IIgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，它們的半衰期可高達21天，而Fe片段是IgG保持體內(nèi)較長半衰期的主要原因，同時具有穩(wěn)定蛋白的作用。
[0014]Fe來自免疫球蛋白的Fe區(qū)域，F(xiàn)e在消滅病原體的免疫防御中具有重要作用。IgG的效應(yīng)子功能由Fe介導(dǎo)，通`過兩種主要機制:(I)與細胞表面Fe受體(FcyRs)的結(jié)合，通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補體成分Cl的Clq部分的結(jié)合，引發(fā)依賴于補體的細胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3能有效的結(jié)合FcyRs0 IgG4與Fe Y Rs的結(jié)合親和力比IgGl和IgG3的低一個數(shù)量級，而IgG2與Fe Y Rs的結(jié)合低得難以測定。人IgGl和IgG3還能有效地結(jié)合Clq，并激活補體級聯(lián)反應(yīng)。人IgG2對補體的固定很弱，而IgG4表現(xiàn)極端缺乏激活補體級聯(lián)的能力。對于醫(yī)療用途而言，重組二聚化蛋白的Fe區(qū)域必須不會介導(dǎo)效應(yīng)子功能而裂解或除去這些細胞。因此，HCG-Fc的Fe區(qū)域必須是非裂解性的，即在結(jié)合Fe Y Rs和Clq而觸發(fā)效應(yīng)子功能方面，F(xiàn)e最好是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產(chǎn)生HCG-L-Fc重組二聚化蛋白。為了得到非裂解性的Fe，必須使天然Fe區(qū)域中的一些氨基酸突變，以減少其效應(yīng)子功能。
[0015]通過分析不同種屬的IgG同種型的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CH2區(qū)域氨基末端附近的Fe部分顯示在IgG Fe與Fe Y Rs的結(jié)合中起作用，而與Clq結(jié)合至關(guān)重要的部分位于人IgG的CH2區(qū)域羧基端附近。為了減少Fe與FcyRs和Clq的結(jié)合而引發(fā)的效應(yīng)子功能，本發(fā)明使用下列人IgG Fe變體(圖1):⑴IgG2Fc變體:含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；(2) IgG4Fc變體:含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和 CH3 區(qū)域；(3) IgGlFc 變體:含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。優(yōu)選的人IgG Fe變體是，含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
[0016]上述Fe變體比天然IgG2Fc、IgG4Fc和IgGlFc表現(xiàn)出低得多的效應(yīng)子功能，更適于制備重組HCG-Fc融合蛋白。
[0017]肽接頭
[0018]連接肽的長度對重組二聚化蛋白的活性非常重要。已有人報道了促紅細胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，與EPO單體相比，含有2個完整的EPO區(qū)域(相隔3到7個氨基酸肽接頭)的重組二聚化蛋白表現(xiàn)出減弱的活性(參見Qiu H等，J Biol Chem,273:11173-11176，1998)。然而，當(dāng)這兩個EPO區(qū)域間的肽接頭的長度為17個氨基酸時，二聚體EPO分子的體外和體內(nèi)生物活性明顯提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem, 274:24773-24778，1999 ;美國專利N0.6，187，564)。這可能解釋為重組二聚化蛋白兩部分間增加的連接肽，使該分子的兩部分能分別行使其功能(參見Ashkenazi A等，Curr Opin inImmunol,9: 195-200,1997)。
[0019]本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，首次設(shè)計了一種獨特的絞鏈區(qū)肽接頭來降低空間位阻效應(yīng)，可以制得HCG α鏈的C端與Fe變體偶聯(lián)的重組二聚化蛋白，中間有柔軟的肽接頭。此重組二聚化蛋白不僅不會導(dǎo)致HCG的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高HCG-Fc重組二聚化蛋白的生物活性。優(yōu)選肽接頭的氨基酸殘基序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
[0020]本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白具有以下特征:該重組融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含HCGii亞基、HCGa亞基、肽接頭和人IgG Fe變體。人IgG Fe變體具有延長體內(nèi)半衰期和穩(wěn)定蛋白的作用，F(xiàn)e變體是非裂解性的，可減少與Fe Y Rs和Clq結(jié)合而觸發(fā)的效應(yīng)子功能。通過柔軟的肽接頭進行HCG α鏈的C端與Fe變體的偶聯(lián)，能夠維持、甚至提高重組HCG-Fc融合蛋白的生物活性。
[0021]本發(fā)明首次將肽接頭和人IgG Fe變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc或vlgGlFc)有序地連接到HCG中而形成新型的重組HCG-Fc融合蛋白，并首次應(yīng)用于動物繁殖領(lǐng)域。該融合蛋白中人IgG Fe變體和肽接頭的`位置排列能維持HCG正確的空間構(gòu)型，而不影響其生物活性，并可顯著延長半衰期、提高生物利用度，與現(xiàn)有動物繁殖用藥方案比較，可大大減少用藥次數(shù)和劑量。
[0022]本發(fā)明另一個目的是提供一種重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，該制備方法包括:
[0023](I)構(gòu)建編碼重組HCG-Fc融合蛋白的基因表達載體；
[0024](2)重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩(wěn)定表達；
[0025](3)高密度細胞培養(yǎng)重組HCG-Fc融合蛋白；
[0026](4)重組HCG-Fc融合蛋白的純化制備。
[0027]具體來說，構(gòu)建編碼重組HCG-Fc蛋白的基因表達載體步驟為:采用人工合成方法獲得編碼重組HCG-Fc融合蛋白基因進行了密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(如SEQ ID NO: 1,3和5所示)，插入到哺乳動物細胞表達載體(如P⑶NA3)，獲得含有HCG-Fc目的基因表達質(zhì)粒P⑶NA3-HCG-Fc (圖6)，優(yōu)選的核苷酸序列如SEQ ID NO:1?；虻暮塑账嵝蛄袃?yōu)化是基于哺乳動物宿主細胞偏愛的密碼子來選擇設(shè)計。
[0028]所述的哺乳動物細胞表達載體可采用市售的但不限于，如:p⑶NA3、pCMV / ΖΕ0、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核細胞系統(tǒng)表達的載體，優(yōu)選，pCDNA3。
[0029]重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩(wěn)定表達步驟為:將含有HCG-Fc蛋白的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到合適的哺乳動物宿主細胞，利用篩選標(biāo)記篩選和擴增選擇性標(biāo)記獲得穩(wěn)定聞表達目的蛋白的細胞株。
[0030]所述的哺乳動物宿主細胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NSO和Sp2 / O細胞。優(yōu)選，CHO細胞；更優(yōu)選，已馴化適應(yīng)無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的DHFR(Dihydrofc)IateReductase, 二氫葉酸還原酶)缺陷型CHO細胞(簡稱CH0-DHFIT)。
[0031]所述的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣法，電轉(zhuǎn)法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是電轉(zhuǎn)法。
[0032]所述的篩選方法是先利用篩選標(biāo)記進行篩選，然后用擴增選擇性標(biāo)記可提高表達量并獲得穩(wěn)定高表達細胞株。篩選標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一個合適的選擇性抗性標(biāo)記，如ZEO (Zeocin,博來霉素)、G418 (氨基糖苷類抗生素)、PUR(puromycin,嘌呤霉素)、HYP(Hygromycin,潮霉素)，優(yōu)選的抗性基因為ZEO ;篩選標(biāo)記也可為本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一個突光標(biāo)記基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein,綠色突光蛋白)、RFP (RedFluorescent Protein,紅色突光蛋白)，優(yōu)選的突光標(biāo)記基因為GFP。擴增選擇性標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase,谷氨酰胺合成酶)序列，優(yōu)選的擴增選擇性基因是DHFR。由于CHO-DHFR-細胞自身缺失二氫葉酸還原酶(DHFR)，無法自身合成四氫葉酸,所以必須在添加了次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸腺喃唳(Thymidine)和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。而通過目的基因與DHFR基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長的細胞克隆，更為重要的是由于DHFR可被葉酸類似物MTX (Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，DHFR基因必須擴增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細胞系；又由于與DHFR基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細胞染色體上的同一區(qū)域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴增而擴增，可得到大量表達外源蛋白的細胞克隆。
[0033]高密度細胞培養(yǎng)重組HCG-Fc融合蛋白的步驟為:將上述篩選到的穩(wěn)定細胞株轉(zhuǎn)入搖瓶或生物反應(yīng)罐進行大規(guī)模培養(yǎng)，特別是，本發(fā)明通過對細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得高表達重組HCG-Fc融合蛋白的細胞`培養(yǎng)液。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)方法可實現(xiàn)高密度細胞培養(yǎng)、重組蛋白質(zhì)量和產(chǎn)量提升、重組蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。
[0034]所述的細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化包括降溫培養(yǎng)法，具體來說，當(dāng)細胞密度達到I X IO7個/ mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養(yǎng)直至表達產(chǎn)量不再增加。該方法可以提高表達蛋白的活力水平及重組蛋白的累積產(chǎn)量。
[0035]所述的細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法還包括在培養(yǎng)基中加入特殊的添加劑，優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mM ManNAc (N-乙?；?D-氨基甘露糖)。該方法可使重組HCG-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20 %。
[0036]重組HCG-Fc融合蛋白的純化制備步驟為:
[0037]DProteinA親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和ProteinA柱層析。
[0038]2)疏水層析柱純化:采用疏水層析柱，根據(jù)重組HCG-Fc融合蛋白的疏水性不同，進一步去除上述ProteinA純化后目標(biāo)蛋白中的雜質(zhì)。
[0039]所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。優(yōu)選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。[0040]本發(fā)明所公開的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，該制備方法可獲得表達產(chǎn)量高重組HCG-Fc融合蛋白。因與IgG Fe變體的偶聯(lián)，所形成的重組蛋白可以通過ProteinA親和層析得到高效便捷的純化。經(jīng)疏水層析進一步純化后得到的融合蛋白純度達到98%以上。此外，本發(fā)明所公布的重組HCG-Fc融合蛋白中α鏈和β鏈可正確折疊在一起，避免了 α-α 二聚體、β-β 二聚體的出現(xiàn)，大大簡化了純化步驟，降低了生產(chǎn)成本。
[0041]本發(fā)明的還一個目的是提供了一種含有長效重組HCG-Fc融合蛋白的藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發(fā)明所述的重組長效HCG-Fc融合蛋白。
[0042]具體來說，所述的藥物組合物含有有效量(如0.000001-90wt % ;較佳的
0.1-50被％;更佳的，5-40wt% )的本發(fā)明的重組長效HCG-Fc融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將有效量的本發(fā)明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。
[0043]所述的藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于):蔗糖、甘露醇、吐溫20 (Tween20)、蛋氨酸、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、及其組合物。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0044]本發(fā)明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于:所述的融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；動物所要治療疾病的嚴重程度、動物的體重、動物的免疫狀況、給藥途徑等。
[0045]本發(fā)明的再一個目的`是重組HCG-Fc融合蛋白在動物繁殖領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0046]本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長、生物利用度明顯提高，從而改善了藥物動力學(xué)和藥效，與現(xiàn)有HCG比較，可減少注射次數(shù)和劑量，減輕動物養(yǎng)殖的經(jīng)濟負擔(dān)。
[0047]本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白及其制備方法的優(yōu)點概括如下:
[0048]1.本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白是由IgG Fe變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc或vlgGlFc)與HCG偶聯(lián)形成的二聚體蛋白，可顯著延長蛋白的體內(nèi)半衰期，大大提高HCG在CHO細胞中的表達量，具有顯著的體內(nèi)外活性。
[0049]2.二聚化單鏈HCG-Fc融合蛋白的α鏈與β鏈以共價鍵正確折疊，避免形成α-α 二聚體和β-β 二聚體，大大簡化了純化工藝，降低生產(chǎn)成本。
[0050]3.本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，其半衰期是現(xiàn)有人尿HCG的10倍，且絕對生物利用度是人尿HCG的2倍，可大大減少用藥次數(shù)和劑量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1.顯示了人IgGl、IgG2、IgG4和它們變體的絞鏈區(qū)和CH2區(qū)域的氨基酸序列的比對。比較這三部分氨基酸序列:氨基酸區(qū)域228、234-237和330-331。這些變體的氨基酸突變以粗斜體顯示。氨基酸殘基編號是根據(jù)EU編號體系標(biāo)定。[0052]圖2.顯示了 HCG-Fc單鏈及二聚化結(jié)構(gòu)示意圖。a)單鏈HCG-Fc ；b) 二聚化的HCG-Fc。
[0053]圖3.顯示了在PCDNA3表達載體內(nèi)HindII1-EcoRI片段的HCG-Fc的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。HCG-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導(dǎo)肽(1-20)、成熟HCGii鏈、成熟HCGa鏈、肽接頭、IgG2Fc變體(vIgG2Fc)。成熟的重組HCG-Fc融合蛋白含有成熟HCG β鏈(21-165)、成熟 α 鏈(166-257)、肽接頭(258-273)和 IgG2Fc 變體(vIgG2Fc) (274-496)。
[0054]圖4.顯示了在TCDNA3表達載體內(nèi)HindII1-EcoRI片段的HCG-Fc的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。HCG-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導(dǎo)肽(1-20)、成熟HCGii鏈、成熟HCGa鏈、肽接頭、IgG4Fc變體(vIgG4Fc)。成熟的重組HCG-Fc融合蛋白含有成熟HCG β 鏈(21-165)、成熟 HCG α 鏈(166-257)、肽接頭(258-273)和 IgG4Fc 變體(vIgG4Fc)(274-502)。
[0055]圖5.顯示了在PCDNA3表達載體內(nèi)HindII1-EcoRI片段的HCG-Fc的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。HCG-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導(dǎo)肽(1-20)、成熟HCGii鏈、成熟HCGa鏈、肽接頭、IgGlFc變體(vlgGlFc)。成熟的重組HCG-Fc融合蛋白含有成熟HCG β 鏈(21-165)、成熟 HCG α 鏈(166-257)、肽接頭(258-273)和 IgGlFc 變體(vlgGlFc)(274-500)。
[0056]圖6.顯示了所構(gòu)建編碼HCG-Fc融合蛋白的真核表達質(zhì)粒圖譜。該表達質(zhì)粒全長9063bp，含有10個主要基因片斷，包括1.CMV啟動子；2.目標(biāo)基因HCG-Fc ；3.1RES ；
4.Zeocin抗性篩選基因；5.BGH終止子；6.SV40啟動子；7.DHFR擴增基因；8.SV40終止子；
9.氨節(jié)青霉素抗性基因(Ampicillin) ; 10.ColEl復(fù)制起點(Ori)。
`[0057]圖7.顯示了在7L生物反應(yīng)器中重組HCG-Fc細胞株表達分泌HCG-Fc蛋白的累積趨勢曲線圖。
[0058]圖8.Western bloting結(jié)果顯示了重組HCG-Fc融合蛋白在CHO細胞中的成功表達。非還原膠，Lanel:尿來源的HCG (50KDa) ;Lane2:本發(fā)明的重組HCG_vIgG2Fc融合蛋白(148KDa) ;Lane3:本發(fā)明的重組HCG-vIgGlFc融合蛋白(148KDa) ;Lane4:本發(fā)明的重組HCG-vIgG4Fc 融合蛋白(148KDa)。
[0059]圖9.顯示了純化的重組單鏈和二聚化HCG-Fc融合蛋白在還原條件和非還原條件下的10% SDS-PAGE電泳圖譜。Lanel:非還原膠，重組二聚化HCG_vIgG2Fc融合蛋白(148KDa) Lane2:非還原膠，重組二聚化HCG-vIgGlFc融合蛋白(148KDa) ；Lane3:非還原膠，重組二聚化HCG-vIgG4Fc融合蛋白(148KDa) ；Lane4:還原膠，重組單鏈HCG_vIgG2Fc融合蛋白(74kDa) ;Lane5:還原膠,重組單鏈HCG-vIgGlFc融合蛋白(74kDa) ;Lane6:還原膠，重組單鏈HCG-vIgG4Fc融合蛋白(74kDa)。
[0060]圖10.顯示了純化的重組HCG-Fc融合蛋白、人尿HCG在大鼠體內(nèi)的代謝曲線。a)重組 HCG-vIgG2Fc、重組 HCG_vIgG4Fc 和重組 HCG-vIgGlFc ；b)人尿 HCG。
【具體實施方式】
[0061]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0062]實施例1.構(gòu)建編碼重組HCG-Fc融合蛋白的基因表達載體
[0063]基因序列設(shè)計是基于CHO細胞偏愛密碼子進行優(yōu)化，采用人工合成的方法合成經(jīng)過優(yōu)化的含有編碼HCG蛋白β鏈的信號肽及其成熟肽段和HCGa鏈成熟肽段的融合基因，將所合成的756bp DNA片段插入轉(zhuǎn)移載體如PUC57中的EcoRV限制性酶切位點間，獲得了HCG質(zhì)粒(pHCG)，使用DNA測序方法驗證插入序列的正確性。
[0064]分別人工合成含有BamHI (5’端)和EcoRI (3’端)酶切位點的編碼柔性肽接頭(Linker，檢測“L”)和 Fe 變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc 和 vlgGlFc)片段的融合基因 L_vIgG2Fc、L-vIgG4Fc和L-vIgGlFc。將獲得的融合基因片段分別插入到轉(zhuǎn)移載體如TOC19的BamHI和EcoRI位點間,得到含三種變體的質(zhì)粒,分別為pL-vIgG2Fc、pL_vIgG4Fc和pL_vIgGlFc。通過DNA測序驗證L_vIgG2Fc、L_vIgG4Fc和L-vIgGlFc的基因序列。為制備兩種HCG-L-Fc融合基因，用限制性內(nèi)切酶SpeI和BamHI雙酶切pHCG質(zhì)粒，凝膠電泳后膠回收編碼HCG蛋白β鏈的信號肽及其成熟肽段和HCGa鏈成熟肽段的融合基因片段，經(jīng)純化的上述基因片段分別插入到pL-vIgG2Fc、pL-vIgG4Fc和pL_vIgGlFc質(zhì)粒中肽接頭的5'-端,T4連接酶連接構(gòu)成pHCG-L-vIgG2Fc、pHCG-L_vIgG4Fc和pHCG-L_vIgGlFc質(zhì)粒。所構(gòu)建的融合基因由HCGi3、HCGa、肽接頭和Fe變體基因組成，其核苷酸序列如SEQ ID N0:l、3和5所示，其單鏈結(jié)構(gòu)如圖2a所示，二聚化結(jié)構(gòu)如圖2b所示。
[0065]限制性內(nèi)切酶SpeI / EcoRI 分別雙酶切 pHCG-L_vIgG2Fc、pHCG-L_vIgG4Fc和 pHCG-L-vIgGlFc 質(zhì)粒，DNA 凝膠純化得到 HCG-L-vIgG2Fc、HCG-L_vIgG4Fc 和HCG-L-vIgGlFc片段。將純化好的兩種HCG-L-Fc片段插入到哺乳動物細胞表達質(zhì)粒如P⑶NA3 (Invitrogen)的相應(yīng)酶切位點間，最終獲得含融合基因表達質(zhì)粒 pCDNA3-HCG-vIgG2Fc、pCDNA3-HCG_vIgGlFc 和 pCDNA3-HCG_vIgG4Fc，統(tǒng)稱為pCDNA3-HCG-Fc質(zhì)粒，如圖6所`示。該質(zhì)粒含哺乳動物細胞高效表達外源基因蛋白所需的啟動子CMV ;該質(zhì)粒還含有兩種選擇性標(biāo)記基因，從而在細菌中可以具有氨芐青霉素抗性，在哺乳動物細胞中可以具有博來霉素(zeocin)抗性。此外，當(dāng)宿主細胞是DHFR基因表達缺陷型時，PCDNA3表達載體所含有的小鼠的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在時，能共擴增pHCG-Fc融合基因和DHFR基因。
[0066]通過肽接頭(較佳地為柔性接頭)進行HCG和Fe片段的偶聯(lián)可提高蛋白的生物活性，對本發(fā)明而言，優(yōu)選的是長度為約20個或更少(但不能少于2個)氨基酸的肽接頭，當(dāng)然由I個氨基酸構(gòu)成的肽接頭也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，宜使用含有或由2個或更多選自以下氨基酸構(gòu)成的肽接頭:甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。本發(fā)明實施例的肽接頭含有 Gly-Ser 肽構(gòu)件,其氨基酸序列為 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0067]實施例2.重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物細胞中的穩(wěn)定表達
[0068]將實施例1構(gòu)建的表達質(zhì)粒P⑶NA3-HCG-L-FC轉(zhuǎn)染入DHFR酶缺陷型CHO宿主細胞(CH0-DHFR-)，圖2b顯示了重組二聚化HCG-Fc融合蛋白的示意圖。采用電穿孔方法進行轉(zhuǎn)染，使用 96O μ Fd 電容的Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA)，將其電場設(shè)置為250V，在比色杯內(nèi)的2~5 X IO7個細胞中加入10 μ g用PvuI線性化的質(zhì)粒DNA。在轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基改成含100 μ g / mL Zeocin抗性標(biāo)記基因的生長培養(yǎng)基，獲得經(jīng)抗性初篩的轉(zhuǎn)染子。采用western blotting的方法,用抗HCG抗體檢測HCG-Fc的表達，如圖7。利用DHFR擴增選擇性標(biāo)記基因提高重組二聚化蛋白的表達水平，為此在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，用DHFR基因共擴增轉(zhuǎn)染的重組二聚化蛋白基因。用極限稀釋法亞克隆能在高達10 μ M / mL MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子。對亞克隆細胞系的分泌率作進一步分析。篩選分泌水平超過約10 (較佳地約20) μ g / 106(即百萬)個細胞/24小時的細胞株，獲得穩(wěn)定高表達重組HCG-Fc融合蛋白的細胞株。
[0069]實施例3.重組HCG-Fc融合蛋白的生產(chǎn)和純化
[0070]采用實施例2得到的高產(chǎn)量細胞株，首先在培養(yǎng)皿中進行無血清馴化培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到搖瓶中進行懸浮馴化培養(yǎng)，馴化過程中同時進行培養(yǎng)基的篩選，加入不同的成分觀察細胞的生長狀態(tài)、生長趨勢，以及表達產(chǎn)物的活性和唾液酸等生化指標(biāo)，優(yōu)選的細胞培養(yǎng)條件為:基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mM ManNAc (N-乙?；?D-氨基甘露糖)，該方法可使重組HCG-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20%。馴化成功后，進行細胞擴增，擴增到足夠量，進行7L生物反應(yīng)器監(jiān)測培養(yǎng)，在細胞密度超過IXlO7個/ mL時開始降溫至33°C培養(yǎng)，批次生長周期為20天。用Iml ProteinA柱層析對重組蛋白進行初步純化，測定重組HCG-Fc融合蛋白的表達量，結(jié)果顯示，重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG-vIgG4Fc和重組HCG-vIgGlFc細胞株表達的累積產(chǎn)量分別為1.20g/L、0.89g/L、
0.82g/L(圖 7)。
[0071 ] 重組HCG融合蛋白的純化包括以下步驟:
[0072]DProtein A親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和層析方法，將上清液加樣到磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)平衡的ProteinA柱；待重組融合蛋白結(jié)合于ProteinA后，用PBS洗滌該柱，直至0D280值低于0.01，再用20mM pH為4.0的醋酸鈉緩沖液洗脫結(jié)合的重`組HCG-Fc融合蛋白，最后用ρΗΙΟ.0的IM Tris-HCl緩沖液中和活性收集液。純化的HCG-Fc蛋白純度可達到95%以上。
[0073]2)疏水柱層析:用超濾方法將上述protein A活性收集液更換為20mMTris-HCl-1.5MNaCl (pH8.0)緩沖液，將該樣品加樣到用 20mM Tris-HCl-l.5M NaCl (pH8.0)平衡過的phenyl-6Fast Flow柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mM Tris-HCl-l.35MNaCl (ρΗ8.0)淋洗，最后用 20mM Tris-HCl-0.5M NaCl (ρΗ8.0)緩沖液洗脫。
[0074]Western bloting結(jié)果顯示了重組HCG-Fc融合蛋白在CHO細胞中的成功表達,如圖8所示，在非還原條件下SDS-PAGE膠電泳圖譜，人尿HCG (商業(yè)產(chǎn)品)和本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白分別在50KDa和148KDa顯示相對應(yīng)的目標(biāo)蛋白雜交條帶，驗證了本發(fā)明得到的重組HCG融合蛋白中含有HCG蛋白。圖9是純化的HCG-Fc融合蛋白在還原和非還原條件下的SDS-PAGE膠電泳圖譜。結(jié)果顯示，純化的HCG-Fc蛋白純度可達到98%以上，HCG-Fc在還原條件下的分子量為非還原條件下分子量的50%。經(jīng)N端15個氨基酸序列測定確認其氨基酸序列與SEQ ID NO:2、4和6相同。
[0075]實施例4.重組HCG-Fc融合蛋白的體內(nèi)外活性測定
[0076]本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白(重組HCG_vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc和重組HCG-vIgGlFc)的體外活性(免疫原活性)采用B10CHECK(美國)公司生產(chǎn)的HCG酶免疫定量檢測試劑盒檢測，方法參考試劑盒說明書。體內(nèi)活性采用2010版《英國藥典》中的卵巢增重法進行檢測。蛋白質(zhì)含量測定使用LOWRY定量法。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示量、人尿HCG和重組HCG-Fc融合蛋白(重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc和重組HCG-vIgGlFc)估計效價，用稀釋液(含0.1% BSA, pH7.2±0.2的磷酸鹽緩沖液)將標(biāo)準(zhǔn)品、人尿HCG和重組HCG-Fc融合蛋白配制成含HCGlIU / ml、2IU / ml、4IU / ml高中低三個劑量的工作液。選用19~28日齡，年齡相差不得超過3日，體重相差不得超過10克的SD雄鼠。標(biāo)準(zhǔn)品、人尿HCG組和HCG-Fc組均分為高中低三個劑量，每組6只動物。大鼠頸后皮下注射，每天注射兩次，每次注射體積為0.5ml，連續(xù)注射四天，每天在相同時間給藥。最后一次注射給藥24小時后，按照給藥順序采用脫白法處死動物，取精囊腺，剝離吸干表面水分后稱重，記錄器官重量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品精囊腺增重采用量反應(yīng)平行線法計算人尿HCG和重組HCG-Fc的活性。測得重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc、重組HCG-vIgGlFc和人尿HCG的體外活性分別為 9961IU / ml、9305IU / ml、9521IU / ml 和 8369IU / ml，其體內(nèi)活性分別為 9120IU /ml、8990IU / ml、8780IU / ml和8011IU / ml。結(jié)果表明，本發(fā)明的重組HCG-Fc融合蛋白具有顯著的體內(nèi)外生物學(xué)活性。
[0077]實施例5.重組HCG-Fc融合蛋白的藥代動力學(xué)試驗
[0078]分為重組HCG-vIgG2Fc、重組 HCG_vIgG4Fc、重組 HCG-vIgGlFc、重組 HCG 給藥組和人尿HCG給藥組，每組選用體重200-250g的雄性SD大鼠3只，分別按10000IU / kg給予頸后皮下注射。重組HCG組合人尿HCG組在給藥后Ih、2h、4h、6h、8h、IOh、12h、24h、36h、48h、56h、72h進行眼眶靜脈采血，重組HCG-Fc融合蛋白分別在給藥后lh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、56h、72h、96h、144h、264h、312h、384h、432h、528h 進行眼眶靜脈采血。此外，每組分別另取3只大鼠進行相應(yīng)藥物等劑量靜脈注射給藥，同樣的采血時間點進行采血。血樣經(jīng)3000rpm離心5min后，吸取血清，_20°C保存。，采用ELISA試劑盒(B10CHECK，美國)測定各時間點血漿中HCG免疫活性。使用kinetica4.4軟件，通過統(tǒng)計矩法計算各組主要藥代動力學(xué)參數(shù)。各組藥代動力學(xué)曲線如圖10所示，半衰期結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，人尿HCG在大鼠體內(nèi)的消除半衰期約為15.3h，而本發(fā)明重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG-vIgG4Fc、重組HCG-vIgGlFc融合蛋白的消除半衰期分別為168.33h、166.82h和156.63h，是人尿HCG和重組HCG的10倍以上。將皮下`注射藥物計算得的AUC除以靜脈注射計算所得的AUC，即為絕對生物利用度，其中重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc、重組HCG-vIgGlFc融合蛋白的絕對生物利用度是重組HCG和人尿HCG的2倍以上，結(jié)果提示，和重組HCG和人尿HCG相比，達到同樣療效重組HCG-Fc融合蛋白所需注射次數(shù)大大減少、劑量顯著降低。
[0079]表1重組HCG-Fc融合蛋白的半衰期和生物利用度
[0080]
【權(quán)利要求】
1.重組HCG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含HCG β亞基、HCG α亞基、肽接頭和人IgGFc變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組HCG-Fc融合蛋白，其中所述的HCGii亞基的氨基酸序列是去除了常規(guī)HCGii亞基中的1-18位氨基酸殘基之后的HCGi3 SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；其中所述的HCGa亞基的氨基酸殘基序列是去除了常規(guī)HCGa亞基中的1_24位氨基酸殘基之后的HCGa SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；其中所述的肽接頭含有2_20個氨基酸，所述肽接頭存在于HCG a亞基和人IgG Fe變體之間，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸，優(yōu)選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組HCG-Fc融合蛋白，其中所述的人IgGFe變體選自下組: (i)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3 區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組HCG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4和6所示。
5.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的重組HCG-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQID NO:1、3 和 5 所示。
6.—種權(quán)利要求1的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，其步驟包括: 1)構(gòu)建編碼重組HCG-Fc融合蛋白的基因表達載體: 采用人工合成方法獲得編碼HCG-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳動物細胞表達載體，獲得含有HCG-Fc融合蛋白基因的表達質(zhì)粒； 2)重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩(wěn)定表達: 將含有HCG-Fc融合蛋白的表達載體轉(zhuǎn)染到哺乳動物宿主細胞，篩選穩(wěn)定表達HCG-Fc融合蛋白的細胞株； 3)高密度細胞培養(yǎng)重組HCG-Fc融合蛋白: 將上述篩選到的穩(wěn)定細胞株轉(zhuǎn)入搖瓶或細胞反應(yīng)罐進行大規(guī)模培養(yǎng)，當(dāng)細胞密度達到I X IO7個/ mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養(yǎng)直至表達產(chǎn)量不再增加； 4)重組HCG-Fc融合蛋白的純化制備: a)ProteinA親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和ProteinA柱層析； b)疏水層析柱純化:經(jīng)疏水層析純化進一步去除上述ProteinA純化后目標(biāo)蛋白中的雜質(zhì)； 所述的疏水柱包括 Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B, Phenyl Sepharose CL-4B。優(yōu)選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所 述的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟I)中所述的基因表達載體為 pCDNA3、pCMV / ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT 或 pCMV-DHFR，優(yōu)選，pCDNA3 ;其中步驟2)中所述的細胞轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔轉(zhuǎn)染方法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)融合，優(yōu)選，電穿孔轉(zhuǎn)染方法；所述的哺乳動物宿主細胞包括010，冊1(293、8皿、吧0和3?2 /O細胞，優(yōu)選，CHO細胞，更優(yōu)選，DHFR酶缺陷型CHO-懸浮細胞(DHFR-CHO)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟3)中還包括在培養(yǎng)基中加入添加劑，優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mMManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1-8任意一項權(quán)利要求所述的重組HCG-Fc融合蛋白。
10.權(quán)利要求1的重組H CG-Fc融合蛋白在制備動物繁殖領(lǐng)域藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/20GK103804498SQ201310617155
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】侯永敏, 雷瑤, 鄧衡露 申請人:廣州諾新生物技術(shù)有限公司