犬細小病毒單域抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種犬細小病毒單域抗體及其制備方法和應(yīng)用，所述犬細小病毒單域抗體具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，是以犬細小病毒滅活疫苗免疫羊駝，取外周血得到羊駝抗犬細小病毒血清；提取外周血中RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA；特異引物擴增純化VHH片段；將VHH片段與噬菌粒載體連接并轉(zhuǎn)化TG1，構(gòu)建犬細小病毒單域抗體庫；利用犬細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2富集所述抗體庫，導入表達菌株E.coilHB2151，IPTG誘導具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH表達。本發(fā)明制備的犬細小病毒單域抗體檢測活性15μg/ml，檢測靈敏度250ng/ml，可作為藥物應(yīng)用于犬細小病毒病犬的治療中。
【專利說明】犬細小病毒單域抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床獸醫(yī)及抗體工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及到一種病毒抗體，特別是涉及一種主要依托羊駝的重鏈抗體來實現(xiàn)其生物表達的犬細小病毒單域抗體，以及該抗體的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]犬細小病毒病由犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起，以發(fā)病率高、死亡率高、傳染性強為特點，一年四季皆可發(fā)生，出血性腸炎型和心肌炎型犬細小病毒病的死亡率分別為10%~50%、60%~100%，可造成嚴重經(jīng)濟損失。預防犬細小病毒病的疫苗主要有:滅活苗、弱毒苗和多聯(lián)苗，優(yōu)化的免疫程序可取得較好的免疫效果。但是對市場上疫苗的免疫效果進行檢測調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，僅20%的疫苗能產(chǎn)生100%保護力的抗體。資料表明，我國寵物犬數(shù)量達1.5億，隨著寵物犬的數(shù)量增多，研究犬細小病毒病的診斷和防治具有重要意義。
[0003]基于抗原與抗體特異性結(jié)合的診斷試劑盒，可檢測抗原，也可檢測抗體，敏感性高、特異性強、穩(wěn)定性好、操作簡便快速、結(jié)果易于分析判定。特異性的抗體對于診斷試劑盒的生產(chǎn)至關(guān)重要，目前常用抗體有單克隆抗體、多克隆抗體。在治療方面，早期應(yīng)用犬細小病毒單克隆抗體及犬細小病毒抗血清等進行特異性治療，可以取得較好的效果。但單克隆抗體規(guī)?；a(chǎn)耗時長，抗血清規(guī)?；a(chǎn)不能保證市場需求而且質(zhì)量不穩(wěn)定，而且單克隆抗體和抗血清的免疫原性強，在治療過程中都存在副作用。因此，研究相關(guān)特異性強、親和力高、免疫原性低、可規(guī)?；a(chǎn)的抗體具有重要意義。
[0004]普通抗體IgG(免疫球蛋白G)是血清中最重要的抗體，約占血清中免疫球蛋白總量的75%~80%，在體液免疫中起著“主力免疫”作用。IgG具有2條重鏈(H鏈)和2條輕鏈(L鏈)，整個抗體分子分為恒定區(qū)(C區(qū))和可變區(qū)(V區(qū))，分子量為150~160kDa。研究表明，羊駝血清中除了普通抗體IgG，有近一半的IgG為重鏈抗體，只具有重鏈可變區(qū)(VH)、一個鉸鏈區(qū)和兩個恒定區(qū)(CH2和CH3`)，而對重鏈抗體的可變區(qū)克隆構(gòu)建只有一個重鏈可變區(qū)的抗體稱為單域抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)，分子量僅為15kD，具有分子量小、結(jié)構(gòu)單一、穿透性好、特異性強、親和力高以及可溶性高、穩(wěn)定性強、易克隆、高表達、易純化等特點。因此，VHH可減少治療過程中的副作用，可作為生物傳感器診斷用靶標試劑，可用于構(gòu)建免疫融合物、進行靶向治療，可用于商品化大規(guī)模生產(chǎn)。目前，抗體在疾病的治療方面僅限于細胞表面靶標，全抗體由于分子結(jié)構(gòu)復雜，在細胞內(nèi)表達困難，限制了其在細胞內(nèi)的應(yīng)用，VHH免疫原性低，很難激發(fā)T細胞的免疫反應(yīng)，可以作為治療性抗體而長期用藥?？傊琕HH作為一種小型化的基因工程抗體，獨特的理化和生物學特性使其在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)和疾病診斷治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]隨著對基因表達的深入研究，抗體庫的出現(xiàn)為抗體制備提供了一種新的手段，利用抗體庫技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)抗體的規(guī)?；苽洌嚓P(guān)的噬菌體展示技術(shù)也是近年來建立和發(fā)展的利用噬菌體表達外源基因的一項新技術(shù)，是一種基因表達產(chǎn)物和親和篩選相結(jié)合的技術(shù)，其基本原理是將目的基因與編碼噬菌體外殼蛋白的基因相連，插入到噬菌體的表達載體上，從而使多肽或蛋白質(zhì)與外殼蛋白融合表達并展示在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白質(zhì)可保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性；利用噬菌體在大腸桿菌系統(tǒng)易于分離擴增，可以通過與配體的結(jié)合選擇出表達相應(yīng)受體的噬菌體顆粒，通過“吸附-洗脫-擴增”的富集過程，可從中篩選出特異性抗體基因，并可直接測定所展示的多肽或蛋白質(zhì)的某些生物學活性。這些技術(shù)在抗體工程中已有應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有犬細小病毒單克隆抗體及犬細小病毒抗血清等特異性治療制劑的缺陷，提供一種分子量小、免疫原性低、特異性強、穩(wěn)定性強、易克隆表達的犬細小病毒單域抗體，以及該犬細小病毒單域抗體的制備方法和應(yīng)用。
[0007]為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，從犬細小病毒滅活疫苗免疫羊駝的外周血中提取RNA，構(gòu)建CPV-VHH犬細小病毒單域抗體庫，并從抗體庫中篩選獲得具有生物活性的單域抗體。
[0008]本發(fā)明的犬細小病毒單域抗體具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明上述犬細小病毒單域抗體采用以下步驟進行制備:
1)、提取經(jīng)犬細小病毒免疫后羊駝外周血中的RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA;特異引物擴增純化犬細小病毒單域抗體VHH片段；
2)、犬細小病毒單域抗體VHH片段與噬菌粒載體連接構(gòu)建噬菌體重組載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1，構(gòu)建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫；
3)、以犬細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2加入活化的犬細小病毒噬菌體單域抗體庫中，甘氨酸溶液競爭性洗脫，富集噬菌 粒重組載體導入感受態(tài)細胞疋HB2151菌株中，IPTG誘導產(chǎn)生具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH蛋白。
[0010]更具體的，步驟1)中是分別以重鏈可變區(qū)特異引物CALL01/ CALL02和VHH特異引物VHH For2/VHH Rev2進行第一次和第二次PCR擴增，回收純化犬細小病毒單域抗體VHH片段。
[0011]步驟2)中，是先以犬細小病毒單域抗體VHH片段與質(zhì)粒載體PMD-18T simple連接構(gòu)建質(zhì)粒表達載體PMD-18T-VHH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，回收純化VHH，與噬菌粒載體構(gòu)建噬菌體重組載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1，構(gòu)建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫。
[0012]其中，所述的噬菌粒載體為pCANTAB 5E，構(gòu)建的噬菌體重組載體為pCANTAB5E-VHH。
[0013]本發(fā)明獲得的犬細小病毒單域抗體可以作為治療藥物，應(yīng)用于犬細小病毒病犬的治療中。
[0014]本發(fā)明基于羊駝獨特的重鏈抗體，利用抗體庫技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)，以犬細小病毒免疫羊駝、建立犬細小病毒單域抗體庫，并從中獲得了具有生物活性的犬細小病毒單域抗體，可實現(xiàn)抗體的規(guī)?；苽?。
[0015]羊駝血清中除了普通抗體IgG，有近一半的IgG為重鏈抗體。以皮下多點免疫法對兩只健康成年羊駝進行犬細小病毒免疫，4個免疫周期后，抗血清效價高于1:64。試驗表明，以飽和硫酸銨鹽析法從羊駝抗犬細小病毒抗血清中初步分離IgG，通過蛋白G親和層析可以分離純化出IgGl和IgG3，分子量分別在90kDa和180kDa左右；未結(jié)合IgG通過蛋白A親和層析可以分離出IgG2，分子量在75kD左右。純化后的羊駝IgG各亞型SDS-PAGE電泳
條帶單一。
[0016]本發(fā)明利用細胞形態(tài)學和噻唑藍染色，試驗觀察本發(fā)明制備的羊駝抗犬細小病毒抗血清對F81細胞生長及增殖抑制率的影響，結(jié)果表明，羊駝抗犬細小病毒抗血清組、犬細小高免血清組細胞生長旺盛，緊密相連，細胞均質(zhì)而透明；PBS組細胞數(shù)量減少、細胞游離、呈拉網(wǎng)狀態(tài)。細胞增殖抑制率檢測表明，羊駝抗犬細小病毒抗血清組、犬細小高免血清組、PBS組與病毒同時作用于F81細胞96h后，細胞增殖抑制率分別為3.9%, 6.2%, 80.8%。
[0017]本發(fā)明制備的基于羊駝重鏈抗體表達的犬細小病毒單域抗體具有分子量小、結(jié)構(gòu)單一、穿透性好、特異性強、親和力高等特點。本發(fā)明利用五輪“吸附-洗脫-擴增”富集法，對噬菌體抗體庫進行篩選富集，使噬菌體抗體庫富集增長了近4000倍，陽性率達到92%。以ELISA檢測犬細小病毒單域抗體的檢測活性為15Pg/ml，檢測靈敏度為250ng/ml。
[0018]本發(fā)明制備的犬細小病毒單域抗體制劑與常規(guī)治療相比，可使死亡率降低，治愈率提高，并可縮短治療周期，使治愈一只犬細小病犬的費用降低10%~20%。
【具體實施方式】
[0019]下面通過實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。應(yīng)該理解的是，下述實施例僅用于更加清楚地解釋本發(fā)明，但不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的保護范圍內(nèi)，對其進行的無實質(zhì)性變化的改變、修改或等效變更，都應(yīng)落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0020]1、犬細小病毒滅活疫苗免疫羊駝
取CPV病毒液置入三角燒瓶中，加分析純甲醛稀釋至終濃度0.25wt%,邊加邊搖勻，加塞子并用滅菌紗布包之，37°C作用24~48h ;去塞子，用紗布包三角燒瓶口，間隔搖動，至甲醛味散盡。
[0021]等量病毒液與弗氏完全佐劑乳化，檢測效價，作為第一次免疫疫苗；等量病毒液與弗氏不完全佐劑乳化，用血凝試驗(HA試驗)檢測其血凝價，測得結(jié)果為29，以此作為疫苗對羊駝進行免疫。
[0022]健康成年雄性羊駝兩頭(B014、D007)，皮下多點免疫，每隔10天免疫一次，共分四次。每次免疫前頸總動脈取血5mL，離心后收集上層血清，4°C保存。每次免疫完后,血凝抑制試驗(HI試驗)測抗體效價，效價高于1:64后頸總動脈取血10mL，離心后收集上層血清，獲得羊駝抗犬細小病毒血清。
[0023]2、構(gòu)建犬細小病毒單域抗體庫
向250 μ L新鮮全血中加入1000 μ L紅細胞裂解液，12000r/min離心30s，留下的白細胞團中加入ImL trizol,Trizol法提取外周血RNA,用NanoDrop ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計測定RNA濃度和OD值，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。
[0024]以RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,以β-actin For、β-actin Rev為引物,擴增內(nèi)參基因β -actin檢測cDNA有效性。
[0025]β -actin For:5，-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3，。
β-actin Rev:5’ -AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’。
[0026]以cDNA為模板，用重鏈可變區(qū)特異引物CALL01、CALL02為引物進行第一次擴增，特異擴增產(chǎn)物為600bp的VHH-CH2和900bp的VH-CH1-CH2。
[0027]CALL01:5’ -GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’。
[0028]CALL02:5’ -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’。
[0029]凝膠回收試劑盒回收純化VHH-CH2，以其為模板，VHH特異引物VHH For2、VHH Rev2為引物進行第二次擴增，特異擴增產(chǎn)物為400bp的VHH?；厥占兓毿〔《締斡蚩贵wVHH片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
[0030]VHH For2:5， -CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCATGGCCGAKGTSCAGCT-3，。
[0031 ] VHH Rev2:5，-GTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCWGGGTCC-3，。
[0032]凝膠回收試劑盒回收純化犬細小病毒單域抗體VHH，于10 μ L連接體系中連接VHH與質(zhì)粒載體PMD-18T simple，構(gòu)建連接物質(zhì)粒表達載體pMD-18T-VHH。以連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，并以藍白斑篩選挑取白色單克隆菌落于5mL LB培養(yǎng)基中，37°C，200r/min，振蕩培養(yǎng)12~16h，質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液質(zhì)粒，引物VHH For2、VHH Rev2進行PCR鑒定，并進行Not I和Sfi I酶切鑒定。
[0033]Sfi I/Not I雙酶切質(zhì)粒表達載體pMD-18T-VHH和噬菌粒載體pCANTAB 5E，回收純化的VHH，與噬菌粒載體pCANTAB 5E連接構(gòu)建噬菌體重組載體pCANTAB 5E-VHH。乙醇沉淀法純化連接產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣法制備的感受態(tài)大腸桿菌TG1，挑取單克隆菌落，PCR鑒定和酶切鑒定后，陽性克隆質(zhì)粒第2次轉(zhuǎn)化TG1，挑取單克隆菌落進行PCR鑒定。取二次轉(zhuǎn)化的菌液進行10倍、100倍、1000倍滴度稀釋，涂布于平板上培養(yǎng)，37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日計菌落數(shù)，100倍稀釋菌生長良好，單克隆明顯，100 μ L的涂布菌液生長出約200個單克隆。隨機挑取單克隆菌株，PCR鑒定陽性率為90%，有效庫容1.8Χ 107。
[0034]3、犬細小病毒單域抗體表達
利用抗原抗體親和吸附原理，以犬細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2為捕捉抗原，加入活化的犬細小病毒噬菌體單域抗體上清，室溫靜置90min以上，中間不斷反復搖動96孔板，棄去未結(jié)合噬菌體，用PBS/Tween20(0.05%)洗滌，甘氨酸-鹽酸洗脫緩沖液競爭性洗脫，以五輪“吸附-洗脫-擴增”富集法對噬菌體抗體庫進行篩選富集，噬菌體抗體庫原始庫容1.8X107cfu,活化庫容3.6X10ncfu,第一次到第五次富集庫容分別為7.8X10ncfu,
1.07X1012cfu, 3.24X1012cfu,9.8X1013cfu,3.lX1015cfu。
[0035]第五次富集結(jié)束后，取噬菌體抗體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TG1菌過夜培養(yǎng)，隨機挑選平板上單菌落進行PCR檢測，陽性率92%。
[0036]噬菌體抗體庫(pCANTAB 5E-VHH)和噬菌粒(pCANTAB 5E)分別轉(zhuǎn)染HB2151感受態(tài)細胞，挑取單菌落培養(yǎng)，進行菌液PCR實驗，同時提取質(zhì)粒，用Sfi I/Not I雙酶切pCANTAB 5E-VHH噬菌粒，檢驗導入正確目的載體。
[0037]富集后的噬菌體重組載體pCENTAB 5E-VHH導入到感受態(tài)細胞疋co7i HB2151菌株中，由于該宿主細菌無抑制琥珀終止密碼子的功能，琥珀終止密碼子正常作用，在IPTG誘導下大量表達犬細小病毒單域抗體VHH，產(chǎn)生具有生物活性的可溶性蛋白質(zhì)。
[0038]利用pCENTAB 5E載體的融合蛋白質(zhì)標簽E_tag特點，設(shè)計一抗為兔源Ant1-E-Tag, 二抗為羊抗兔IgG-HRP,進行western-blot檢測，蛋白樣品中都含有Ε-Tag標簽的目的蛋白。
[0039]96孔板包被VP2·蛋白(終濃度15Pg/ml)，將重組表達的VHH蛋白進行梯度稀釋，ELISA檢測單域抗體活性15Pg/ml。用不同濃度的VP2蛋白包被96孔板，加入VHH蛋白50μ1，ELISA檢測單域抗體的靈敏度為250ng/ml。
[0040]將大量表達且經(jīng)檢測具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH真空冷凍干燥，分裝安瓿瓶中封口保存。
[0041]以上述制備的羊駝抗犬細小病毒單域抗體對20只犬細小病犬進行治療，觀察其治療效果，常規(guī)治療組平均連續(xù)治療9天后，死亡率40%，存活率60% ；VHH單域抗體治療組平均連續(xù)治療8天后，死亡率20%，存活率為80%。
[0042]我國寵物犬數(shù)量達1.5億，犬細小可造成嚴重經(jīng)濟損失。本發(fā)明制備的犬細小病毒單域抗體用于犬細小病犬的治療，常規(guī)治療組每只病犬治愈期間(9天)總計費用800元,VHH單域抗體治療組每只病犬治愈期間(8天)總計費用640~720元。與常規(guī)治療相t匕，VHH單域抗體治療可使死亡率降低，治愈率提高，可縮短治療周期，使治愈一只犬細小病犬的費用降低10%~20% 。
【權(quán)利要求】
1.犬細小病毒單域抗體，具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1犬細小病毒單域抗體的制備方法，采用以下步驟進行制備:1)、提取經(jīng)犬細小病毒免疫后羊駝外周血中的RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA;特異引物擴增純化犬細小病毒單域抗體VHH片段；2)、犬細小病毒單域抗體VHH片段與噬菌粒載體連接構(gòu)建噬菌體重組載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1，構(gòu)建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫；3)、以犬細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2加入活化的犬細小病毒噬菌體單域抗體庫中，甘氨酸溶液競爭性洗脫，富集噬菌粒重組載體導入感受態(tài)細胞疋HB2151菌株中，IPTG誘導產(chǎn)生具有生物活性的犬細小病毒單域抗體VHH蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述步驟1)中，分別以重鏈可變區(qū)特異引物CALL01/ CALL02和VHH特異引物VHH For2/VHH Rev2進行第一次和第二次PCR擴增，回收純化犬細小病毒單域抗體VHH片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是先以犬細小病毒單域抗體VHH片段與質(zhì)粒載體pMD-18T simple連接構(gòu)建質(zhì)粒表達載體pMD-18T_VHH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，回收純化VHH，與噬菌粒載體構(gòu)建噬菌體重組載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1，構(gòu)建犬細小病毒噬菌體單域抗體庫。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的制備方法，其特征是所述的噬菌粒載體為pCANTAB5E。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的制備方法，其特征是所述構(gòu)建的噬菌體重組載體為pCANTAB 5E-VHH。
7.權(quán)利要求1犬細 小病毒單域抗體在制備治療犬細小病毒病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K16/08GK103665152SQ201310636895
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】段智變, 孫耀貴, 程志學, 員世宇, 詹俊杰, 楊妍麗, 李小茜 申請人:山西農(nóng)業(yè)大學