抗藍(lán)舌病病毒血清16型vp2蛋白單克隆抗體btv16-3g10及其識別的b細(xì)胞表位多肽和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗藍(lán)舌病病毒血清16型VP2蛋白單克隆抗體BTV16-3G10及其識別的B細(xì)胞表位多肽和應(yīng)用，屬于藍(lán)舌病防治領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，間接免疫熒光試驗顯示該單克隆抗體只與BTV16呈現(xiàn)特異性反應(yīng)，而不與藍(lán)舌病病毒其他血清型，茨城病病毒，中山病病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。進(jìn)一步的，本發(fā)明利用截短表達(dá)抗原短肽和肽掃描技術(shù)鑒定出該抗體所識別的BTV16-VP2蛋白B細(xì)胞表位多肽。本發(fā)明的單克隆抗體以及該單克隆抗體所識別的BTV16-VP2蛋白B細(xì)胞表位可用于制備成BTV16型特異性鑒別診斷試劑，并為BTV表位標(biāo)記疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】抗藍(lán)舌病病毒血清16型VP2蛋白單克隆抗體BTV16-3G10及其識別的B細(xì)胞表位多肽和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體，尤其涉及一株分泌抗BTV16 VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其所分泌的單克隆抗體；本發(fā)明還涉及一個B細(xì)胞表位多肽，尤其涉及由上述單克隆抗體所識別的BTV16 VP2蛋白B細(xì)胞表位多肽；本發(fā)明還涉及上述雜交瘤細(xì)胞株、單克隆抗體以及B細(xì)胞表位多肽在制備診斷或預(yù)防BTV16感染藥物中的應(yīng)用，屬于藍(lán)舌病的防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]藍(lán)舌病(Bluetongue, BT)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的反芻動物蟲媒傳染病。BTV能感染大多數(shù)家養(yǎng)的和野生的反芻動物，因動物的易感性不同表現(xiàn)出不同的臨床癥狀。不同流行地區(qū)易感動物的死亡率差別很大，一般都可達(dá)到30%，在某些地區(qū)甚至更高。由于BT對世界經(jīng)濟的影響，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將BT列為法定通報性疾病，我國將其劃定為一類動物疫病。BT所造成的相關(guān)經(jīng)濟損失一方面通過直接降低動物的生產(chǎn)能力和增加動物的死亡率，更重要的是由于控制動物的流動、控制牛精液出口以及實施這些控制措施所需的費用而間接造成的動物貿(mào)易損失。
[0003]BT最早于1876年發(fā)現(xiàn)于南非的綿羊，1902年被命名為“抗瘧疾綿羊卡他熱”，1905年被正式命名為“藍(lán)舌病”。20 世紀(jì)初，由于高度易感的非本土綿羊品種的引進(jìn)致使BT開始在非洲蔓延。BT被認(rèn)為是一種地方流行性疾病，位于緯度40° S和53° N的美洲、非洲、亞洲、澳洲是高發(fā)地區(qū)，僅1996年造成全球范圍內(nèi)的經(jīng)濟損失高達(dá)30億美元。1979年我國首次在云南綿羊發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病，隨后在29個省均檢出BT陽性家畜，如山西(1991)、甘肅(1990)、四川(1988)、安徽(1985)、湖北(1983)等。2006年以來，隨著氣候變暖，BT尤其是BTV8在歐洲許多國家如比利時、荷蘭、法國、德國等爆發(fā)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，同時也擴大了 BTV的傳統(tǒng)分布范圍。覃紹敏等(2011)對廣西11個地區(qū)的山羊BT進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明陽性率為6.3%-45.1%，平均陽性率為20.5%。
[0004]BTV血清型眾多，目前已發(fā)現(xiàn)24個血清型，而隨著氣候變化新的血清型不斷出現(xiàn)，如最近又相繼分離到的BTV25 (瑞士，2008年)和BTV26 (科威特，2011年)。然而由于各個血清型之間交叉免疫保護(hù)性差，使得疫苗免疫錯綜復(fù)雜不能起到很好的保護(hù)作用，到目前為止尚未有有效的疫苗。早期準(zhǔn)確診斷，早期預(yù)防，是防止本病爆發(fā)的最有效方法。所以，必須加強我國BT的相關(guān)工作的研究，做好必要的技術(shù)儲備。
[0005]BTV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus),其基因組為分節(jié)段的線性雙鏈RNA，包含10個節(jié)段，大小約為19kb，共編碼11種蛋白。其中VP2蛋白位于病毒的最外側(cè)，呈長釘狀突出病毒表面，參與病毒對哺乳動物細(xì)胞的吸附和侵入，具有血凝活性，中和活性，是決定血清特異性的主要抗原。因此，篩選出一株可以分泌型特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并鑒定出其所分泌的單克隆抗體所識別的BTV16-VP2蛋白特異性B細(xì)胞表位對BTV16型特異性診斷方法的建立，及疾病的預(yù)防或治療具有重要作用，并為BTV表位標(biāo)記疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的之一是提供一株分泌抗藍(lán)舌病病毒血清16型(Bluetongue virus16，BTV16) VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0007]本發(fā)明目的之二是提供一種由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，該單克隆抗體可與BTV16發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與藍(lán)舌病病毒其他血清型(BTV1-15，17-24)，茨城病病毒(Ibaraki virus, IBAV),中山病病毒(Chuzan virus, CV)產(chǎn)生交叉反應(yīng);
[0008]本發(fā)明目的之三是鑒定一個BTV16-VP2蛋白的BTV16型特異性B細(xì)胞表位。
[0009]本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0010]本發(fā)明通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的BTV16 VP2重組蛋白為免疫原免疫Balb/c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。此外，本發(fā)明還利用真核重組VP2蛋白作為包被抗原經(jīng)間接ELISA方法篩選得到一株穩(wěn)定分泌抗BTV16 VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為BTV16-3G10，分類命名是:分泌抗BTV16 VP2蛋白單克隆抗體3G10的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；其微生物保藏號是=CGMCC N0.8153，保藏時間:2013年8月28日；保藏單位是:中國普通微生物菌種保藏管理中心；保藏地址是:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，所述的單克隆抗體BTV16-3G10其所特異性識別的BTV16 VP2蛋白線性B細(xì)胞表位的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示(34EWSGHDVTEIPNR 觀 F49)。
[0011]本發(fā)明還提供了一種由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，其命名為BTV16-3G10, Western blot檢測結(jié)果表`明BTV16-3G10可與BTV16-VP2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與BHK-21細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)，間接免疫熒光試驗(IFA)顯示該單克隆抗體只與BTV16呈現(xiàn)特異性反應(yīng)，而不與藍(lán)舌病病毒其他血清型(BTV1-15，17-24)，茨城病病毒(IBAV),中山病病毒(CV)產(chǎn)生交叉反應(yīng)。
[0012]本發(fā)明利用原核表達(dá)短肽技術(shù)和肽掃描技術(shù)對BTV16-3G10所識別的BTV16-VP2蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行了鑒定，最終將該表位精確定位為:34EWSGHDVTEIPNR觀F49 (SEQ IDN0.1所示)。同時，序列比對結(jié)果顯示34EWSGHDVTEIPNR觀F49在BTV16型不同地區(qū)分離株中是高度保守的，而在藍(lán)舌病病毒其他血清型以及和藍(lán)舌病病毒同處于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的其他代表病毒之間幾乎沒有保守性，說明該表位為BTV16型的特異性表位。
[0013]此外，本發(fā)明還提出了所述雜交瘤細(xì)胞株在制備診斷BTV16病毒感染藥物中的應(yīng)用。及
[0014]所述的單克隆抗體在制診斷或預(yù)防BTV16病毒感染藥物中的應(yīng)用。以及
[0015]所述的BTV16-VP2 蛋白線性 B 細(xì)胞表位多肽 34EWSGHDVTEIPNR觀F49 (SEQ ID N0.1所示)在制備診斷BTV16感染藥物中的應(yīng)用。
[0016]綜上所述，本發(fā)明制備并鑒定出了一種特異性針對BTV16-VP2蛋白的單克隆抗體，本發(fā)明的單克隆抗體以及該單克隆抗體所識別的BTV16-VP2蛋白病毒特異性B細(xì)胞表位多肽為建立BTV16型特異性免疫學(xué)檢測方法和VP2蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0017]圖1為SDS-PAGE鑒定重組VP2蛋白的真核表達(dá)與純化；
[0018]M:蛋白Marker ；1:野生型桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞裂解液；2:未感染桿狀病毒的Sf9細(xì)胞裂解液；3:感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞裂解液；4:純化的BTV-16VP2蛋白；5:純化BTV-16 VP2蛋白的洗液(不含BTV-16 VP2蛋白，但含有其他雜蛋白)；
[0019]圖2為應(yīng)用Western blot試驗檢測單克隆抗體BTV16-3G10與BTV16-VP2蛋白的反應(yīng)性結(jié)果；
[0020]1:接種有野生型桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞裂解液；2:通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化的BTV16VP2重組蛋白；3:BTV16感染的BHK-21細(xì)胞裂解沉淀；4:BHK-21細(xì)胞裂解沉淀；M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker
[0021]圖3為應(yīng)用IFA試驗檢測單克隆抗體BTV16-3G10與BTV16的反應(yīng)性結(jié)果；
[0022]a:MAb BTV16-3G10;b:BTV16型鼠陽性血清對照；c:鼠陰性血清對照
[0023]圖4為原核表達(dá)重組MBP短肽與單克隆抗體BTV16-3G10反應(yīng)性的間接ELISA分析；
[0024]圖5為通過肽掃描技術(shù)合成短肽與單克隆抗體BTV16-3G10反應(yīng)性的間接ELISA分析；
[0025]圖6為所鑒定B細(xì)胞表位的保守性及特異性分析；
[0026]A:單克隆抗體BTV16-3G10所識別的B細(xì)胞在BTV1-26間的保守性分析；B:單克隆抗體BTV16-3G10 所識別的B細(xì)胞在呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬內(nèi)代表病毒間的保守性分析；
[0027]圖7為BTV16型不同地區(qū)分離毒株的VP2蛋白上與BTV16-3G10所識別的B細(xì)胞表位相應(yīng)區(qū)段不完全一致的短肽與BTV16-3G10的間接ELISA分析。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0029]主要實驗材料和來源
[0030]1.細(xì)胞與病毒
[0031]BHK-21細(xì)胞、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以及BTV1-24型毒株、茨城病病毒、中山病病毒由本研究室保存。
[0032]2.主要試劑
[0033]胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；50%PEG、50XHAT、50XHT、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自Sigma公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋公司；鄰苯二胺(OPD)購自哈爾濱博瑞生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker購自Fermentas公司；SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒購于Southern Biotechnology公司。
[0034]3.實驗動物[0035]6-8周齡BALB/c小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。
[0036]實施例1BTV-16VP2蛋白真核表達(dá)及純化
[0037]1、引物設(shè)計
[0038]真核表達(dá)采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，根據(jù)GenBank中登錄的BTV16的L2基因序列(JN671907)設(shè)計PCR擴增引物，BTV16L2-22F:5/ -ACGAATTCATGGAGGAGCTAGTTATACC-3/ (EcoR I) ；BTV16L2-2901R:5/ -CCGTCGACTTAAATATTTAGAAGCTTCGTG-3' (Sail)。
[0039]2、BTV-16VP2蛋白的真核表達(dá)載體構(gòu)建及VP2蛋白的真核表達(dá)與純化
[0040]首先利用引物BTV16L2-22F與BTV16L2-2901R擴增BTV-16 VP2基因(擴增片段大小為2896bp)，并進(jìn)行膠回收。然后利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I對回收獲得的VP2基因與桿狀病毒的穿梭載體pFastBaC?HT A分別進(jìn)行雙酶切。利用T4DNA快速連接酶將已酶切的VP2基因和pFastBac?HT A進(jìn)行連接，在DNA連接儀中25°C連接5min。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37°C恒溫倒置過夜培養(yǎng)。隨機挑取單個菌落，分別接種到5mL LB液體培養(yǎng)基(Amp+ΙΟΟμ g/mL)中，37°C過夜培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒進(jìn)行初步篩選，空載體pFastBac?HT A作為陰性對照。對疑似重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切鑒定與PCR鑒定。將上述鑒定全部正確的含有陽性重組質(zhì)粒的菌液進(jìn)行測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為 pFast_VP2。
[0041]將重組質(zhì)粒pFast_VP2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DHlOBac?，首先將_80°C保存的感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac? (100 μ L)置于冰上融化；將重組質(zhì)粒pFast_VP2 I μ L加入到融化的DHlOBac?中混勻，冰浴30min后迅速42°C熱激60s，再冰浴5min。在超凈臺內(nèi)向混合物中加入室溫的無抗生素的SOC液體培養(yǎng)基900μ L，37°C震蕩培養(yǎng)4h。將上述菌液分別做10倍、100倍稀釋，將原倍、10倍以及100倍稀釋的菌液各100 μ L分別涂板(LA-Bac平板即含50 μ g/mL卡那霉素、7 μ g/mL慶大霉素、10 μ g/mL四環(huán)素、100 μ g/mL X-gal和40 μ g/mL IPTG的LB固體培養(yǎng)基)上，37°C恒溫倒置培養(yǎng)48h，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。隨機挑選單個白色菌落劃線培養(yǎng)接種到新的LA-Bac平板上做進(jìn)一步的培養(yǎng)鑒定，挑取白色菌落分別接種至5mL含50 μ g/mL卡那霉素、7 μ g/mL慶大霉素、10 μ g/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，同時挑取藍(lán)色菌落作為陰性對照，37°C培養(yǎng)24h后分別提取重組桿粒與空桿粒。PCR鑒定正確的重組桿粒，命名為BAC-VP2，用于轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒。
[0042]利用桿狀病毒轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Reagent，將重組桿粒BAC-VP2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得帶有VP2基因的重組桿狀病毒BACV-VP2，分別設(shè)立野生型桿粒轉(zhuǎn)染與單獨的轉(zhuǎn)染試劑作為陰性對照。具體操作如下:
[0043](I)使用Sf9細(xì)胞鋪板。六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔Sf9細(xì)胞(細(xì)胞活力在97%以上)
4.5X105個/mL，于27°C恒溫培養(yǎng)箱中至少培養(yǎng)lh，使細(xì)胞完全貼壁。
[0044]( 2 )轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備(每孔用量):
[0045]a:A液使用Sf9基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Grace粉(IXlL)I瓶、酵母提取物3.3g、水解乳蛋白
3.3g、碳酸氫鈉(NaHC03) 0.35g)將I μ g重組桿粒BAC-VP2稀釋至100 μ L中;
[0046]b:B液使用Sf9基礎(chǔ)培養(yǎng)液將6 μ L Cellfectin Reagent轉(zhuǎn)染試劑稀釋至100μ L ；
[0047]c:Α液與B液混勻后，室溫孵育15_45min。
[0048]對照組1:將I μ g野生型桿粒加入到100 μ L Sf9基礎(chǔ)培養(yǎng)液中與B液混合；[0049]對照組2:只加入B液。
[0050](3)轉(zhuǎn)染時，先棄掉細(xì)胞培養(yǎng)板中的原來的Sf9完全培養(yǎng)液，再用Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，2mL/次，共清洗2次。
[0051](4)將800 μ L Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入到已孵育好的A液和B液的混合物中，然后混勻并將混合好的約ImL的脂類-DNA復(fù)合物加入到Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)板中。
[0052](5) 27°C恒溫孵育5h，棄掉轉(zhuǎn)染液，加入新的Sf9完全培養(yǎng)液(0.1%1000X雙抗，10%胎牛血清(FBS)，89%Sf9昆蟲細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液)，3.0mL/孔，27°C下孵育72h或至病變出現(xiàn)。收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清即為一代重組桿狀病毒。然后取一代重組桿狀病毒繼續(xù)接種Sf9昆蟲細(xì)胞，摸索出最適合的Sf9昆蟲細(xì)胞生長密度，最佳重組桿狀病毒代次以及最適宜的收毒時間。
[0053]將重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞沉淀經(jīng)超聲波裂解并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示重組BTV16 VP2蛋白在Sf9細(xì)胞中獲得表達(dá)，分子質(zhì)量約為llOku，與預(yù)期大小相符。使用Ni2+NTA樹脂對VP2蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果顯示獲得較純的VP2蛋白(圖1所示)。
[0054]實施例2單克隆抗體的制備
[0055]1.小鼠免疫
[0056]以通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化的BTV16 VP2重組蛋白免疫4只6周齡雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫間隔兩周，一免將重組VP2蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，二免和三免將重組VP2蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化，免疫劑量為50 μ g/只，免疫途徑為腹腔免疫。
[0057]分別在二免和三免后一周對小鼠進(jìn)行斷尾采血，分離血清(4 °C，1000Orpm,20min)，用間接ELISA檢測抗體水平。在細(xì)胞融合前3天，對免疫效果好的BALB/c小鼠再進(jìn)行加強免疫，每只小鼠腹腔注射50 μ g免疫抗原(不加佐劑)。
[0058]2.細(xì)胞融合
[0059]融合前I天準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞，按照常規(guī)方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中待用。斷頸處死待取脾的小鼠，無菌取脾并分離脾細(xì)胞，按脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞4: I的 比例用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞鋪于準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞之上。
[0060]3.陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆
[0061]利用通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化的BTV16 VP2重組蛋白建立間接ELISA檢測方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，對反應(yīng)陽性的雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)，同時用有限稀釋法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆，至少亞克隆3次，將亞克隆好的陽性雜交瘤細(xì)胞及時凍存。最終獲得一株可以穩(wěn)定分泌抗BTV16-VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其微生物保藏號是=CGMCC N0.8153 ;并將其分泌的單克隆抗體命名為BTV16-3G10。
[0062]4.單克隆抗體的大量制備
[0063]給10周齡左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射石蠟油，0.5mL/只，I周后腹腔注射IXio6個雜交瘤細(xì)胞，7~IOd后當(dāng)小鼠腹部極度膨脹時抽取腹水，隔2d抽一次，將抽取的腹水10000r/min離心IOmin,去除上層油脂和沉淀,上清分裝保存于_2(TC。
[0064]實施例3單克隆抗體的鑒定
[0065]1.單克隆抗體的亞類鑒定
[0066]按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒操作說明書對實施例I所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。
[0067]結(jié)果顯示本發(fā)明單克隆抗體BTV16-3G10的重鏈為IgG1，輕鏈為κ鏈。
[0068]2.Western blot 試驗
[0069]將接種有野生型桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞裂解液，通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化的BTV16VP2重組蛋白，離心收獲BTV16病毒上清后的細(xì)胞沉淀和BHK-21細(xì)胞沉淀處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，電轉(zhuǎn)條件為18V電壓30min ;用5%脫脂奶粉封閉液將轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素膜4°C封閉過夜；加入單克隆抗體上清室溫孵育lh，用PBST (含0.5mL/L吐溫-20的pH7.4的PBS緩沖液)洗滌三次，再與4000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體室溫孵育lh，PBST洗滌3次后，用DAB顯色試劑盒顯色，掃描記錄。
[0070]試驗結(jié)果證實,本發(fā)明所制備的單克隆抗體BTV16-3G10能夠與通過Bac_to_Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化的BTV16 VP2重組蛋白以及天然BTV16-VP2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與對照組接種有野生型桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞裂解液以及BHK-21細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)(圖2)，同時根據(jù)本實驗結(jié)果推測BTV16-3G10所識別的BTV16VP2蛋白B細(xì)胞表位應(yīng)該是一個線性表位。
[0071]3.1FA 試驗
[0072]應(yīng)用IFA試驗檢測單克隆抗體BTV16-3G10與BTV16的反應(yīng)性結(jié)果如圖3所示。
[0073]實施例4 B細(xì)胞表位的鑒定
[0074]1.MBP融合短肽的表達(dá)及B細(xì)胞表位多肽的初步鑒定
[0075]為鑒定BTV16-3G10所識別的B細(xì)胞線性表位，我們根據(jù)BTV16 VP2蛋白的核苷酸序列(Gene Bank accessio`n n0.JN671907)設(shè)計合成87對互補的引物，每對引物編碼16個氨基酸，相鄰兩對引物編碼的氨基酸序列有5個氨基酸重疊區(qū)。87對引物所編碼的氨基酸序列覆蓋BTV16 VP2蛋白全長，將表達(dá)的87條MBP融合短肽分別命名為MBP-VP2-LMBP-VP2-2等等。所合成的引物經(jīng)退火后通過EcoRI和SalI酶切位點分別連接到pMAL?-C4X質(zhì)粒上，成功構(gòu)建87個重組質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中(DE3;N0Vagen，USA)，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化成功后，將攜帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌于LB/Amp培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.5-0.7，加入終濃度為0.5mM的IPTG，37°C繼續(xù)培養(yǎng)6小時，以使蛋白充分表達(dá)。菌液9000g離心后(lOmin，4°C )進(jìn)行超聲破碎，通過SDS-PAGE和Western blot試驗確定87條MBP融合短肽的成功表達(dá)。
[0076]將表達(dá)的87條MBP融合短肽作為包被抗原包被ELISA板，同時將MBP標(biāo)簽蛋白作為包被抗原對照，包被量均為IOOng/孔，通過間接ELISA試驗初步鑒定BTV16-3G10所識別的表位區(qū)域。
[0077]結(jié)果顯示BTV16-3G10 能與 MBP-VP2-4 (34EWSGHDVTEIPNR觀F49)發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)。進(jìn)而將BTV16-3G10所識別的BTV16-VP2蛋白B細(xì)胞表位初步定位于34EWSGHDVTEIPNR觀F49，即 SEQ ID N0.1 所示。
[0078]3.B細(xì)胞表位的精確定位
[0079]利用肽掃描技術(shù)合成如下短肽(表1)，并對其進(jìn)行間接ELISA檢測，包被量為IOOng/孔，進(jìn)而精確定位B細(xì)胞表位。
[0080]表1針對BTV16-3G10所合成的短肽[0081]
【權(quán)利要求】
1.一株分泌抗藍(lán)舌病病毒血清16型(Bluetongue virus 16，BTV16) VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為BTV16-3G10，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏號為=CGMCC N0.8153，其所特異性識別的BTV16 VP2蛋白線性B細(xì)胞表位的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。
2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。
3.BTV16VP2蛋白線性B細(xì)胞表位多肽，其特征為:其氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示，所述表位多肽被權(quán)利要求2所述的單克隆抗體所識別。
4.權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株在制備診斷或預(yù)防藍(lán)舌病病毒血清16型感染藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在制備診斷或預(yù)防藍(lán)舌病病毒血清16型感染藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述BTV16VP2蛋白線性B細(xì)胞表位多肽在制備診斷藍(lán)舌病病毒血清16型感染藥物中的應(yīng)用。`
【文檔編號】C07K16/10GK103740650SQ201310652908
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】吳東來, 徐青元, 楊濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所