半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽納米生物醫(yī)藥材料及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽納米生物醫(yī)藥材料及應(yīng)用。其氨基酸序列的通式如下：Ac-Pro-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-Pro-NH2其中X、Y為極性帶電荷氨基酸，X為帶負(fù)電荷氨基酸，Y為帶正電荷氨基酸，組成整條肽鏈的氨基酸均為全D型氨基酸，氨基酸殘基的數(shù)目固定為9個(gè)。本發(fā)明所述的半程電荷互補(bǔ)型手性短肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強(qiáng)，受外界環(huán)境因素影響不大，可通過(guò)加入NaCl或是改變NaCl的含量來(lái)調(diào)控手性短肽的自組裝形貌，又可通過(guò)自組裝形成納米纖維水凝膠，對(duì)出血?jiǎng)?chuàng)面具有快速止血的作用。該材料制備工藝簡(jiǎn)單可行，成本較低，其應(yīng)用豐富了納米生物醫(yī)藥材料的種類。
【專利說(shuō)明】半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽納米生物醫(yī)藥材料及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及自組裝納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體涉及一類半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽及其快速止血的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]源于自組裝現(xiàn)象廣泛存在于自然界中，近年來(lái)利用氨基酸殘基序列設(shè)計(jì)自組裝多肽納米材料逐漸成為 熱門研究領(lǐng)域。通過(guò)合理設(shè)計(jì)多肽鏈的氨基酸殘基序列，多肽分子可利用靜電作用、疏水作用、氫鍵作用和堆積作用等非共價(jià)鍵作用力自發(fā)或觸發(fā)性地自組裝形成結(jié)構(gòu)與形態(tài)特異的自組裝體。由于D-型氨基酸具有良好的生物相容性且不易被自然存在的氨基酸分解酶降解，因此，利用D-型氨基酸自組裝構(gòu)建各種功能性材料有著巨大的應(yīng)用前景。近年來(lái)院前傷口止血問(wèn)題成為急救醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)，而由氨基酸組成的多肽不同于傳統(tǒng)止血材料，它在人體內(nèi)不易發(fā)生排斥或免疫反應(yīng)，從而有望替代傳統(tǒng)止血材料，達(dá)到快速止血的作用。目前，國(guó)內(nèi)外已有少部分具有止血活性的短肽被報(bào)道，但也是僅限于全程電荷互補(bǔ)型短肽或是全L型氨基酸組成的易降解、較不穩(wěn)定的短肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一類半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽，該類短肽自組裝形成相互交織的納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不但可豐富以氨基酸殘基構(gòu)建自組裝短肽的種類，而且增加了自組裝短肽的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽作為納米生物止血材料的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明設(shè)計(jì)出一類能自組裝的半程電荷互補(bǔ)型手性短肽，此手性短肽的組成氨基酸殘基均為全D型氨基酸，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，不易受外界環(huán)境改變的影響，并且此肽具有顯著的快速止血活性。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]一類半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽，其氨基酸序列的通式如下=Ac-PiO-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-Pro-NH2，其中Ac為乙酰化N端，NH2為酰胺化C端，X、Y為極性帶電荷氨基酸，X為帶負(fù)電荷氨基酸，Y為帶正電荷氨基酸，組成整條肽鏈的氨基酸均為全D型氨基酸，含有且僅含有9個(gè)氨基酸殘基。
[0008]優(yōu)選地，所述帶正電荷的氨基酸為HiS、Arg或Lys。
[0009]所述帶負(fù)電荷的氨基酸為Glu或Asp。
[0010]所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽的序列為:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 任意一種所示。
[0011]該SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQID N0.6分別對(duì)應(yīng)如下6種:
[0012]①D-P9-1:Ac-ProD-GluD-PheD-ArgD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2[0013]②D-P9-2:Ac-ProD-GluD-PheD-Hi sD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0014]③D-P9-3:Ac-ProD-GluD-PheD-LysD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0015]④D-P9-4:Ac-ProD-AspD-PheD-ArgD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0016]⑤D-P9-5:Ac-ProD-AspD-PheD-HisD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0017]⑥D(zhuǎn)-P9-6:Ac-ProD-AspD-PheD-LysD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2 ；
[0018]所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽作為納米生物止血材料的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明手性短肽自組裝原理是利用其肽鍵間的氫鍵相互作用以及氨基酸殘基之間的氫鍵相互作用、靜電相互作用，疏水相互作用以及堆積作用等非共價(jià)鍵作用力自發(fā)組合形成一類結(jié)構(gòu)明確，構(gòu)造穩(wěn)定，并且具有某種特殊理化性質(zhì)和功能的分子聚集體或超分子結(jié)構(gòu)。帶電荷氨基酸的引入是為了產(chǎn)生電荷互補(bǔ)形成反向平行纏繞。
[0020]本發(fā)明半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽作為納米生物止血材料，止血時(shí)間快，SD大鼠腎臟創(chuàng)面平均止血時(shí)間在6s~IOs范圍內(nèi)；SD大鼠肝臟創(chuàng)面平均止血時(shí)間則在9~15s范圍內(nèi)。
[0021]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益之處:
[0022]1.提供了一類新型的半程電荷互補(bǔ)手性自組裝短肽，豐富了自組裝短肽納米材料的種類，所述的手性短肽二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易受外界環(huán)境改變的影響。
[0023]2.本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽自組裝納米形貌可通過(guò)加入NaCl和改變NaCl的含量進(jìn)行調(diào)控，可形成結(jié)構(gòu)新穎的納米形貌，有助于納米形貌的可控性研究。
[0024]3.本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽通過(guò)自組裝可形成交織的納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，用于出血?jiǎng)?chuàng)面后可立即自組裝形成透明水凝膠，良好地覆蓋于傷口表面，起到快速止血和加速傷口愈合的作用。
[0025]4.本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽組成成分為氨基酸殘基，在體內(nèi)不易發(fā)生排斥或免疫反應(yīng)，組織相容性好；此外，D型氨基酸殘基組成的短肽不易被體內(nèi)蛋白酶水解，延長(zhǎng)了其作用時(shí)間。
[0026]5.本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽納米材料生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單可行、成本相對(duì)較低，不但可豐富以氨基酸殘基構(gòu)建自組裝短肽的種類，而且增加了自組裝短肽的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1的高效液相色譜(HPLC)圖。
[0028]圖2是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1的質(zhì)譜(MS)圖。
[0029]圖3是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1的三維分子結(jié)構(gòu)模型示意圖，采用的是HyperChem7.5軟件基于能量最低原則繪制。
[0030]圖4是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1在25°C下不同濃度超純水溶液中的CD譜圖。
[0031]圖5是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1在25°C下不同濃度NaCl溶液中的CD譜圖。
[0032]圖6是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1在25°C下超純水和80mMNaCl溶液中的臨界膠束濃度擬合圖。[0033]圖7是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1在超純水溶液中的原子力學(xué)顯微鏡(AFM)納米形貌圖，其中半程電荷互補(bǔ)型手性短肽D-P9-1樣品的濃度分別為
a.0.6mM ；b.1.2mM ；c.1.8mM ；d.2.4mM ；e.6.1mM ；f.12.2mM。
[0034]圖8是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1在不同濃度(a、c:0mM ;b、d:80mM ；e.100mM)NaCl溶液中的AFM納米形貌圖，其中半程電荷互補(bǔ)型手性短肽D-P9-1樣品的濃度分別為 a> c:0.2mM ；b> d、e:1.25mM。
[0035]圖9是本發(fā)明所述半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1和②D_P9_2樣品用于SD大鼠腎臟和肝臟止血模型實(shí)驗(yàn)圖:A.腎臟空白對(duì)照；B.手性短肽①D-P9-1作用于腎臟創(chuàng)面；C.手性短肽②D-P9-2作用于腎臟創(chuàng)面；D.肝臟空白對(duì)照；E.手性短肽①D-P9-1作用于肝臟創(chuàng)面；F.手性短肽②D-P9-2作用于肝臟創(chuàng)面。
【具體實(shí)施方式】
[0036]為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。
[0037]實(shí)施例1
[0038]當(dāng)X為Glu，Y為Arg時(shí)，半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D_P9_1序列如下:
[0039]D-P9-1:Ac-ProD-GluD-PheD-ArgD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2。半程電荷互補(bǔ)型手性短肽①D-P9-1的合成:Ac為乙?；疦端，NH2為酰胺化C端
[0040]1.材料
[0041]Fmoc-Pro-OH (N-荷甲氧擬基-腦氨酸)、Fmoc-Glu (OtBu) -OH (N-荷甲氧羰基-ο-叔丁基-谷氨酸)、Fmoc-Phe-OH (N-芴甲氧羰基-苯丙氨酸)、Fmoc-Arg(pbf)-0H(N-荷甲氧羰?；鵢2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃_5_磺酰-精氨酸)、Fmoc-Asn (Trt) -OH (N-荷甲氧擬基-N-三苯甲基-天冬酸胺)、Fmoc-Gln-OH (N-荷甲氧羰?；?谷氨酰胺)、Rink Amide-MBHA Resin (樹(shù)脂)。
[0042]HBTU (O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1-羥基苯并三氮唑)購(gòu)自上?？齐纳邢薰尽＿哙?、醋酸酐、DMF (N、N-二甲基甲酰胺)、TFA (三氟乙酸)、NMM (N-甲基嗎啉)、乙醚、甲醇和DCM (二氯甲烷)購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。
[0043]2.制備方法
[0044]采用Fmoc (芴甲氧羰基)保護(hù)的固相合成法，其工藝步驟如下:
[0045](1)稱取 20g0.5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 于妝合成儀中，取 200ml DMF溶脹樹(shù)脂30min，抽濾，再次取用300ml DMF洗滌樹(shù)脂，分3次進(jìn)行，每次洗滌時(shí)間為2min，抽濾出洗滌液后向肽合成器中加入100ml20%哌啶/DMF (V:V)震蕩反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，再次抽濾出反應(yīng)液，用400ml DMF分4次洗滌樹(shù)脂，洗畢后取少量樹(shù)脂做茚三酮檢測(cè)試驗(yàn)，樹(shù)脂呈陽(yáng)性，向肽合成儀中加入以下原料:
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一類半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽，其特征在于，氨基酸序列的通式如下=Ac-PrO-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-PrO-NH2，其中 Ac 為乙?；?N 端，NH2 為酰胺化 C 端，X、Y 為極性帶電荷氨基酸，X為帶負(fù)電荷氨基酸，Y為帶正電荷氨基酸，組成整條肽鏈的氨基酸均為全D型氨基酸，含有且僅含有9個(gè)氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽，其特征在于，所述帶正電荷的氨基酸為His、Arg或Lys。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽，其特征在于，所述帶負(fù)電荷的氨基酸為Glu或Asp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽，其特征在于，所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組裝短肽的序列為:SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 任意一種所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任意一項(xiàng)所述半程電荷互補(bǔ)型手性自組短肽作為納米生物止血材料的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK103665110SQ201310656420
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】何道航, 鄧淑晶, 周立新 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)