金黃色葡萄球菌hi重組蛋白的發(fā)酵和純化工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供一種制備金黃色葡萄球菌（SA）HI重組蛋白的發(fā)酵工藝和純化工藝。本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝能夠大規(guī)模、高密度地生產(chǎn)HI重組蛋白基因工程菌體；本發(fā)明提供的純化工藝針對HI重組蛋白的蛋白特性，能夠高效地獲得純度好、得率高的精制蛋白原液。
【專利說明】金黃色葡萄球菌Hl重組蛋白的發(fā)酵和純化工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種制備金黃色葡萄球菌(SA) HI重組蛋白的發(fā)酵工藝和純化工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA),以下簡稱金葡菌,有“嗜肉菌”的別稱。作為革蘭氏陽性菌的代表，它是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的一種重要致病菌。感染以急性、化膿性為特征，局部感染可引起皮膚和軟組織等的化膿性感染，經(jīng)久不愈；全身感染可導(dǎo)致骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、膿毒血癥等嚴(yán)重感染及并發(fā)癥，死亡率高達20%。同時，金葡菌的外毒素還可引起食物中毒、燙傷樣皮膚綜合征和中毒性休克綜合征等全身致死性感染。因此，加強對金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗將對有效控制金葡菌耐藥性蔓延和臨床金葡菌廣泛感染具有重要的戰(zhàn)略及現(xiàn)實意義。
[0003]本申請發(fā)明人前期構(gòu)建了一種金黃色葡萄球菌重組蛋白HI，由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌α -溶血素?zé)o毒突變體與鐵離子表面決定蛋白活性片段重組而成，并對該蛋白提交了中國專利申請(CN102993308A)，該申請全部通過引用的方式結(jié)合至本文。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本申請在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)上，進一步提供所述HI重組蛋白基因工程菌的發(fā)酵、純化及去內(nèi)毒素工藝。
[0005]在本申請中，HI蛋白的氨基酸序`列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]在第一個方面，本發(fā)明提供HI重組蛋白基因工程菌的發(fā)酵工藝，包括將一定量的種子菌接種于含有甘油和一定溶氧量的培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)一定時間而表達重組蛋白。
[0007]優(yōu)選地，所述工藝涉及培養(yǎng)基、種子菌接種量、培養(yǎng)基中的甘油量、溶氧量、誘導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間幾方面因素對大規(guī)模、高密度地生產(chǎn)HI重組蛋白基因工程菌的影響。
[0008]進一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基可以是動物源性TB、動物源性Μ9、植物源性TB、植物源性Μ9，優(yōu)選為動物源性TB ;所述種子菌的接種量是5%~15%，優(yōu)選為10% ;所述甘油量為5-15ml/L培養(yǎng)基，優(yōu)選為10ml/L培養(yǎng)基；所述溶氧量是25%~65%，優(yōu)選為45% ;所述誘導(dǎo)劑可以是乳糖或IPTG，優(yōu)選為IPTG ;所述誘導(dǎo)劑的濃度是0.1~ImM，優(yōu)選為0.2mM ;所述誘導(dǎo)溫度為16~37°C,優(yōu)選為30°C ;所述誘導(dǎo)時間為I~6小時,優(yōu)選為5小時。
[0009]在所述發(fā)酵工藝的一種【具體實施方式】中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用動物源性TB培養(yǎng)基，其中甘油量是10ml/L ;發(fā)酵開始時，種子菌的接種量比例是10% ;在發(fā)酵過程中溶氧濃度保持在45% ;誘導(dǎo)時，溫度調(diào)為30°C、IPTG濃度為0.2mM、誘導(dǎo)5h。
[0010]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，所述種子菌是含有能夠表達HI蛋白的載體的大腸桿菌；優(yōu)選地，所述大腸桿菌是XL-1Blue ;所述載體是pGEX-6p-2。根據(jù)CN102993308A以及本申請記載的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道如何制備本發(fā)明所需要的HI生產(chǎn)種子菌。
[0011]在第二方面，本發(fā)明還提供一種HI重組蛋白基因工程菌發(fā)酵后的蛋白純化工藝，包括依次進行的GST-瓊脂糖凝膠4B親和層析、陽離子交換層析、置換緩沖液及去內(nèi)毒素。
[0012]優(yōu)選地，所述陽離子交換層析使用MMC層析柱，使用的緩沖液為，緩沖液A:25mMNaAC-HAc, ρΗ4.5，緩沖液 B:50mM PB+1M NH4Cl, ρΗ7.0 ;上樣流速為 4.7ml/min，洗脫流速:4.7ml/min ;洗脫程序:0-100%B,20個柱體積(CV);優(yōu)選地，上樣pH值為7.0-7.5，洗脫pH值為11.0。
[0013]優(yōu)選地，所述置換緩沖液使用G25層析柱；使用緩沖液為疫苗稀釋液。
[0014]優(yōu)選地，去內(nèi)毒素使用Q HP層析柱；使用緩沖液為，緩沖液A:疫苗稀釋液；緩沖液B:IM NaOH ；
[0015]在優(yōu)選實施方案中，進行親和層析之前，需要對基因工程菌進行菌體破碎，以將蛋白從菌體中釋放出來。
[0016]本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝能夠大規(guī)模、高密度地生產(chǎn)HI重組蛋白基因工程菌體；本發(fā)明提供的純化工藝針對HI重組蛋白的蛋白特性，能夠高效地獲得得率高、純度好的精制蛋白原液。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1、工程菌 pGEX-6P-2-HI/XLl_Blue細(xì)菌在四種培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0018]圖2、HI重組蛋白在M9和TB培養(yǎng)基中的表達情況。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:M9 ;3:TBo
[0019]圖3、不同IPTG濃度對HI重組蛋白表達的影響。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:0.1mM ；3:0.2mM ；4:0.5mM ；5:lmM。
[0020]圖4、不同接種量pGEX-6P-2-HI/XLl-Blue細(xì)菌生長曲線。
[0021]圖5、不同種子菌接種量對HI重組蛋白表達的影響。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:5% ；3:10% ；4:15%
[0022]圖6、不同氧濃度下pGEX-6P-2-HI/XLl_Blue細(xì)菌的生長曲線。
[0023]圖7、不同p02濃度對HI重組蛋白表達的影響。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:25% ；3:45% ；4:65%。
[0024]圖8、不同甘油濃度對HI重組蛋白表達的影響。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:5ml/L ；3:10ml/L ；4:15ml/L。
[0025]圖9、pGEX-6P-2-HI/XLl-Blue細(xì)菌在不同誘導(dǎo)溫度和時間對HI重組蛋白表達的影響。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:誘導(dǎo)Oh ；3:誘導(dǎo)2h ；4:誘導(dǎo)4h ；5:誘導(dǎo)6h ；6:誘導(dǎo)8h ；7:誘導(dǎo)IOh。
[0026]圖10、pGEX-6P-2-HI/XLl-Blue 細(xì)菌的發(fā)酵生長曲線。
[0027]圖11、25L發(fā)酵時，HI重組蛋白表達情況。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:誘導(dǎo)Oh ；3:誘導(dǎo)Ih ；4:誘導(dǎo)2h ；5:誘導(dǎo)3h ；6:誘導(dǎo)4h ；7:誘導(dǎo)5h。
[0028]圖12、HI重組蛋白GST親和層析純化SDS-PAGE結(jié)果。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前結(jié)合于GST瓊脂糖凝膠4B融合蛋白；2:酶切后殘存于填料上的HI及GST ；3:酶切后HI樣品。
[0029]圖13、MMC層析純化HI蛋白色譜圖。
[0030]圖14、MMC層析純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 ;純化前樣品；2 ;洗脫管I ;3 ;洗脫管2 ；4 ;洗脫管4 ；5 ;洗脫管8。
[0031]圖15、Resource S層析純化HI蛋白色譜圖。
[0032]圖16、Resource S層析純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；2:洗脫管I ;3:洗脫管3 ；4:洗脫管4 ；5:洗脫管5 ；6:洗脫管6 ；7:洗脫管7 ；8:洗脫管8 ；9:洗脫管9ο
[0033]圖17、SP HP層析純化HI蛋白色譜圖。
[0034]圖18、SP HP層析純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；I:純化前樣品；2:洗脫管I ;3:洗脫管2 ；4:洗脫管3 ；5:洗脫管4 ；6:洗脫管5 ；7:洗脫管6 ；8:洗脫管7 ；9:洗脫管8。
[0035]圖19、Phenyl FF層析純化HI蛋白色譜圖。
[0036]圖20、Phenyl FF層析純化HI蛋白電泳圖。1:洗脫管I ;2 ;洗脫管2 ；3:洗脫管3 ；4:洗脫管4。
[0037]圖21、Buty l FF層析純化HI蛋白色譜圖。
[0038]圖22、Butyl FF層析純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；
2:流穿；3:洗脫管I ;4:洗脫管2 ；5:洗脫管3。
[0039]圖23、Octyl FF層析純化HI蛋白色譜圖。
[0040]圖24、0ctyl FF層析純化HI蛋白電泳圖。1:洗脫管I ;2:洗脫管2 ；3:洗脫管3 ；4:洗脫管4。
[0041 ] 圖25、MMC層析(緩沖液①)純化HI蛋白色譜圖。
[0042]圖26、MMC層析(緩沖液①)純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；2:洗脫管I ;3:洗脫管3 ；4:洗脫管7。
[0043]圖27、MMC層析(緩沖液②)純化HI蛋白色譜圖。
[0044]圖28、MMC層析(緩沖液②)純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；2:洗脫管4 ；3:洗脫管5 ；4:洗脫管6 ；5:洗脫管7。
[0045]圖29、MMC層析(緩沖液③)純化HI蛋白色譜圖。
[0046]圖30、MMC層析(緩沖液③)純化HI蛋白電泳圖。1:洗脫管I ;2:洗脫管2 ；3:洗脫管3。
[0047]圖31、MMC層析(上樣樣品電導(dǎo)8.66ms/cm)純化HI蛋白色譜圖。
[0048]圖32、MMC層析(上樣樣品電導(dǎo)8.66ms/cm)純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:第一峰；2:第二峰；3:第三峰。
[0049]圖33、MMC層析(上樣樣品電導(dǎo)12.83ms/cm)純化HI蛋白色譜圖。
[0050]圖34、MMC層析(上樣樣品電導(dǎo)12.83ms/cm)純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:第一峰。
[0051]圖35、MMC層析(上樣樣品電導(dǎo)15.91ms/cm)純化HI蛋白色譜圖。
[0052]圖36、MMC層析(上樣樣品電導(dǎo)15.91mS/cm)純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:第一峰；2:第二峰。[0053]圖37、Q HP層析純化HI蛋白色譜圖。
[0054]圖38、Q HP層析純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；2:MMC流穿；3 =MMC洗脫樣品；4:100%B洗脫樣品；5:G25脫鹽樣品；6:Q HP流穿樣品。
[0055]圖39、放大后MMC層析(批次I )純化HI蛋白色譜圖。
[0056]圖40、放大后Q HP層析(批次I )純化HI蛋白色譜圖。
[0057]圖41、放大后MMC及Q HP層析(批次I )純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；2:MMC洗脫樣品；3:G25脫鹽樣品；4:Q HP流穿樣品。
[0058]圖42、放大后MMC層析(批次II )純化HI蛋白色譜圖。
[0059]圖43、放大后Q HP層析(批次II )純化HI蛋白色譜圖。
[0060]圖44、放大后MMC及Q HP層析(批次II)純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；2:MMC洗脫樣品；3:G25脫鹽樣品；4:Q HP流穿樣品。
[0061]圖45、放大后MMC層析(批次III)純化HI蛋白色譜圖。
[0062]圖46、放大后Q HP層析(批次III)純化HI蛋白色譜圖。
[0063]圖47、放大后MMC及Q HP層析(批次III)純化HI蛋白電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化前樣品；2:MMC洗脫樣品；3:G25脫鹽樣品；4:Q HP流穿樣品。
[0064]圖48、HI原液的H`PLC檢測結(jié)果；主峰保留時間13.913分；主峰比率100.0%。
[0065]圖49、磷酸鋁吸附HI前后的10%SDS_PAGE結(jié)果。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:吸附前；2:吸附后。
【具體實施方式】
[0066]現(xiàn)結(jié)合【具體實施方式】說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限于以下內(nèi)容。
[0067]以下實施例中所使用的菌株與各種試劑如下:
[0068]1.菌株
[0069]金黃色葡萄球菌MRSA-252國際標(biāo)準(zhǔn)株由美國ATCC提供；
[0070]菌株XLl-blue大腸桿菌為美國安捷倫公司產(chǎn)品。
[0071]2.質(zhì)粒
[0072]質(zhì)粒pGEX-6p_2 為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品。
[0073]3.試劑
[0074]primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶BamH I和Not 1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA連接酶為大連TakaRa公司產(chǎn)品；
[0075]質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品；
[0076]MH培養(yǎng)基:購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司(牛肉粉2.0g,可溶性淀粉
1.5g，酸水解酪蛋白17.5g)，加水至lL，pH值7.4±0.2 ;
[0077]MH平板:MH培養(yǎng)基加入瓊脂糖至終濃度為1.5g/100mL ；
[0078]PBS(磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g(國產(chǎn)分析純)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20) 2.9g(國產(chǎn)分析純)，氯化鈉(NaCl) 8.0g (國產(chǎn)分析純)，氯化鉀(KCl)0.2g，加水至1000mL, ρΗ7.4)；
[0079]20mM PB 緩沖液:磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.2g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20) 2.9g，氯化鉀(KCl)0.2g，加水至 1000mL, ρΗ7.0 ；
[0080]氨芐西林、卡那霉素(華北制藥)；[0081]5X 蛋白質(zhì)上樣緩沖液(250mM Tris-HCl (pH6.8), 10% (ff/V) SDS,0.5% (ff/V)溴酚藍，50% (V/V)甘油，5% (W/V) β-巰基乙醇)；
[0082]谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B (美國GE Healthcare公司)；
[0083]磷酸鋁佐劑(20mg/ml)(美國GENERAL CHEMICAL 公司)；
[0084]疫苗蛋白稀釋溶液(組氨酸(美國Merck公司，藥用級)10mM、NaC10.9% (西南制藥，注射用生理鹽水)、泊洛沙姆188 (美國Merck公司，藥用級)0.01%、pH6.0)，無熱原；
[0085]瓊脂粉、吐溫-20等其余試劑均為國內(nèi)市場購買。
[0086]實施例1:HI工程菌的發(fā)酵工藝
[0087]本實施例中使用的HI工程菌為含有表達HI重組蛋白的pGEX-6p_2載體(PGEX-6P-2-HI)的大腸桿菌 XLl-Blue (pGEX-6P-2-HI/XL1-bIue),其構(gòu)建過程參見CN102993308A。
[0088]1、發(fā)酵條件的確定
[0089]I)培養(yǎng)基對工程菌生長與目的蛋白表達的影響:
[0090]在搖瓶中測試四種培養(yǎng)基對工程菌生長的影響:
[0091]植物源性改良TB (磷酸二氫鉀2.3g、十二水磷酸氫二鈉13g、甘油5ml、酵母提取物24g、大豆蛋白胨12g、硫酸鎂lg，加水至1L)；
[0092]動物源性改良TB (磷酸二氫鉀2.3g、十二水磷酸氫二鈉13g、甘油5ml、酵母提取物24g、動物源胰蛋白胨12g、硫酸鎂lg，加水至1L)；
[0093]植物源性M9-CAA (磷酸氫二鈉15.6g、磷酸二氫鉀4.3g、氯化銨lg、硫酸鎂lg、氯化鈉0.67g、葡萄糖5g、大豆蛋白胨3.6g、植物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g,加水至1L)；
[0094]動物源性M9-CAA(磷酸氫二鈉15.6g、磷酸二氫鉀4.3g、氯化銨lg、硫酸鎂lg、氯化鈉0.67g、葡萄糖5g、動物胰蛋白胨3.6g、動物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L)。
[0095]取pGEX-6P-2-HI/XLl-blue 接種于 Amp+ (100 μ g/mL) L B 平板內(nèi)，37 °C 孵育16h-20h，挑取單菌落于IOml Amp+LB培養(yǎng)基里，置于搖床中37°C、200rpm搖到OD6tltl大約2左右時，按1:100分別接種于100ml四種培養(yǎng)基中，37°C、200rpm搖14h，每2h取樣測OD6tltl,其結(jié)果見圖1。
[0096]由圖1可知:植物源性培養(yǎng)基均差于動物源性，工程菌都是大約8h時就生長減緩，而在動物源性培養(yǎng)基中就長勢很好，一直處于對數(shù)期，且TB好于M9，故選用動物源培養(yǎng)基(動物源性改良TB和M9-CAA之后簡稱為TB、M9)。
[0097]將新鮮HI工程菌菌液(OD6tltl大約2)按1:100分別接種于100ml TB和M9培養(yǎng)基中，37°C、200rpm搖至0D_大約0.8左右時，加入ImM IPTG，25°C誘導(dǎo)12h。取100ml菌液離心，棄上清，稱重TB: 2.4g、M9:l.5g。以IgilOml加PBS超聲(功率300瓦)裂解IOmin ( X作6秒，休息9秒)破菌，結(jié)合GST-瓊脂糖凝膠4B (參考實施例2)，進行10%SDS_PAGE，結(jié)果如圖2所示。
[0098]如圖2所示:單位目的蛋白表達量TB好于M9，且單位菌濕重TB大于M9，故HI工程菌發(fā)酵選用TB培養(yǎng)基。
[0099]2) IPTG濃度對目的蛋白表達的影響:
[0100]考察不同終濃度的IPTG對目的蛋白表達水平的影響。IPTG的終濃度分別是0.1mM、0.2mM、0.5mM、ImM，對其進行比較選出最佳濃度。將新鮮HI工程菌菌液(OD6c?大約2)按1:100分別接種于四個100ml TB中，37°C、200rpm搖至OD600大約0.8左右時，分別加入IPTG，使其分別對應(yīng)上述四個濃度(一瓶一個濃度)，25°C誘導(dǎo)12h。將四瓶菌液分別離心，棄上清，以lg:1Oml加入PBS，超聲(功率300瓦)裂解IOmin (工作6秒，休息9秒)破菌，結(jié)合GST-瓊脂糖凝膠4B (具體過程參考實施例2)，進行10%SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示。
[0101]由圖3可知:IPTG終濃度為0.2mM時蛋白表達量明顯好于0.1mM，與0.時的蛋白表達量基本相同，故HI工程菌發(fā)酵時IPTG終濃度選為0.2mM。
[0102]3)種子菌的不同接種量對工程菌的生長和目的蛋白表達的影響
[0103]研究5%、10%、15%三種不同種子菌接種量對發(fā)酵的影響。通過細(xì)菌生長曲線、單位蛋白表達量來確定最佳接種量。當(dāng)種子菌OD6tltl在2左右時，倒入發(fā)酵罐內(nèi)開始計時，每I小時取樣測0D_，直到誘導(dǎo)前結(jié)束，繪制工程菌前期生長期曲線(圖4)，可判斷細(xì)菌生長速度快慢。誘導(dǎo)結(jié)束后，按照之前方法處理，進行10%SDS-PAGE，判斷單位目的蛋白表達量(圖5)。
[0104]由圖4可知，5%接種量細(xì)菌生長最慢而且最高0D_較另兩種接種量低很多。10%與15%接種量相差不大。由圖5可知，不同接種量單位目的蛋白表達量不同，表達最好的是5%接種量，其次是10%，但相差不大，15%最差。
[0105]綜上所述:5%接種量表達最好，但生長速度慢，最終細(xì)菌得率少；15%接種量生長速度快，但表達最差；10%接種量的蛋白表達量比5%相差不多，而且生長速度也比15%相差不多，故HI工程菌發(fā)酵時接種量選為10%。
[0106]4)氧濃度對工程菌生長和目的蛋白表達的影響
[0107]此工程菌是兼性厭氧菌，氧濃度的高低對細(xì)菌生長影響很大，所以在發(fā)酵過程中對溶氧的控制就顯得特別重要，現(xiàn)分別考察溶氧在25%、45%、65%時細(xì)菌的生長情況(圖6)和目的蛋白表達量(圖7)。
[0108]從細(xì)菌生長情況可知:45%溶氧條件下，細(xì)菌長得最好；從單位蛋白表達量來看，45%溶氧條件下，表達量也是最好的，故HI工程菌發(fā)酵時溶氧濃度選為45%。
[0109]5)甘油用量對工程菌生長和目的蛋白表達的影響
[0110]在不同菌量時進行誘導(dǎo)，會影響HI重組蛋白的表達量，而發(fā)酵時培養(yǎng)基中甘油的量會直接影響菌量的多少。當(dāng)罐內(nèi)甘油消耗完時，細(xì)菌就會停止生長，在短時間內(nèi)pH值和溶氧值迅速上升，此時應(yīng)馬上加IPTG開始誘導(dǎo)。所以甘油的多少直接決定誘導(dǎo)時機。通過研究5ml/L、10ml/L、15ml/L (培養(yǎng)基)的甘油量對目的蛋白表達量的影響和最終濕重得率來確定最佳誘導(dǎo)時機。結(jié)果如圖8所示。
[0111]從圖8可知:5ml/L甘油濃度時，表達量最高；10ml/L其次，但相差不多；15ml/L就差多了。但是5ml/L甘油濃度時，最后菌體濕重低很多；10ml/L與15ml/L相差不多，故HI工程菌發(fā)酵時甘油量選為10ml/L。
[0112]6)不同的誘導(dǎo)溫度和時間對目的蛋白表達的影響
[0113]考察30°C、25°C、16°C三個不同誘導(dǎo)溫度對蛋白表達量的影響，以及達到最大表達量時用的時間。在誘導(dǎo)后每2h取樣，誘導(dǎo)10h，處理樣品，進行10%SDS-PAGE，其結(jié)果如圖9所示。
[0114]由圖9可知:30°C時單位誘導(dǎo)表達量是最聞的，且達到最大表達所用時間是最短的，4h-6h之間的表達差異不大。而25°C、16°C時單位表達量就不如30°C，且表達時間長。故HI工程菌發(fā)酵時誘導(dǎo)溫度和時間選用30°C、5h。
[0115]根據(jù)上述研究，最終確定了本發(fā)明的HI工程菌的優(yōu)選發(fā)酵工藝是:
[0116](I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用動物源性TB培養(yǎng)基，其中甘油量是10ml/L ；
[0117](2)發(fā)酵開始時,種子菌的接種量比例是10% ；
[0118](3)在發(fā)酵過程中溶氧濃度始終保持在45%左右；
[0119](4)誘導(dǎo)時，溫度調(diào)為30°C、IPTG濃度為0.2mM、誘導(dǎo)時間5h。
[0120]2、工程菌發(fā)酵工藝放大
[0121]按照上述的優(yōu)化條件對發(fā)酵規(guī)模進行擴大(25L)，并得到HI工程菌生長曲線(圖10)和單位蛋白表達量電泳圖(圖11)。
[0122]由圖10可知，工藝放大后，整個生長曲線比較標(biāo)準(zhǔn)，前期細(xì)菌生長較快，后期誘導(dǎo)時曲線較平穩(wěn)，最終獲得菌密度(OD6tltl)達54，單位菌濕重56g/L。
[0123]由圖11可知，從單位目的蛋白表達量看:表達量隨時間的延長有明顯增加，5h表
達量最聞。
[0124]綜上所述:HI工程菌發(fā)酵工藝放大完全符合預(yù)期結(jié)果。本發(fā)明的發(fā)酵工藝可適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
[0125]實施例2:HI重組蛋白的純化工藝
[0126]1、破菌制備上清:`
[0127]向?qū)嵤├?發(fā)酵生產(chǎn)的菌體200-500g加入20mmol/L PBS，pH7.0緩沖液，按重量:體積比1:10比例加入，混勻懸浮，4°C預(yù)冷。
[0128]高壓破碎:使用蒸餾水沖洗高壓勻質(zhì)機(高壓勻質(zhì)機APV-1000，丹麥An InvernsysGroup)管道，低溫循環(huán)系統(tǒng)開啟預(yù)冷至1_4°C備用。將預(yù)冷的懸浮菌液加入高壓勻質(zhì)機，壓力維持在60-80Mpa破菌3_5次。
[0129]高速離心:破菌后的液體裝入離心桶(Beckman,美國),4°C, 10, 000-15, OOOg離心15-30min，收集上清備用。
[0130]2、GST-瓊脂糖凝膠4B親和層析純化
[0131]按每升HI破菌離心后上清液加入200ml GST填料，20~25°C結(jié)合4h以上，結(jié)合過程采用垂直旋轉(zhuǎn)或攪拌的方法以促進HI蛋白與GST填料的結(jié)合。將上述結(jié)合HI蛋白的GST填料采用PBS洗滌5個體積以除去未與GST填料結(jié)合的雜蛋白。然后按每100ml GST填料加入20ml的PP酶(2mg/mL，IU/mg)，在20~25°C條件下酶切6h后抽濾并收集濾液，即獲得切除GST標(biāo)簽的HI蛋白，進行10%SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖12所示，實驗顯示，經(jīng)過GST親和后獲得的HI蛋白的含量與純度(>90%)有了顯著的提高，且工藝具有很好的穩(wěn)定性，可為后續(xù)進一步的精細(xì)層析純化提供良好的樣品。
[0132]3、陽離子交換層析
[0133]I)層析填料的選擇
[0134]比較采用 MMC、Resource S、SP HP、Phenyl FF、Butyl FF 及 Octyl FF，對 HI 蛋白的純化效果。使用的樣品為上述獲得的GST親和層析后樣品。
[0135]儀器系統(tǒng):AKTA_explorerlOO液相色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)；
[0136]層析填料:①MMC、②Resource S、③ SP HP、④Phenyl FF、⑤Butyl FF及⑥ OctylFF (GE Healthcare 公司)；[0137]柱規(guī)格:①(Φ)0.77cmX (H) 10cm、② 0.64cmX (H) 3cm、③(Φ) 1.6cmX (H) 2.5cm、④⑤⑥(Φ)0.7cmX (H) 2.5cm ；
[0138]裝柱體積:①4.7ml、②④⑤⑥1ml、③5ml ；
[0139]緩沖液:
[0140]MMC 緩沖液:緩沖液 A: 25mM NaAC-HAC, pH4.5 ；
[0141]緩沖液B:50mM PB+1M NH4Cl, ρΗ7.0 ；
[0142]Resource S 緩沖液:緩沖液 A:20mM PB, pH6.0 ；
[0143]緩沖液B: 50mM PB+1M NaCl，ρΗ6.0 ；
[0144]SP HP 緩沖液:緩沖液 A: 20mM PB, pH6.0 ；
[0145]緩沖液B:50mM PB+1M NaCl, pH6.0
[0146]Phenyl FF 緩沖液:緩沖液 A:20mM PB+1.5M(NH4)2SO4, pH6.0 ；
[0147]緩沖液B:20mM PB, pH6.0 ；
[0148]Butyl FF 緩沖液:緩沖液 A:20mM PB+1.5M(NH4)2SO4, pH6.0 ；
[0149]緩沖液B:20mM PB, pH6.0 ；
[0150]Octyl FF 緩沖液:緩沖液 A:20mM PB+1.5M(NH4)2SO4, pH6.0 ；
[0151]緩沖液B:20mM PB, pH6.0 ；
[0152]上樣樣品:GST親和層析后樣品調(diào)節(jié)pH與純化填料相對應(yīng)緩沖液A —致備用。
[0153]流速及洗脫程序:
[0154]MMC:上樣流速:4.7ml/min,洗脫流速:4.7ml/min ；
[0155]洗脫程序:0-100%B，20個柱體積(CV)；
[0156]Resource S:上樣流速:2ml/min,洗脫流速:2ml/min ;
[0157]洗脫程序:0-100%B,40個柱體積(CV)；
[0158]SP HP:上樣流速:5ml/min,洗脫流速:5ml/min ；
[0159]洗脫程序:0-50%B，20個柱體積(CV)；
[0160]Phenyl FF:上樣流速:2ml/min,洗脫流速:lml/min ;
[0161]洗脫程序:0-100%B，20個柱體積(CV)；
[0162]Butyl FF:上樣流速:2ml/min,洗脫流速:lml/min ;
[0163]洗脫程序:0-100%B，20個柱體積(CV)；
[0164]Octyl FF:上樣流速:2ml/min,洗脫流速:lml/min ;
[0165]洗脫程序:0-100%B，20個柱體積(CV)。
[0166]各洗脫程序中其余份額的緩沖液是對應(yīng)的緩沖液A。
[0167]收集:將目的蛋白各洗脫樣品進行10%SDS_PAGE純度分析，評價純化效果。
[0168]從圖13至圖24可以看出，在不同層析填料條件下，MMC比Resource S、SP HP、PhenylFF、Butyl FF及Octyl FF洗脫目的蛋白的純度更高，通過一步精細(xì)純化就達到了很好的層析純化效果，且純度能夠達到97%以上，因此，綜合上述考慮，確定選擇MMC作為第一步精細(xì)層析純化的填料。
[0169]2)層析純化工藝的優(yōu)化
[0170]a、不同緩沖液條件下的純化效果比較:
[0171]儀器系統(tǒng):AKTA_explorerl00液相色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)；[0172]層析填料:MMC;
[0173]柱規(guī)格:(Φ)0.77cmX ⑶ IOcm ;
[0174]裝柱體積:4.7ml;
[0175]緩沖液:緩沖液A:① 25mM NaAC-HAC, ρΗ4.5，② 25mM NaAC-HAC+1% 吐溫-20+20%甘油，ρΗ4.5，③ 20mM PBS, pH7.2 ；
[0176]緩沖液B:① 50mM PB+1M NH4Cl, pH7.0，② 50mM Tris+1% 吐溫-20+20% 甘油，ρΗΙΟ.0,③ IOOmM NaHCO3-NaOH, pHll.0。
[0177]上樣樣品:GST親和層析后樣品調(diào)節(jié)pH與緩沖液A—致備用。
[0178]上樣流速:4.7ml/min,洗脫流速:4.7ml/min ；
[0179]洗脫程序:0_100%Β,20個柱體積(CV)。
[0180]收集:將目的蛋白各洗脫樣品收集，并進行10%SDS_PAGE純度分析，評價純化效
果O
[0181]從圖25和26 可以看出，在洗脫緩沖液①的條件下，目的蛋白出峰比較晚，且峰不高，可能的原因是隨著B液的增加，NH4Cl的濃度也隨之增加，由于MMC柱具有苯環(huán)疏水，目的蛋白會與MMC結(jié)合越來越牢固，但又因為B液中pH的不斷升高，有小部分的目的蛋白被洗脫下來，從電泳圖上可知純度已達到要求；從圖27和28可以看出，在洗脫緩沖液②的條件下，去除了 NH4Cl和提高pH至10.0，但目的蛋白仍在100%B液及ρΗΙΟ.0處出現(xiàn)高峰，蛋白得率提高了很多，說明去除NH4Cl及提高pH的方法可行，但仍需進一步提高pH值。從圖29和30可以看出，在洗脫緩沖液③的條件下，提高pH至11.0，目的蛋白很快就被洗脫下來，且峰很高。
[0182]因此，綜合上述結(jié)果，選擇pH7.0-7.5作為上樣pH值，選在pHl 1.0作為洗脫pH值。
[0183]b、不同樣品電導(dǎo)條件下的純化效果比較
[0184]儀器系統(tǒng):AKTA_explorerlOO液相色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)；
[0185]層析填料:MMC ;
[0186]柱規(guī)格:(Φ)1.6cmX (H) 20cm ;
[0187]裝柱體積:24ml ;
[0188]緩沖液:緩沖液A: 20mM PBS, pH7.5 ；
[0189]緩沖液B:1OOmM NaHCO3 _ NaOH, pHll.0 ；
[0190]上樣樣品:GST未和層析后樣品調(diào)節(jié)pH與緩沖液A —致備用；
[0191]上樣流速:4.7ml/min,洗脫流速:4.7ml/min ；
[0192]洗脫程序:0-100%B，20個柱體積(CV)；
[0193]收集:將目的蛋白各洗脫樣品收集，并進行10%SDS_PAGE純度分析，評價純化效果(圖 31-36)。
[0194]從圖31至圖36可以看出，在上樣樣品電導(dǎo)在5-15ms/cm之間，目的蛋白沒有明顯的流穿峰；在圖31中，樣品電導(dǎo)突然提高到35mS/cm時，出現(xiàn)一蛋白峰，經(jīng)電泳鑒定，是目的蛋白。
[0195]因此，綜合上述考慮，選擇上樣樣品電導(dǎo)應(yīng)低于30ms/cm。
[0196]4、G25層析置換緩沖液
[0197]儀器系統(tǒng):AKTA_explorerlOO液相色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)；[0198]層析填料:G25 ；
[0199]柱規(guī)格:(Φ)5cmX (H) 30cm ;
[0200]裝柱體積:500ml；
[0201]緩沖液:緩沖液A:疫苗稀釋液(組氨酸(Merck,美國，藥用級)10mmol/L,泊洛沙姆188 (Merck,美國，藥用級)0.01%w/v, NaC19g/L(西南制藥))
[0202]上樣樣品:MMC洗脫樣品；
[0203]流速:20ml/min。
[0204]將上步純化獲得的樣品通過G25層析柱置換緩沖液，收集蛋白峰。
[0205]5、第二步層析純化及去內(nèi)毒素
[0206]儀器系統(tǒng):AKTA_explorerlOO液相色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)；
[0207]層析填料:Q HP ;
[0208]柱規(guī)格:(Φ)2.6cm X (H) 20cm ;
[0209]裝柱體積:50ml ；
[0210]緩沖液:緩沖液A:疫苗稀釋液；緩沖液B:1M NaOH ；
`[0211]上樣樣品:G25直換緩沖液樣品；
[0212]流速:8ml/min。
[0213]用緩沖液B (lmol/L NaOH)在位清洗消毒5個柱體積，放置半小時后，使用疫苗稀釋液平衡系統(tǒng)至PH為6.0，然后上樣。流速:8ml/min。收集穿透峰即HI重組蛋白原液。
[0214]將洗脫樣品進行10%SDS_PAGE，結(jié)果見圖37和38。
[0215]6、工藝放大
[0216]按照以上確定的條件進行工藝放大:所采用的MMC層析柱規(guī)模放大為(Φ)2.6αιιΧ 0D20cm (裝柱體積為70ml)，流速為20ml/min ;Q HP層析柱規(guī)模放大為(Φ)2.6cm X (H) 20cm(裝柱體積為50ml)，流速為8ml/min。。重復(fù)三批次實驗，10%SDS-PAGE分析HI蛋白純化后的效果(圖39-46)，評價此工藝放大后的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
[0217]從圖39至圖47可以看出，HI蛋白經(jīng)MMC層析工藝放大后，放大層析純化模式和小量試驗層析純化色譜圖無明顯變化，經(jīng)純化后的HI純度仍然達到97%以上；Q HP去內(nèi)毒素后，對樣品進行檢測均達到要求。說明HI蛋白純化工藝穩(wěn)定，可適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
[0218]7、HPLC純度檢測
[0219]HPLC 儀 Agilentl260 (美國 Agilent Technologies),分析柱 ZorBax SB-300-C3,
4.6x1 5Omm3.5micron (美國 Agilent Technologies)。
[0220]流動相:A:0.1% 三氟乙酸(Tedia，美國)，水(18.2ΜΩ ) ；B:0.1% 三氟乙酸(Tedia，美國)，乙臆(Tedia,美國)。
[0221]柱溫60°C,流速 0.5mL/min,上樣 10 μ I。
[0222]檢測方法:0-30min:90%-0%A, 10%-100B ;30_35min:100%B ；35-40min:90%A,10%B ；40-45min:90%A, 10%B。
[0223]檢測結(jié)果如圖48和表1。
[0224]表1:HI樣品的HPLC檢測結(jié)果數(shù)據(jù)
[0225]
【權(quán)利要求】
1.一種HI重組蛋白基因工程菌的發(fā)酵工藝，包括將一定量的種子菌接種于含有甘油和一定溶氧量的培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)一定時間而表達重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中，所述培養(yǎng)基是動物源性TB、動物源性M9、植物源性TB或植物源性M9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中，所述種子菌的接種量是5%~15%，優(yōu)選為10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中，所述甘油量為5-15ml/L培養(yǎng)基，優(yōu)選為10ml/L培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中，所述溶氧量是25%~65%，優(yōu)選為45%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中，所述誘導(dǎo)劑可以是乳糖或IPTG，所述誘導(dǎo)劑的濃度是0.1~ImM，優(yōu)選為0.2mM ;誘導(dǎo)溫度為16~37°C，優(yōu)選為30°C ;誘導(dǎo)時間為I~6小時，優(yōu)選為5小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的工藝，其中，所述工程菌是含有能夠表達HI蛋白的大腸桿菌；優(yōu)選地，所述大腸桿菌是XL-1Blue ;所述載體是pGEX-6p-2。
8.一種在如權(quán)利要求1-7任一項所述的HI重組蛋白工程菌發(fā)酵工藝之后純化HI重組蛋白工藝，包括依次進行的GST-瓊脂糖凝膠4B親和層析、陽離子交換層析、置換緩沖液及去內(nèi)毒素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中，所述陽離子交換層析使用MMC層析柱，使用的緩沖液為，緩沖液 A:25mM NaAC-HAC, pH4.5，緩沖液 B:50mM PB+1M NH4Cl, pH7.0 ;上樣流速為4.7ml/min,洗脫流速:4.7ml/min ;洗脫程序:0-100%B，20個柱體積(CV);優(yōu)選地，上樣pH值為7.0-7.5，洗脫pH值為11.0 ;所述置換緩沖液使用G25層析柱，使用緩沖液為疫苗稀釋液；所述去內(nèi)毒素使用Q HP層析柱，使用緩沖液為，緩沖液A:疫苗稀釋液，緩沖液B:1MNaOH。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述工藝，在純化之前，對HI工程菌進行菌體破碎，以將重組蛋白從菌體中釋放出來。
【文檔編號】C07K1/22GK103695508SQ201310664256
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】敬海明, 董衍東, 劉唯, 鄒全明, 曾浩, 章金勇, 吳翼 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)