小麥耐鹽、抗旱基因TaDHN1、重組質(zhì)粒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥耐鹽、抗旱基因，即小麥脫水素基因TaDHN1及含有所述基因TaDHN1的植物表達(dá)載體，本發(fā)明還公開了所述基因TaDHN1在培育耐鹽、抗旱植物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)TaDHN1基因植株的耐鹽、抗旱能力明顯提高。
【專利說明】小麥耐鹽、抗旱基因「W//V/、重組質(zhì)粒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及小麥耐鹽、抗旱基因TaDHNl、重組質(zhì)粒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，各種非生物脅迫嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量，其中鹽和干旱脅迫對(duì)植物的影響尤為突出。通過基因工程培育耐逆新品種是有效利用鹽堿地、提高植物的抗旱能力，增加糧食產(chǎn)量，保障糧食安全的重要手段。目前利用基因工程技術(shù)開展植物耐鹽、抗旱方面的研究已取得了較大的的進(jìn)展。一些實(shí)驗(yàn)表明，將植物本身以及其他生物中與耐鹽相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入植物中，其異源轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物可以使轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力提高。
[0003]小麥?zhǔn)侨澜? 5%以上人口的主食，也是山東省主要糧食作物之一。但小麥屬甜土植物，在鹽潰化土壤中生長(zhǎng)極差，因此克隆耐鹽基因，培育耐鹽小麥新品種非常重要。
[0004]脫水素(又稱為第二類胚發(fā)育后期豐富蛋白)是ABA依賴的鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的功能基因，其最早發(fā)現(xiàn)于胚發(fā)育后期，在種子成熟后期的脫水過程中大量表達(dá)。后來研究表明，除了參與植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育外，脫水素基因主要參與了植物對(duì)高鹽、干旱、冷等各種非生物脅迫的抗性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽、抗旱基因一小麥脫水素基因TaDHNl、重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。我們?cè)谇捌谛酒s交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)代表脫水素基因的探針在鹽處理后的小麥根中顯著上調(diào)表達(dá)，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，克隆了該脫水素基因，功能研究表明，過表達(dá)該基因可提聞植物的耐鹽和抗旱能力。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案在于:首先根據(jù)小麥的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)選出在小麥幼苗根中顯著受鹽誘導(dǎo)表達(dá)的脫水素基因(探針)，然后根據(jù)探針序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，從小麥幼苗根的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中克隆脫水素基因TaDHNl全長(zhǎng)cDNA。測(cè)序獲得序列后，構(gòu)建包含TaDHNl基因完整ORF的穩(wěn)定過表達(dá)載體，最后在擬南芥中進(jìn)行功能驗(yàn)證。
[0007]本發(fā)明提供的小麥耐鹽、抗旱基因名稱為所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0008]本發(fā)明還提供了含上述小麥基因TaDHNl的重組質(zhì)粒pCAMBIA_superl300/TaDHNl:通過引物向SEQ ID N0.1序列兩側(cè)引入油al和5^1雙酶切位點(diǎn)，然后由油al和Sacl雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA-superl300和SEQ ID N0.1所示的基因片斷，回收載體大片段和目標(biāo)基因片段再連接獲得，
所述引物序列為:D10RF5: 5’-TCTAGAATGGAGTACCAGGGGCAGCAC-3’ (.XbaO D10RF3: 5’ -GAGCTCTCAGTGCTGTCCGCCGGG-3，{Sacl) 0
[0009]本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的特征在于外源基因的表達(dá)框中含有TaDHNl基因的完整的編碼框，即全長(zhǎng) ORF (open reading frame)。[0010]本發(fā)明提供了一種小麥耐鹽、抗旱基因TaDHNl在培育耐鹽和抗旱植物中的應(yīng)用， 本發(fā)明所述耐鹽和抗旱植物是小麥、玉米和水稻單子葉植物。
[0011]重組質(zhì)粒pCAMBIA-superl300/TaDHNl在培育耐鹽、抗旱植物中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明提供了提高含有基因TaDHNl植物耐鹽和抗旱性的方法，是將基因TaDHNl導(dǎo)入宿主植物細(xì)胞、組織或植株個(gè)體，得到具有耐鹽、抗旱性能的植株，所述的宿主植物為小麥、玉米和水稻單子葉植物。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明首次克隆得到了小麥脫水素基因7^/W7，并通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、抗旱能力明顯提聞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為TaDHNl基因全長(zhǎng)cDNA序列的擴(kuò)增結(jié)果，
其中 M 為 λ DNA/ {EcoR I + Η?η? III)Marker ;下同，
圖2為ABA和NaCl處理后TaDHNl基因在小麥幼苗根和葉中的RT-PCR分析:
圖2-a為TaDHNl在ABA處理的小麥幼苗葉中的表達(dá)情況；
圖2-b為TaDHNl在ABA處理的小麥幼苗根中的表達(dá)情況；
圖2- c為TaDHNl在NaCl處理的小麥幼苗葉中的表達(dá)情況；
圖2-d為TaDHNl在NaCl處理的小麥幼苗根中的表達(dá)情況，
圖3為構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA-superl300/TaDHNl的油arl、Sacl雙酶切驗(yàn)證結(jié)果，
圖4為轉(zhuǎn)表達(dá)載體pCAMBIA-superl300/TaDHNl的農(nóng)桿菌菌液PCR檢測(cè)結(jié)果，
圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的表型鑒定:
圖5-A:野生型Col-O及轉(zhuǎn)基因擬南芥株系在不同濃度NaCl處理下初生根根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)
果，
其中:WT:未轉(zhuǎn)化的Col-O野生型擬南芥；8、20為轉(zhuǎn)pCAMBIA-superl300/TaDHNl的不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；CK為對(duì)照，即在正常的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)；*:P < 0.05, * *:P <0.01，
圖5-B:野生型Col-O及轉(zhuǎn)基因擬南芥株系在不同甘露醇濃度處理下初生根根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，
圖5-C:正常生長(zhǎng)3周的擬南芥及正常生長(zhǎng)3周然后干旱處理15天的擬南芥生長(zhǎng)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
TaDHNl基因cDNA序列的克隆
1.1基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆和序列測(cè)定
1.引物序列
根據(jù)芯片探針序列設(shè)計(jì)基因特異性的下游引物，與文庫(kù)的5,端錨定引物進(jìn)行配對(duì)，以小麥幼根的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)cDNA。
[0016]引物序列為:TaDHNl:5' - GAGACGAACAGAGGTAGTACATG -3'，NT3:5， -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3，。
[0017]2.PCR 反應(yīng)體系(50 μ L)
2 X GC buffer I10 μ I
模板cDNA文庫(kù)Iul
dNTPs (2.5mM each) 0.5 μ I
Primerl (10 μ Μ)I μ I
Primer2(10 μ Μ)I μ I
LA Taq (TaKaRa)0.5ul
ddH20加至終體積50 μ I
3.PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 94°C 預(yù)變性 3min ;94°C變性 45sec，58°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán) 35 次；72°C延伸5min。
[0018]4.1 %瓊脂糖凝膠電泳
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)在700bp處有一條目的條帶(圖1)。
[0019]5.擴(kuò)增片段的回·收、與T載體的鏈接
對(duì)擴(kuò)增條帶采用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物與pGEM-T (Promega)載體連接,連接體系為:
回收的PCR產(chǎn)物7μ1
10 X Τ4連接酶緩沖液?μ?
pGEM-T 載體(50ng/ μ I)?μ?
T4DNA 連接酶(3U/ μ I) (Takara) ?μ? dH20 至 10μ1 于16 °C水浴連接過夜。
[0020]6.回收片段的克隆與測(cè)序 (O大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
①?gòu)?80°C冰箱中拿出保存于甘油中的萬(wàn).coliDH5a菌株(購(gòu)自天為時(shí)代生物公司)，放在冰上緩慢解凍；
②在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)劃線(LB固體培養(yǎng)基，不含Amp)；
③將平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜；
④挑取平板上的單菌落接種于含5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)14 一 16小時(shí)；
⑤取0.5 ml菌液接種于含50 ml LB液體培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中，37 °C振蕩(260rpm)培養(yǎng) 2 — 3 小時(shí)(0D260=0.5)；
⑥將培養(yǎng)的菌液置冰上I小時(shí)；
⑦4°C離心4分鐘(4000rpm)，去上清；
⑧用25ml冰預(yù)冷的溶液A將菌體輕輕懸浮起來，再在冰上放置40 — 45分鐘；
⑨重復(fù)步驟(8)；
⑩用2.5ml冰預(yù)冷的溶液B將菌體輕輕懸浮起來，然后將菌液分裝到1.5ml離心管中(每管ΙΟΟμΙ)，放入_80°C冰箱備用。[0021](2)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
①?gòu)腳80°C冰箱中取出I管(ΙΟΟμΙ)感受態(tài)細(xì)胞，置冰上緩緩解凍30分鐘；
②超凈工作臺(tái)上向管中加入5μ1連接反應(yīng)物，輕輕搖勻，置冰上30分鐘；
③42°C水浴熱激90秒，迅速置冰上3 — 5分鐘；
④在超凈工作臺(tái)上向離心管中加入ImlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37°C振蕩培養(yǎng) I 小時(shí)(260rpm)；
⑤室溫下5000rpm離心6分鐘，棄掉900μ1上清液，將剩余ΙΟΟμΙ上清液重新懸浮菌體，加入40μ1的X-gal和4μ1的IPTG，混勻，然后用涂布器將其均勻涂到準(zhǔn)備的平板上，放置30分鐘；
⑥倒置平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜，待出現(xiàn)明顯單菌落時(shí)拿出；
⑦放入4V冰箱數(shù)小時(shí)，使藍(lán)白斑顏色分明；
⑧用滅菌的牙簽挑取白斑于裝有IOmlLB液體培養(yǎng)基(含6(^g/mlAmp)的試管中，37°C搖菌過夜。
[0022](3)重組質(zhì)粒的PCR鑒定及測(cè)序
本實(shí)驗(yàn)所用的PGEM-T載體的克隆位點(diǎn)的上游有T7啟動(dòng)子，下游有SP6啟動(dòng)子，所以可以用這兩個(gè)啟動(dòng)子序列做引物對(duì)插入片段進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；
①PCR程序:94V預(yù)變性IOmin;94°C變性lmin，58°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)
35次；72°C 延伸 5min ；
②PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，取陽(yáng)性克隆的菌液送公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明所得序列包含一個(gè)完整的0RF，長(zhǎng)402 bp。全長(zhǎng)ORF序列見SEQ ID N0.1。
[0023]實(shí)施例2
ABA、NaCl處理?xiàng)l件下基因的表達(dá)分析
2.1材料處理
小麥材料山融3號(hào)的種子正常萌發(fā)，I周后去掉胚乳，Hangload培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)I周。鹽脅迫在液體培養(yǎng)基中施加200 mM NaCl, ABA處理施加100 μ M ΑΒΑ，分別在處理后的O、
0.5、3、12、24，48小時(shí)取幼嫩的葉片和根系用于提取總RNA。
[0024]2.2 Trizol 法提取小麥 Total RNA。
[0025]1.將組織材料放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；
2.待液氮揮發(fā)干，立即轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每IOOmg材料約加入Iml的Invitrogen公司的TRIzoI提取液，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；
3.加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；
4.4°C, 12000rpm 離心 15 分鐘;
5.用移液器小心吸出上層水相，加入新的1.5ml的離心管中，加入500μ I的異丙醇(1:1體積)，充分混勻，-20 0C，沉淀30min ；
6.4°C, 12000rpm離心IOmin,小心棄去上清液；
7.RNA沉淀用Iml的75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉淀；
8.重復(fù)用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀；
9.去上清，RNA沉淀于無(wú)菌操作臺(tái)上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適當(dāng)體積(30-50 μ I)的RNase-free水充分溶解(可放于_80°C長(zhǎng)期保存)；10.紫外分光光度計(jì)及l(fā)%Agr0Se凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量。
[0026]注:a)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的產(chǎn)量，在260nm處的吸光度，10D=40ug/ml。根據(jù)在260nm和280nm處的吸光值，檢測(cè)RNA的純度，純RNA的0D26(l/0D28(l比值應(yīng)接近2.0 (比值最好在1.9~2.1之間)。
[0027]b)用l%Agrose凝膠電泳檢側(cè)RNA的質(zhì)量及大小。吸取Iul RNA加入3μ I的RNase-free /K，加I μ I上樣緩沖液6 5°C變性5分鐘。電泳后用EB染色，另取3 μ I的2kbDNAMarker作為對(duì)照。
[0028]2.3第一鏈cDNA的合成
采用PrimeScript? RT-PCR Kit進(jìn)行。反應(yīng)步驟如下:
1.在Microtube管中配制下列混合液。
[0029]dNTP Mixture (10 mM) I μ I Oligo dT Primer (2.5 μ Μ) I μ I Total RNA4 μ I RNase free H2O 4 μ I
2.在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)。
[0030]65 °C 5 min 4°C I min
3.離心數(shù)秒鐘使RNA/引物等的混合液聚集于MiciOtube管底部。
[0031]4.在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 上述變性、退火后反應(yīng)液 10 μ I
5 X PrimerScript? Buffer4 μ I
RNase Inhibitor (40U/μ I)0.5 μ I
PrimScript?RTase0.5 μ I
Rnase Free dH205 μ I
5.在PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 42 0C 15-30 min 95 0C 5 min 4 0C保溫
2.4 PCR反應(yīng)及電泳
1.以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物如下 TaAct-S: 5’ - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3’
TaAct-A: 5’ - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3’
D10RF5: 5’ -TCTAGAATGGAGTACCAGGGGCAGCAC-3’ (XbaI)
D10RF3: 5’ -GAGCTCTCAGTGCTGTCCGCCGGG-3’ (SacI)
2.PCR體系
ddH204.7 μ I
10X buffer2 μ I
Primerl (2 μ Μ)I μ I
Primer2 (2 μ Μ)I μ IdNTP (IOmM each)0.2 μ I
rTaq polymerase (5U/μ I) 0.1 μ I
逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板I μ I
Total Volume10 μ I
3.PCR程序
94°C 5min ;25 ~30 cycles,94°C 20s,57°C 60s,72°C 45s ；72°C 5min。
[0032]根據(jù)內(nèi)參Actin的擴(kuò)增情況確定PCR的循環(huán)數(shù)，調(diào)整cDNA模板的加入量。
[0033]4.1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果見圖2中a、b、c、d。
[0034]實(shí)施例3
35S啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建
植物表達(dá)載體pCAMBIA-superl300是含有35S啟動(dòng)子和NPT II基因的雙元載體，在其多克隆位點(diǎn)上含有限制性內(nèi)切酶油al和5^1位點(diǎn)。根據(jù)基因TaDHNl的cDNA序列，設(shè)計(jì)包含完整ORF的基因特異性引物，且在引物5'端引入油al、Sacl雙酶切位點(diǎn)，引物序列為:
D10RF5: 5’ -TCTAGAATGGAGTACCAGGGGCAGCAC-3’ (.XbaO
D10RF3: 5’ -GAGCTCTCAGTGCTGTCCGCCGGG-3’ {Sacl)
用該對(duì)引物擴(kuò)增TaDHNl的cDNA序列。然后分別用限制性內(nèi)切酶油<31和SacI雙酶切載體pCAMBIA-Superl300和目的基因片斷。完全酶切的載體在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經(jīng)膠回收，然后與雙酶切的cDNA片段連結(jié)，構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA-superl300/TaDHNl。
[0035]3.1質(zhì)粒pCAMBIA_superl300空載體和目的基因片斷油al和5^1雙酶切 酶切體系如下:
XbaII μ I
SaclI μ I
pCAMBIA-super 1300 載體
(或目的基因片段)5μ1
IOXBuffer MI μ I
ddH20 To20 μ I
于37°C恒溫水浴鍋酶切3小時(shí)以上。
[0036]3.2酶切產(chǎn)物的電泳與回收
雙酶切完成后，以I X TAE為電泳緩沖液，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下pCAMBIA-super1300中載體的大片段和目的基因片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。
[0037]3.3 連接
經(jīng)酶切的pCAMBIA-SUper1300載體片段和目的基因片段以摩爾比1:4的比例進(jìn)行16 °C連接過夜。
[0038]3.4 轉(zhuǎn)化
連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固體平板上37°C培養(yǎng)16小時(shí)左右。[0039]3.5重組子的鑒定
質(zhì)粒酶切鑒定。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行油al和feci雙酶切，酶切體系同3.1。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，檢測(cè)到已切開的合適大小的目的基因條帶和載體條帶，證明載體構(gòu)建正確(圖3)。
[0040]實(shí)施例4
農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
4.1農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的制備
1.從YEP平板(含50μ g/ml利福平)上挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于含50 μ g/ml 利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，200rpm/min，28°C培養(yǎng)過夜；
2.取2ml過夜培養(yǎng)液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中在相同條件 下培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0.5 ;
3.菌液冰浴30min,4°C, 5000rpm離心IOmin,收集菌體；
4.將菌體重懸于冰浴的IOml0.15mol/L的NaCl中，離心收集菌體；
5.再懸浮于Iml20mmol/L冰預(yù)冷的CaC12溶液中，以200 μ I/管將菌液分裝在1.5ml Eppendorf管中，置 液氮中速凍lmin, _70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0041]4.2凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101
1.在室溫下融化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入Iyg表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，混勻后冰浴 30min ；
2.置液氮速凍Imin，迅速移至37°C保溫3min；
3.加入無(wú)抗生素的YEP800μ 1，28°C震蕩培養(yǎng)3hr ;
4.7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的YEP平板上，28°C倒置暗培養(yǎng)2-3天。
[0042]4.3菌體PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖4。
[0043]菌體PCR所用引物同實(shí)施例3。方法及程序同2.4。
[0044]實(shí)施例5
轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證一擬南芥轉(zhuǎn)化、篩選及表型分析
5.1擬南芥的種植
將野生型擬南芥種子用7.5%次氯酸鈉溶液(包括7.5%次氯酸鈉和0.01% Triton-X100)消毒15分鐘，然后用無(wú)菌水漂洗5-6次，點(diǎn)播于MS平板上，于4° C春化2_3天。然后移植到營(yíng)養(yǎng)缽中(營(yíng)養(yǎng)土與蛭石按等比例混合)，23° C培養(yǎng),16/8 h光周期,光強(qiáng)30-40 μ moIm-2 s_l ;待植株開花后,到去其主枝頂端,促進(jìn)側(cè)枝發(fā)展。在到枝后的4_6天內(nèi)，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0045]5.2擬南芥轉(zhuǎn)化
把200 ml菌液倒入淺盤中。將修剪好的擬南芥倒扣并使所有花序浸入懸浮菌液中，輕輕攪動(dòng)沾花30 sec-1 min。取出花盆側(cè)放于托盤中，用保鮮袋包裹以保濕。將托盤置暗處培養(yǎng)24 ho然后取出營(yíng)養(yǎng)缽并直立放置，恢復(fù)光照，繼續(xù)培養(yǎng)植株至成熟。
[0046]5.3陽(yáng)性植株的篩選:TO代種子用7.5%次氯酸鈉溶液(包括7.5%次氯酸鈉和
0.01% Triton-XlOO)消毒后，點(diǎn)播在MS選擇培養(yǎng)板(30 mg/L潮霉素)上。于4°C下春化2-3天。移入培養(yǎng)室中培養(yǎng)。大約10天左右，挑選潮霉素抗性植株(長(zhǎng)出真葉1-2對(duì)，根伸長(zhǎng)至培養(yǎng)基中)并移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中。培養(yǎng)直至種子成熟。同樣方法篩選Tl代種子得到T2代植株。并在T2代植物中挑選抗性比為3:1的單插入獨(dú)立株系，并獲得純合T3代株系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)和表型鑒定。
[0047]5.4轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定 1.擬南介基因組DNA的提取
(1)取IOOmg左右的新鮮葉片，放入1.5ml離心管中，液氮速凍，研磨器中磨碎，加入600 μ I預(yù)熱至65°C的2 X CTAB提取緩沖液，混勻置于65°C水浴中放置90min ；
(2)混合物冷至室溫后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，4°C，12000rpm離心IOmin ；
(3)取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇,混勻，4°C,12000rpm離心IOmin ；
(4)取上清，加入1/10體積的3mol/LNaAc (pH5.3)和0.7倍體積的異丙醇，仔細(xì)混勻，室溫放置15min，沉淀DNA ；
(5)用一玻璃鉤將DNA鉤出，并轉(zhuǎn)移至一裝有800μ I 70%乙醇的干凈Eppendorf管中，室溫放置數(shù)分鐘洗滌沉淀，6000g離心5min ；
(6)盡量去盡上清，空氣干燥數(shù)分鐘，溶于適量TE緩沖液中。
[0048]2.PCR 擴(kuò)增
以上面提取的擬南芥基因組DNA為模板，用基因特異性引物(同實(shí)施例3)進(jìn)行PCR擴(kuò)
+?
>曰ο
[0049]PCR體系同2.4。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45sec，58°C復(fù)性45sec，72°C延伸lmin，循環(huán)35次；72°C延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)到在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中擴(kuò)增出一 400bp左右的目的條帶，在轉(zhuǎn)空載體的植株中未見擴(kuò)增條帶。
[0050]5.5轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定
1.擬南芥的種植
T3代單拷貝純合擬南芥株系的種子用7.5%次氯酸鈉溶液(包括7.5%次氯酸鈉和0.01%Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無(wú)菌水漂洗5-6次，點(diǎn)播于MS平板上，于4° C春化2-3天，然后移植到營(yíng)養(yǎng)缽中(營(yíng)養(yǎng)土與蛭石按等比例混合)，23° C培養(yǎng)，16/8 h光周期，光強(qiáng) 30-40 μ moIm-2 s_l。
[0051] 2.NaCl和干旱脅迫處理
NaCl處理:將萌發(fā)2天的擬南芥幼苗(對(duì)照及轉(zhuǎn)基因株系)小心移植含有50 mMUOO mMNaCl的MS培養(yǎng)皿中，豎直培養(yǎng)一周觀察表型。結(jié)果表明在在正常MS培養(yǎng)基上，Col-O野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因的擬南芥表型差異不大，而在含有50 mM或100 mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)TaDHNl基因的擬南芥植株的根系明顯長(zhǎng)于野生型Col-0，T測(cè)驗(yàn)表明二者根長(zhǎng)差異達(dá)到了顯著性水平(圖5-A)。
[0052]滲透脅迫處理:將萌發(fā)2天的擬南芥幼苗(對(duì)照及轉(zhuǎn)基因株系)小心移植含有50mMUOO mM、150 mM甘露醇的MS培養(yǎng)皿中，豎直培養(yǎng)一周觀察表型。結(jié)果表明在在正常MS培養(yǎng)基上，Col-O野生型擬南芥和轉(zhuǎn)TaDHNl基因的擬南芥表型差異不大，而在含有50 mM100 mM或150 mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株的根系明顯長(zhǎng)于野生型，T測(cè)驗(yàn)表明二者根長(zhǎng)差異達(dá)到了顯著性水平(圖5-B)。[0053] 干旱處理:將萌發(fā)一周的擬南芥幼苗(對(duì)照及轉(zhuǎn)基因株系)移植培養(yǎng)土中，培養(yǎng)20天后開始控水(不澆水)干旱處理。干旱處理15天后觀察表型。結(jié)果表明干旱處理15天后，野生型擬南芥植株萎蔫，一些株系的葉子變得干枯(圖5-C);而轉(zhuǎn)了 TaDHNl外源基因的擬南芥植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛，能正常結(jié)出莢果(圖5 C TaDHNl-8和TaDHNl_20株系)。
序列表 SQ ID N0.1 〈110〉濟(jì)南大學(xué)
〈120〉小麥耐鹽、抗旱基因TaDHNl及其應(yīng)用
<141>2013-10-22
〈160〉 I
〈210〉 I
<211>402
<212>cDNA
〈213〉小麥
〈221〉小麥耐鹽、抗旱基因TaDHNl及其應(yīng)用 〈222〉 (I)…(402)
<400>1
I ATGGAGTACC AGGGGCAGCA CGGCCACGCC ACCGACAAGG TGGAGGAGTA CGGCCAGCCT 61 GTGGCCGGGC ACGGCGGTTT CACCGGCAGG CCCACGGGGA CGCACGGCGC GCAGCTCCAG 121 GCGACGAGGG ACGACCACAA GACCGACGGC GTCCTTCGCC GCTCCGGCAG CTCCAGCTCC 181 AGCTCGTCCG AGGACGACGG CGTGGGCGGC AGGAGGAAGA AGGGGATGAA GGAGAAGATC 241 AAGGAGAAGC TCCCCGGCGG AGCCCACAAG GACGCCACCG CCGGGCAGCA GCACACGGCG 301 GTGGCGGGCG AGTACGCGGG CACGCACGGC ACCGAGGCCA CCGGCGAGAA GAAGGGCGTC 361 ATGGACAAGA TCAAGGAGAA GCTTCCCGGC GGACAGCACT GA SQ ID N0.2 〈110〉濟(jì)南大學(xué)
〈120〉小麥耐鹽、抗旱基因TaDHNl及其應(yīng)用
<141>2013-10-22
〈160〉 I
〈210〉 I
<211>133
<212>AA
〈213〉小麥
〈221〉小麥耐鹽、抗旱基因Ta DHNl及其應(yīng)用 〈222〉 (I)…(133)
<400>1
IMEYQGQHGHA TDKVEEYGQP
21VAGHGGFTGR PTGTHGAQLQ
41ATRDDHKTDG VLRRSGSSSS
【權(quán)利要求】
1.一種小麥耐鹽、抗旱基因其特征在于:所述基因CDNA的核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種小麥耐鹽、抗旱基因其特征在于:其氨基酸序列為SEQ ID N0.2 所示。
3.重組質(zhì)粒pCAMBIA-superl300/TaDHNl:通過引物向SEQ ID N0.1序列兩側(cè)引和5^1雙酶切位點(diǎn)，然后由油al和5^1雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA-superl300和SEQID N0.1所示的基因片斷，回收載體大片段和目標(biāo)基因片段再連接獲得， 所述引物序列為:D10RF5: 5’-TCTAGAATGGAGTACCAGGGGCAGCAC-3’ (.XbaO D10RF3: 5’ -GAGCTCTCAGTGCTGTCCGCCGGG-3，{Sacl) 0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于:所述重組質(zhì)粒的特征在于外源基因的表達(dá)框中含有基因的完整的編碼框，即全長(zhǎng)ORF (open reading frame)。
5.一種小麥耐鹽、抗旱基因TaDHNl在培育耐鹽和抗旱植物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐鹽和抗旱植物是小麥、玉米和水稻等單子葉植物。
7.重組質(zhì)粒pCAMBIA-superl300/TaDHNl在培育耐鹽、抗旱植物中的應(yīng)用。
8.提高含有權(quán)利要求1中所述基因TaDHNl植物耐鹽和抗旱性的方法，是將權(quán)利要求1所述基因TaDHNl導(dǎo)入宿主植物細(xì)胞、組織或植株個(gè)體，得到具有耐鹽、抗旱性能的植株，所述的宿主植物為小麥、玉米和水稻等單子葉植物。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK103667315SQ201310686299
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】秦余香 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)