一種降解硫酸乙酰肝素及檢測(cè)其二糖組成的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域涉及一種降解硫酸乙酰肝素及檢測(cè)其二糖組成的方法，包括如下步驟：(1)用化學(xué)降解法將硫酸乙酰肝素降解為二糖；(2)用衍生試劑衍生硫酸乙酰肝素二糖；(3)用液相色譜(LC)法或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測(cè)步驟(2)所得衍生后的硫酸乙酰肝素二糖。本發(fā)明涉及的兩種化學(xué)降解方法可將硫酸乙酰肝素完全降解為二糖，能夠最大程度的得到硫酸乙酰肝素二糖的結(jié)構(gòu)信息。降解條件溫和，成本低，操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求低，適用范圍廣，檢測(cè)耗時(shí)短，樣品消耗量小，靈敏度高，分析結(jié)果重復(fù)性好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種降解硫酸乙酰肝素及檢測(cè)其二糖組成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種降解硫酸乙酰肝素及檢測(cè)其二糖組成的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate, HS)是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物組織基質(zhì)及細(xì)胞膜的糖胺聚糖(Glycosaminoglycan, GAG),其與17種蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白聚糖,主要有黏附蛋白聚糖、纖維蛋白聚糖、糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖、β 2蛋白聚糖及CD44等。它們?cè)趧?dòng)物細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、增生與分化、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附以及神經(jīng)細(xì)胞的信息傳遞等方面具有重要的生物學(xué)功能。HS糖鏈由氨基葡糖(GlcN)通過(guò)α (I — 4)糖苷鍵與葡糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)連接構(gòu)成二糖重復(fù)單元，HS與肝素的主要區(qū)別在于二糖重復(fù)單元的硫酸化修飾程度及乙?；潭炔煌?。HS是自然界中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的生物大分子之一，其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性是其參與各種生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。與肝素相比，HS具有抗栓活性強(qiáng)、抗凝血活性弱的優(yōu)點(diǎn)，因此HS日益引起研究者的興趣。幾乎所有動(dòng)物組織中均含有HS，目前的HS原料主要取自于動(dòng)物的肺、胰、脾及十二指腸等，不同來(lái)源的HS其結(jié)構(gòu)及藥理作用均有明顯差異。但是由于技術(shù)與試劑的限制，現(xiàn)有二糖組成測(cè)定方法亟需改進(jìn)以推進(jìn)HS的研究、開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。
[0003]現(xiàn)分析HS 二糖組成的方法主要依靠肝素酶。肝素酶是一類(lèi)來(lái)自微生物的裂解酶，如肝素酶Ι、π和III。這三種酶具有不同的糖結(jié)構(gòu)選擇性，可以使肝素及HS在不同的糖苷鍵處斷裂。將肝素及HS降解成二糖需將三種肝素酶聯(lián)合使用，再通過(guò)強(qiáng)陰離子交換柱或反相柱分離酶解得到的不同二糖，與市售的二糖標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定性，再通過(guò)各二糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)檢測(cè)器響應(yīng)值和物質(zhì)的量的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量來(lái)確定該多糖的結(jié)構(gòu)。呂慧中等用酶解方法對(duì)豬肝組織中的硫酸乙酰肝素進(jìn)行了二糖分析(呂惠中，于廣利，趙峽，等.豬肝組織中硫酸乙酰肝素的分離純化及二糖組成分析[J].中國(guó)生化藥物雜志，2007(5):297?300)。傳統(tǒng)方法中的酶、強(qiáng)陰離子交換柱和二糖標(biāo)準(zhǔn)品都非常昂貴，酶容易失活、性質(zhì)不穩(wěn)定，檢測(cè)步驟繁瑣，而且該方法分析結(jié)果的重復(fù)性差。如果樣品中混有其它糖胺聚糖，如硫酸軟骨素，肝素酶不能將其降解，故不能檢測(cè)到這一類(lèi)的雜質(zhì)。所以亟需一種全面、高效、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定且成本低廉的檢測(cè)硫酸乙酰肝素類(lèi)二糖的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種全面、高效、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定且成本低的檢測(cè)硫酸乙酰肝素的方法，本發(fā)明的另一目的是提供一種可以最大程度地得到硫酸乙酰肝素二糖的方法。
[0005]實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]1.一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖組成的方法，包括如下步驟:
[0007](I)用化學(xué)降解法將硫酸乙酰肝素降解為二糖
[0008]①將硫酸乙酰肝素脫乙?；?，得脫乙酰產(chǎn)物；[0009]②用亞硝酸降解步驟①所得脫乙酰產(chǎn)物；
[0010](2)用衍生試劑衍生硫酸乙酰肝素二糖
[0011]將步驟(1)所得二糖濃縮至干并溶解于水中，調(diào)節(jié)pH值為堿性，加入0.5mol/L吡唑啉酮類(lèi)衍生試劑，反應(yīng)完成后用氯仿萃取三次去除未反應(yīng)的衍生試劑；
[0012](3)用液相色譜(LC)法或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測(cè)步驟(2)所得衍生后的硫酸乙酰肝素二糖。
[0013]2.一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖組成的方法，步驟(1)包括用酶解與化學(xué)降解結(jié)合的方法將硫酸乙酰肝素降解為二糖
[0014]①將硫酸乙酰肝素酶解為硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；
[0015]②用亞硝酸降解步驟①所得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖。
[0016]3.一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，所述的脫乙酰步驟包括:
[0017]將硫酸乙酰肝素溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到90-111 °C，反應(yīng)4-20h，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰產(chǎn)物；
[0018]所述的酶解步驟包括:
[0019]向硫酸乙酰肝素中加入含有20mmol/L的鈣離子的肝素酶1、II和III，于37°C水浴中酶解48h，得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；
[0020]所述的亞硝酸降解步驟包括:
[0021]將脫乙酰產(chǎn)物或硫酸乙酰肝素寡糖和二糖濃縮至干，溶于水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5°C條件下反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0_5°C條件下反應(yīng)，加入氨水終止反應(yīng)，得硫酸乙酰肝素二糖。
[0022]化學(xué)降解反應(yīng)方程式為:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征于，包括如下步驟: (1)用化學(xué)降解法將硫酸乙酰肝素降解為二糖 ①將硫酸乙酰肝素脫乙?；?，得脫乙酰產(chǎn)物； ②用亞硝酸降解步驟①所得脫乙酰產(chǎn)物； (2)用衍生試劑衍生硫酸乙酰肝素二糖 將步驟(1)所得二糖濃縮至干并溶解于水中，調(diào)節(jié)PH值為堿性，加入吡唑啉酮類(lèi)衍生試劑，反應(yīng)完成后用氯仿萃取三次去除未反應(yīng)的衍生試劑； (3)用液相色譜(LC)法或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測(cè)步驟(2)所得衍生后的硫酸乙酰肝素二糖。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征于，步驟(1)包括用酶解與化學(xué)降解結(jié)合的方法將硫酸乙酰肝素降解為二糖 ①將硫酸乙酰肝素酶解為硫酸乙酰肝素寡糖和二糖； ②用亞硝酸降解步驟①所得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖。
3.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征于，所述的脫乙酰步驟包括: 將硫酸乙酰肝素溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到90-111 °C，反應(yīng)4-20h，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰產(chǎn)物； 所述的酶解步驟包括: 向硫酸乙酰肝素中加入含有20mmol/L的鈣離子的肝素酶1、II和III，于37°C水浴中酶解48h，得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖； 所述的亞硝酸降解步驟包括: 將脫乙酰產(chǎn)物或硫酸乙酰肝素寡糖和二糖濃縮至干，溶于水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5°C條件下反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0_5°C條件下反應(yīng)，加入氨水終止反應(yīng)，得硫酸乙酰肝素二糖。
4.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征于，所述的脫乙酰步驟包括，將硫酸乙酰肝素溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到98°C，反應(yīng)8h，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征于，所述的脫乙酰步驟中硫酸乙酰肝素與N2H4.H2O的質(zhì)量體積比(mg/mL)為1:0.5-1, N2H4.H2O溶液中含 10% N2H4.H2SO4。
6.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述的亞硝酸降解步驟中脫乙酰產(chǎn)物或硫酸乙酰肝素寡糖和二糖的水溶液與亞硝酸鈉水溶液、亞硝酸、氨水的體積比為1:1:1:0.6。
7.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述二糖與批唑啉酮類(lèi)衍生試劑的質(zhì)量之比為1:6-60。
8.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，酶解步驟包括，向硫酸乙酰肝素中加入含肝素酶Ι、Π和ΙΙΙ，ρΗ為7.3的緩沖液(50mmol/LTris-HCl、0.01% 牛血清白蛋白、IOOmmo 1/LNaCl、20mmol/LCaCl2)，于 37 °C 水浴中酶解 48h，得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖。
9.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述吡唑啉酮類(lèi)衍生試劑包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)、1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)、1-氘代苯基_3_氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)。
10.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述吡唑啉酮類(lèi)衍生試劑包括PMP，D3PMP，D5PMP，D8PMP其中的一種或幾種聯(lián)用。
【文檔編號(hào)】C07H5/06GK103713057SQ201310695189
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】張麗娟, 韓章潤(rùn), 曾洋洋, 蘭瑩, 邱培菊 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)