一種從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸Shinorine的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸Shinorine的方法，具體如下：1）將微囊藻粉與甲醇混合，超聲，加熱后，離心并收集上清；2）將上清液氮氣吹干與蒸餾水復溶；3）加入氯仿混勻；4）離心，收集上清；5）針式過濾器過濾；6）利用strata-x固相萃取小柱處理，濾液冷凍干燥。利用本發(fā)明提取的類菌胞素氨基酸Shinorine，該方法簡單，操作方便，安全可靠，最終產品的純度達到85%-95%，可以作為標準品使用，為后續(xù)大規(guī)模提取定量打下堅實基礎。
【專利說明】—種從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸Shinor ine的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術和資源利用與可持續(xù)發(fā)展領域，更具體涉及一種從微囊藻提取類菌胞素氨基酸Shinorine的方法。
【背景技術】
[0002]目前，對微囊藻的利用幾乎是空白，更不用說從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸并加以利用了。
[0003]類菌胞素氛基酸(mycosporine and mycosporine_like)是一大類以環(huán)己稀麗為基本骨架，與不同類型氨基酸通過縮合作用形成的水溶性物質，能在真菌、海洋細菌、藍藻和真核藻類細胞中合成，并在海生無脊椎動物和魚類等生物體內積累，其分子大小一般小于400Da，這類物質在310-360nm范圍內具有很強的光吸收能力。很多微囊藻都含有類菌胞素氨基酸，他們能幫助微囊藻抵抗紫外線的侵襲，為微囊藻的生長創(chuàng)造條件。類菌胞素氨基酸這類具有極強的抗紫外輻射的能力，可用于光保護行業(yè)，特別是化妝品行業(yè)。目前，我國使用的光保護物質主要是化學合成，長期使用化學合成物質對人體皮膚容易造成傷害，從而不利于人類健康。
[0004]而且，目前國內對類菌胞素氨基酸的提取涉及很少，并且純度不高。特別是目前世界范圍內都沒有 商品的類菌胞素氨基酸標準品。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸Shinorine的方法，該方法簡單，操作方便，安全可靠。
[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸Shinorine的方法在制備的類菌胞素氨基酸Shinorine中的應用。通過該方法，得到的最終產品的純度達到85%-95%，可以作為標準品使用，或其他商品化用途，為后續(xù)大規(guī)模提取定量打下堅實基礎。為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施:
[0007]—種從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸Shinorine的方法,具體步驟如下:
[0008]1.將微囊藻粉與無水甲醇以Ig:10-40ml的比例進行混合，先置于超聲清洗儀中100%超聲處理5-10min，然后置于40_50°C的水浴鍋中處理2.5-4小時，期間上下混勻數次，9000-11000rpm/min條件下離心,離心15_20min,取上清；濾洛以上述微囊藻粉與無水甲醇的比例重新加入無水甲醇抽提，重復抽提2~3次，將收集的上清合并；
[0009]2.將收集的上清液置于氮吹儀中，氮氣吹干，以蒸餾水與藻粉重量比為1:1~5:1加入蒸餾水復溶；
[0010]3.在復溶后溶液中加入等體積的氯仿，充分混勻；
[0011]4.以9000-11000rpm/min的條件下離心15_20min,收集上清液；
[0012]5.上清液過0.22 μ m針式過濾器，收集濾液；
[0013]6.濾液再經過strata-x固相萃取小柱處理，收集的濾液在-50~_60°C下冷凍干燥后稱重。
[0014]本發(fā)明所用試劑或材料市售的均可使用，步驟6中用固相萃取小柱處理濾液時，可依據常規(guī)方式處理，或選擇以下處理方式，步驟如下:
[0015]a:活化,先使用10_40ml的無水甲醇,然后使用10_40ml超純水活化小柱,流速為2_5ml/min ；
[0016]b:上樣:上樣前樣品溶液中加入0.2m/L的NaOH溶液，使樣品pH值到6.5-8.0 ；
[0017]c:淋洗:先使用無水甲醇20-60ml,再使用超純水活化20_60ml ;流速為2_5ml/min ；
[0018]d:洗脫:洗脫溶液使用0.1% (v:v)HCl甲醇10_20ml (所用HCL濃度為lm/1)，流速 2_5ml/min ；
[0019]e:收集的濾液在-50~-60°C下冷凍干燥后稱重。
[0020]優(yōu)選的，在步驟d中的洗脫溶液總體積不變的情況下，進行兩次相同條件洗脫。[0021 ] 優(yōu)選的，上樣時不施加壓力，使溶液自然流下。
[0022]所述的微囊藻可通過常規(guī)方式 進行培養(yǎng)，也可通過本發(fā)明所述方式進行，具體培養(yǎng)步驟如下:
[0023]1.培養(yǎng)液的配制:常規(guī)藍藻培養(yǎng)基；
[0024]2.微囊藻的培養(yǎng):
[0025](I)一級培養(yǎng):由試管原種接種到250ml的培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調節(jié)氣流到1_2L/min,氣流經過針頭式過濾器(0.22 μ m)無菌處理連接，光強控制在40-60 μ EnT2s'溫度控制在25-28°C，當培養(yǎng)5-8天后，轉入二級培養(yǎng)；
[0026](2)二級培養(yǎng):將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到2L培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調整氣流到3-4L/min，氣流經過針頭式過濾器(0.22 μ m)無菌處理連接，光強控制在60-80 μ EnT2iT1,溫度控制在25-28°C，當培養(yǎng)5-10天后，轉入三級培養(yǎng)；
[0027](3)三級培養(yǎng):將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物轉移到IOL的培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調整氣流到4-6L/min，氣流經過針頭式過濾器(0.22 μ m)無菌處理連接，光強控制在80-100 μ Επι?溫度控制在25-28 °C，培養(yǎng)8-10天。
[0028]所述的微囊藻粉可通過常規(guī)方式制備，或采用本發(fā)明的制備方法，具體如下:
[0029]將微囊藻液超聲波處理3個循環(huán)，每個循環(huán)超聲波處理3min，暫停lmin，超聲后的藻液置于離心機中離心，離心速度9000-11000rpm/min離心15_20min,獲得微囊藻藻泥，-60一-80°C冷凍后，置于冷凍干燥機，-50一-60°C得到微囊藻藻粉。
[0030]本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)點和顯著地效果:
[0031]提取物雜質少，Shinorine純度高，操作方便，設備簡單，安全可靠，適用于制備標準品。
【具體實施方式】
[0032]實施例1:
[0033]微囊藻的培養(yǎng):
[0034]1.培養(yǎng)液的配制:常規(guī)藍藻培養(yǎng)基；
[0035]2.微囊藻的培養(yǎng):[0036](I) 一級培養(yǎng):由試管原種(4ml)接種到250ml的培養(yǎng)瓶中(內有培養(yǎng)基200ml)，通氣培養(yǎng)，調節(jié)氣流到l_2L/min，氣流經過針頭式過濾器(0.22 μ m)無菌處理連接，光強控制在40-60 μ EnT2S'溫度控制在25-28 °C，當培養(yǎng)5_8天后，轉入二級培養(yǎng)；
[0037](2) 二級培養(yǎng):將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物全部接入到2L培養(yǎng)瓶(內有培養(yǎng)基1L)中，通氣培養(yǎng)，調整氣流到3-4L/min，氣流經過針頭式過濾器(0.22 μ m)無菌處理連接，光強控制在60-80 μ EnT2s-1,溫度控制在25-28°C，當培養(yǎng)5_10天后，轉入三級培養(yǎng)；
[0038](3)三級培養(yǎng):將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物全部轉移到IOL的培養(yǎng)瓶(內有培養(yǎng)基8L)中，通氣培養(yǎng)，調整氣流到4-6L/min，氣流經過針頭式過濾器(0.22 μ m)無菌處理連接，光強控制在80-100 μ EnT2s-1，溫度控制在25-28°C，培養(yǎng)8_10天，即得微囊藻液。
[0039]將微囊藻液超聲波處理3個循環(huán)，每個循環(huán)超聲波處理3min，暫停lmin，超聲后的藻液置于離心機中離心，11000rpm/min離心15_20min，-60一-80°C冷凍后，置于冷凍干燥機，-50~_60°C得到微囊藻藻粉。
[0040]所述的微囊藻為PCC7806銅綠微囊藻。
[0041]實施例2: [0042]一種從微囊藻中提取制備類菌胞素氨基酸Shinorine的方法，其步驟如下:
[0043]1.稱取IOg實施例1制得的微囊藻粉加入100ml無水甲醇，先置于超聲清洗儀中100%超聲處理15min，然后置于45°C的水浴鍋中處理3小時，期間上下混勻10次，11000rpm/min條件下離心15min,取上清,濾洛中重新加入100ml無水甲醇抽提,重復抽提3次，將收集的上清合并；
[0044]2.將收集的上清液置于氮吹儀中，氮氣吹干后，使用IOml蒸餾水復溶；
[0045]3.將復溶后的溶液取出，加入等體積的氯仿，充分混勻；
[0046]4.以11000rpm/min的條件下離心15min,收集上清液；
[0047]5.上清液過0.22 μ m針式過濾器，收集濾液；
[0048]6.濾液再經過固相萃取小柱處理，收集的濾液在-50~_60°C下冷凍干燥后稱重。過柱的具體步驟如下:
[0049]a:活化,先使用IOml的無水甲醇,然后使用IOml超純水活化小柱,流速3ml/min ；
[0050]b:上樣:上樣前樣品溶液中加入0.2m/l的NaOH溶液，使最終pH值為7.5 ;
[0051]c:淋洗:先使用無水甲醇20ml勻速淋洗,然后使用超純水20ml勻速淋洗；流速3ml/min。
[0052]d:洗脫:使用洗脫溶液0.1% (v/v)的HCl甲醇5ml (所用HCL濃度為lm/1)進行洗脫，流速為3ml/min,收集濾液；
[0053]e:洗脫:再用洗脫溶液0.1% (v/v)的HCl甲醇5ml進行洗脫(所用HCL濃度為lm/1),收集濾液,流速為3ml/min;
[0054]f:將d、e兩步收集的收集的濾液在-50~_60°C下冷凍干燥后稱重。
[0055]本實施例所使用的針式過濾器為尼龍材料；固相萃取柱為phenomenex生產strata-χ 型號，規(guī)格是 6ml200mg ；
[0056]IOg 的藻粉獲得 18.95mg 的 Shinorine,純度是 95%。
[0057]本發(fā)明實施例中所述技術方案如未特別說明，均為本領域常規(guī)技術。
【權利要求】
1.一種從微囊藻中提取類菌胞素氨基酸Shinorine的方法,具體步驟如下: 1)將微囊藻粉與無水甲醇以lg:10-40ml的比例進行混合，先置于超聲清洗儀中100%超聲處理5-10min，然后置于40_50°C的水浴鍋中處理2.5-4小時，期間上下混勻數次，9000-11000rpm/min條件下離心,離心15_20min,取上清；濾洛以上述微囊藻粉與無水甲醇的比例重新加入無水甲醇抽提，重復抽提2~3次，將收集的上清合并； 2)將收集的上清液置于氮吹儀中，氮氣吹干，以蒸餾水與藻粉重量比為1:1飛:I加入蒸餾水復溶； 3)在復溶后溶液中加入等體積的氯仿，充分混勻； 4)以9000-11000rpm/min的條件下離心15_20min,收集上清液； 5)上清液過0.22 μ m針式過濾器，收集濾液； 6)濾液再經過strata-x固相萃取小柱處理，收集的濾液在-5(T-60°C下冷凍干燥后稱重。
2.根據權利要求1所述的方法，固相萃取的具體步驟為: 活化:先使用10-40ml的無水甲醇,然后使用10-40ml超純水活化小柱,流速為2_5ml/min ； 上樣:上樣前樣品溶液中加入0.2m/L的NaOH溶液，使樣品pH值到6.5-8.0 ； 淋洗:先使用無水甲醇20-60ml,再使用超純水活化20-60ml ;流速為2_5ml/min ； 洗脫:洗脫溶液使用0.1%體積比的HCl甲醇10-20ml，流速2_5ml/min，收集的濾液在-5(T-6(TC下冷凍干燥后稱重，所述HCL濃度為lm/1。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:在洗脫溶液總體積不變的情況下，洗脫兩次。
4.根據權利要求1或2所述的方法，微囊藻的培養(yǎng)方法如下: A.培養(yǎng)液的配制:常規(guī)藍藻培養(yǎng)基； B.微囊藻的培養(yǎng): (1)一級培養(yǎng):由試管原種接種到250ml的培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調節(jié)氣流到l_2L/min，氣流經過針頭式過濾器無菌處理連接，光強控制在40-60 μ EnT2s'溫度控制在25-28°C，當培養(yǎng)5-8天后，轉入二級培養(yǎng)； (2)二級培養(yǎng):將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到2L培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調整氣流到3-4L/min，氣流經過針頭式過濾器無菌處理連接，光強控制在60-80 μ EnT2s'溫度控制在25-28°C，當培養(yǎng)5-10天后，轉入三級培養(yǎng)； (3)三級培養(yǎng):將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物轉移到IOL的培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調整氣流到4-6L/min，氣流經過針頭式過濾器無菌處理連接，光強控制在80-100 μ EnT2s'溫度控制在 25-28 °C，培養(yǎng) 8-10 天。
5.權利要求1所述方法在制備的類菌胞素氨基酸Shinorine中的應用。
【文檔編號】C07C249/02GK103755589SQ201310702909
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權日:2013年12月19日
【發(fā)明者】高合意, 虞功亮, 李仁輝 申請人:中國科學院水生生物研究所