一種鹽酸高血糖素的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鹽酸高血糖素的純化方法。具體而言，所述方法包括：以體積比30%—60%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液溶解粗肽，得到粗肽溶液；將所得粗肽溶液采用色譜法梯度洗脫純化，以體積比0.1%—0.4%的硫酸和體積比0.1%—0.4%高氯酸的水溶液用氨水調(diào)pH值2.5—3.5后的溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B%：20%—45%洗脫；鹽析；在十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱上采用色譜法將鹽析后的樣品轉(zhuǎn)鹽和脫鹽，以體積比為0.1-0.8%的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B%：3%—10%梯度沖洗15-30分鐘后，再用鹽酸水溶液-乙腈體系轉(zhuǎn)鹽洗脫。
【專利說明】一種鹽酸高血糖素的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鹽酸高血糖素的純化方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種操作簡單、高收率、純度高、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的鹽酸高血糖素的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高血糖素(glucagon)亦稱增血糖素或抗胰島素或胰島素B。它是伴隨胰島素由脊椎動物胰臟的胰島α細(xì)胞分泌的一種激素。與胰島素相對抗，起著增加血糖的作用。高血糖素是由29個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽，分子量為3485，它是由一個(gè)大分子的前體裂解而來。目前國內(nèi)有兩家產(chǎn)品上市，分別是丹麥諾和諾德公司的注射用生物合成高血糖素和深圳翰宇的注射用鹽酸高血糖素。其在鹽酸鹽的條件下具有較高的生物活性。
[0003]目前高血糖素的生產(chǎn)主要采用生物重組方法，其收率不高，純度也較低，一般在90%左右。關(guān)于高血糖素人工合成方法方面的文獻(xiàn)很少，關(guān)于純化的文獻(xiàn)幾乎沒有。
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、高收率、純度高、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的鹽酸高血糖素的純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，綜合考慮鹽酸高血糖素本身的性質(zhì)，本發(fā)明提供了一種鹽酸高血糖素的純化方法，包括以下步驟: [0006]一以體積比30% — 60%的醋酸和5% — 20%的乙腈的水溶液溶解粗肽，得到粗肽溶液；
[0007]一將所得粗肽溶液采用色譜法梯度洗脫純化，以體積比0.1% — 0.4%的硫酸和體積比0.1% — 0.4%高氯酸的水溶液用氨水調(diào)pH值2.5—3.5后的溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%:20% — 45%，優(yōu)選20%-40%洗脫，收集洗脫得到的高血糖素硫酸鹽溶液；
[0008]一使所得高血糖素硫酸鹽溶液鹽析；
[0009]一在十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱上采用反相高效液相色譜法將鹽析后的樣品轉(zhuǎn)鹽和脫鹽，以0.1~0.8% (w/v)的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%:3%~10%梯度或等度沖洗15~30分鐘后，再用鹽酸水溶液一乙腈體系脫鹽處理。
[0010]具體而言，本發(fā)明提出了一種鹽酸高血糖素的純化方法，該方法獲得的產(chǎn)品純度高且收率好，能夠達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的一種高血糖素鹽酸鹽的純化方法包括以下步驟:
[0012]步驟1):以體積比30% — 60%的醋酸和5% — 20%的乙腈的水溶液按照濃度20g/L—50g/L溶解粗肽，用水將所得粗肽溶液中的醋酸與乙腈二者的總體積百分?jǐn)?shù)稀釋到10%—30%。步驟1)下文也表述為“前處理”。
[0013]所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未經(jīng)過精制處理的鹽酸高血糖素粗肽或者純度不能滿足藥用的鹽酸高血糖素，粗肽中鹽酸高血糖素的純度在20%以上。
[0014]所述“粗肽溶液”是指粗肽經(jīng)過前處理后所得到的溶液，所使用的水為純凈水，并符合注射用水標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選超純水；所使用的醋酸為分析純的冰醋酸，本發(fā)明的“乙腈”的純度級別優(yōu)選色譜純。
[0015]選擇體積比30% — 60%的醋酸和5% — 20%的乙腈的水溶液混合溶劑系統(tǒng)是通過對比試驗(yàn)并考慮實(shí)際生產(chǎn)過程的操作方便得出的，不在該濃度范圍內(nèi)的溶劑的溶解能力會變低，導(dǎo)致溶解樣品所需的溶解體積過大，不利于反相色譜的處理(會導(dǎo)致體積過載，純化效率低)。
[0016]將制備的粗肽的濃度控制在20g/L — 50g/L有利于純化效率，高于50g/L會導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化時(shí)不掛色譜柱，低于20g/L會使純化效率低下。
[0017]用水將所得粗肽溶液中的醋酸與乙腈二者的總體積百分?jǐn)?shù)稀釋到10% — 30%，當(dāng)醋酸和乙腈的總體積百分?jǐn)?shù)高于30%此范圍的溶劑會導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化時(shí)不掛色譜柱，當(dāng)醋酸和乙腈的總體積百分?jǐn)?shù)低于10%會使樣品析出，導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化無法進(jìn)行。
[0018]步驟2):將所得粗肽溶液進(jìn)行色譜法梯度洗脫純化，以0.1% — 0.4%的硫酸和
0.1% — 0.4%高氯酸的水溶液(體積比，用`氨水調(diào)pH值2.5—3.5)為A相，乙腈為B相，梯度:B%:20% — 45%，優(yōu)選20%-40%，收集純化的高血糖素硫酸鹽溶液；步驟2)下文也表述為“純化”。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述pH為3.0。
[0019]選擇0.1%一0.4%的硫酸和0.1%一0.4%聞氯酸兩種酸用氨水調(diào)節(jié)后生成兩種緩沖鹽的A相是優(yōu)化選擇的結(jié)果。流動相A中緩沖鹽的濃度低于所限定的范圍使流動相緩沖能力變?nèi)?，?dǎo)致樣品不能完全洗脫且譜圖變形達(dá)不到分離的要求。大于此范圍，流動相A中緩沖鹽的濃度過高對色譜系統(tǒng)損傷較大，甚至?xí)糠之a(chǎn)生鹽析，導(dǎo)致無法純化。另外，流動相A的pH值也非常重要，不在2.5—3.5范圍達(dá)不到分離效果。
[0020]洗脫系統(tǒng)中A相和B相的比例是通過大量實(shí)驗(yàn)篩優(yōu)選得到的，B%低于20%樣品不能沖洗下色譜柱，B%大于45%樣品會提前沖出，都不能進(jìn)行純化。采用該溶劑系統(tǒng)純化，分離效果較現(xiàn)有技術(shù)會大幅提高，本步的收率90%左右，所得樣品的純度在98%以上，大大提高收率和純度，降低了生產(chǎn)成本。
[0021]所述步驟2)中使用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述色譜柱的柱子直徑和長度優(yōu)選為:5cmX 25cm, lOcmX 25cm或15cmX25cm。
[0022]步驟3)采用鹽析的方法對高血糖素樣品進(jìn)行進(jìn)一步的純化，使其純度達(dá)到99%以上。所述步驟3)下文也表述為“鹽析”。
[0023]所述“鹽析”是指通過控制步驟2)所得合格溶液中乙腈濃度和溶液的pH值，使高血糖素樣品析出的過程，所述合格溶液是指樣品純度大于95%的溶液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽析包括:通過常溫旋蒸的方法將步驟2)所得合格溶液中乙腈的比例降至15%以下，再將其pH值用20%的稀氨水調(diào)至6.0~7.0后放置到2_8攝氏度2~20小時(shí)，使其析出。再將渾濁液進(jìn)行離心處理，上清液作為廢液處理；下層固體用60%~100%的高氯酸的水溶液將其溶解后，再用注射用水稀釋一倍后轉(zhuǎn)入步驟4)即可。
[0024]該步驟提聞聞血糖素樣品的純度，將聞血糖素樣品的純度從大于95%到大于99.0%。另外，使用鹽析方法具有很大的成本優(yōu)勢，鹽析的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于反相色譜處理的成本，特別是在規(guī)?；a(chǎn)時(shí)尤為明顯。
[0025]步驟4)采用反相高效液相色譜法將高血糖素的硫酸鹽轉(zhuǎn)成鹽酸鹽。步驟4)下文也表述為“轉(zhuǎn)鹽”。
[0026]所述“反相高效液相色譜法”的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)鹽方法包括:將步驟3)所得的高血糖素樣品上樣，然后以0.1~0.8%(w/v)的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%:3%~10%梯度或等度沖洗15~30分鐘；然后用鹽酸水溶液乙腈體系洗脫，其中所使用的所述鹽酸水溶液的濃度為0.1%—0.4%(w/v),優(yōu)選為0.2% (w/v)。該洗脫步驟所采用的乙腈濃度為40~80%,收集鹽酸高血糖素溶液，濃縮，冷凍干燥后得鹽酸高血糖素。
[0027]所述步驟4)中使用以八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述色譜柱的柱子直徑和長度為:5cmX25cm, lOcmX 25cm或30cmX25cm。
[0028]本發(fā)明提供的純化鹽酸高血糖素的方法操作可行、純度高(可達(dá)99.0%以上且最大任一雜質(zhì)不大于0.1%)、收率高(純化收率可達(dá)80%以上)，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求(一批次可獲得200克以上的精肽)。
[0029]本發(fā)明采用反相色譜和鹽析結(jié)合的辦法進(jìn)行純化處理，適用于純度在20%以上的粗肽樣品的純化，且具有很大的成本優(yōu)勢，特別是在規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)尤為明顯。另外，本發(fā)明得到的鹽酸高血糖素純度較高可達(dá)99.0%以上，較生物合成具有較高純度。本發(fā)明的純化方法較現(xiàn)有技術(shù)大幅提高了產(chǎn)品的質(zhì)量，且純化成本也沒有升高，收率也大幅較高。
[0030]采用本發(fā)明方法所獲得的產(chǎn)品的純度可達(dá)99.0%以上，純化收率可達(dá)80%以上。且可以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，單批次產(chǎn)量可達(dá)200克以上?？纱蠓岣弋a(chǎn)品的質(zhì)量和降低成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為示出了鹽酸高血糖素純度的純化色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]參照以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。但是，應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于舉例說明目的，而不應(yīng)被理解為以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033]實(shí)施例
[0034]實(shí)施例1
[0035]1)前處理:用體積比30%的醋酸和5%的乙腈水溶液按照20g/L的濃度溶解化學(xué)合成法得到的粗肽，攪拌使樣品完全溶解后用Φ 0.45 μ的偏氟濾膜過濾，收集濾液。用純化水將粗肽溶液中的醋酸和乙腈二者的總體積百分?jǐn)?shù)稀釋到30%備用。其中所述粗肽是采用常規(guī)的固相合成法得到。
[0036]2)純化:
[0037]純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:5cmX25cm0流動 相:A相:0.1%硫酸和0.4%高氯酸(v/v)的水溶液，用氨水調(diào)pH值
2.5 ；B相:乙腈，流速:50-100ml/分鐘，梯度:B%:20%~40% (每3分鐘升高1%)，60分鐘，檢測波長:280nm。進(jìn)樣量為1.0-2.5g。
[0038]純化過程:將色譜柱用體積比40~60%的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為1.0-2.5g。線性梯度洗脫60分鐘，收集目的峰(為最大峰30~35分鐘)，檢測其色譜純度，將純度大于95%以上的樣品合并后于水溫35°C的條件下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓旋蒸濃縮，濃縮至剩余約一半的體積后轉(zhuǎn)入鹽析純化步驟。
[0039]3)鹽析純化
[0040]將濃縮后的溶液用氨水調(diào)pH值到6.0后,放置到2~8攝氏度下5小時(shí)。再將渾濁液進(jìn)行離心處理，離心條件:2500轉(zhuǎn)/分，5分鐘，室溫。上清液作為廢液處理；下層固體用60體積％的高氯酸水溶液將其溶解后，用注射用水稀釋一倍后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)鹽步驟。
[0041]4)轉(zhuǎn)鹽:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:5cmX25cm。將色譜柱用體積比50%以上的乙腈的醋酸溶液沖洗干凈后上樣，上樣量
1.0-2.5g，用B相為乙腈，A相為0.1% (w/v)的醋酸銨水溶液的色譜條件，按照B%為3% (體積比)的條件沖洗25-35分鐘，然后用B相為乙腈，A相為0.1%的鹽酸水溶液色譜條件，按照B%為5%的條件洗脫10分鐘后，換用B%為40%的條件洗脫，收集目的峰，將收集的高血糖素溶液于水溫不超過35°C條件下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓旋蒸濃縮至約50-200mg/mL，然后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于99.0%的鹽酸高血糖素。
[0042]實(shí)施例2
[0043]1)前處理:用體積比40%的醋酸和10%的乙腈水溶液按照30g/L的濃度溶解化學(xué)合成法得到的粗肽，攪拌使樣品完全溶解后用Φ0.45μ的偏氟濾膜過濾，收集濾液。用水將粗肽溶液中的醋酸和乙腈的體積比例之和稀釋到10%備用。
[0044]2)純化:`
[0045]純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:10CmX25Cm。流動相:A相:0.2%硫酸和0.3%高氯酸水溶液(v/v)，用氨水調(diào)pH值
3.0 ；B相:乙腈，流速:150-300ml/分鐘，梯度:B%:20%~40% (每3分鐘升高1%)，60分鐘，檢測波長:280nm。進(jìn)樣量為10_25g。
[0046]純化過程:將色譜柱用體積比50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為5-15g。線性梯度洗脫60分鐘，收集目的峰(為最大峰30-35分鐘)，檢測其色譜純度，將純度大于95%以上的合并后于水溫不超過35°C的條件下減壓旋蒸濃縮，濃縮至剩余約一半的體積后轉(zhuǎn)入鹽析純化步驟。
[0047]3)鹽析純化
[0048]將濃縮后的溶液用氨水調(diào)pH值到6.5，后,放置到2~8攝氏度下6小時(shí)。再將渾濁液進(jìn)行離心處理，離心條件:2500轉(zhuǎn)/分，5分鐘，室溫。上清液作為廢液處理；下層固體用80%高氯酸水溶液將其溶解后，用注射用水稀釋一倍后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)鹽步驟。
[0049]4)轉(zhuǎn)鹽:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:10cmX25cm。將色譜柱用體積比50%以上的乙腈醋酸溶液沖洗干凈后上樣，上樣量10-25g，用B相為乙腈，A相為0.3%的醋酸銨水溶液的色譜條件，按照B%為5%的條件沖洗25-35分鐘，然后用B相為乙腈，A相為0.2%的鹽酸水溶液的色譜條件，按照B%為5%的條件洗脫10分鐘后，換用B%為40%的條件洗脫，收集目的峰，將收集的高血糖素溶液于水溫不超過35°C條件下減壓旋蒸濃縮至約50-200mg/mL后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于99.0%的鹽酸高血糖素。
[0050]實(shí)施例3[0051 ] 1)前處理:用體積比60%的醋酸和20%的乙腈水溶液按照50g/L的濃度溶解化學(xué)合成法得到的粗肽，攪拌使樣品完全溶解后用Φ0.45μ的偏氟濾膜過濾，收集濾液。用水將粗肽溶液中的醋酸和乙腈的體積比例之和稀釋到20%備用。
[0052]2)純化:
[0053]純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:10CmX25Cm。流動相:A相:0.4%硫酸和0.1%高氯酸水溶液(v/v)，用氨水調(diào)pH值
3.5 ;B相:乙腈，流速:300-600ml/分鐘，梯度:B%:20%~40% (每3分鐘升高1%)，檢測波長:280nm。進(jìn)樣量為10_25g。
[0054]純化過程:將色譜柱用體積比50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為10-25g。線性梯度洗脫60分鐘，收集目的峰(為最大峰30-35分鐘)，檢測其色譜純度，將純度大于95%以上的合并后于水溫不超過35°C的條件下減壓旋蒸濃縮，濃縮至剩余約一半的體積后轉(zhuǎn)入鹽析純化步驟。
[0055]3)鹽析純化
[0056]將濃縮后的溶液用氨水調(diào)pH值到7.0,后,放置到2~8攝氏度下6小時(shí)。再將渾濁液進(jìn)行離心處理，離心條件:2500轉(zhuǎn)/分，5分鐘，室溫。上清液作為廢液處理；下層固體用100%高氯酸水溶液將其溶解后，用注射用水稀釋一倍后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)鹽步驟。
[0057]4)轉(zhuǎn)鹽:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:15cmX25cm。將色譜 柱用體積比50%以上的乙腈醋酸溶液沖洗干凈后上樣，上樣量10-25g，用B相為乙腈，A相為0.8%的醋酸銨水溶液的色譜條件，按照B%為10%的條件沖洗25-35分鐘，然后用B相為乙腈，A相為0.4%的鹽酸水溶液的色譜條件，按照B%為5%的條件洗脫10分鐘后，換用B%為50%的條件洗脫，收集目的峰，將收集的高血糖素溶液于水溫不超過35°C條件下減壓旋蒸濃縮至約50-200mg/mL后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于99.0%的鹽酸高血糖素。
【權(quán)利要求】
1.一種鹽酸高血糖素的純化方法，包括以下步驟:1)前處理:以體積比30%— 60%的醋酸和5% — 20%的乙腈水溶液按照濃度20g/L — 50g/L溶解粗肽，用水將粗肽溶液中的醋酸與乙腈二者的總體積百分?jǐn)?shù)稀釋到10% — 30% ；2)純化:將步驟1)所得粗肽溶液進(jìn)行色譜法梯度洗脫純化，以體積比0.1% — 0.4%的硫酸和體積比0.1% — 0.4%高氯酸的水溶液用氨水調(diào)pH值2.5 — 3.5后的溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%:20% — 40%洗脫，收集純化的高血糖素硫酸鹽溶液；3)使所得高血糖素硫酸鹽溶液鹽析；4)轉(zhuǎn)鹽:用反相高效液相色譜法將步驟3)所得高血糖素的硫酸鹽樣品轉(zhuǎn)鹽，將步驟3)所得的高血糖素樣品上樣，然后以0.1%—0.8%的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%S 3% —10%梯度或等度沖洗15 — 30分鐘；用鹽酸水溶液乙腈體系洗脫，所述鹽酸水溶液的濃度為0.1% — 0.4%，該洗脫步驟所采用的乙腈濃度為40%以上，收集鹽酸高血糖素溶液。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟2)中A相的pH為3.0。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述步驟2)中的色譜法使用色譜柱，其直徑和長度為 5cmX 25cm, lOcmX 25cm 或 15cmX 25cm。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟2)中的色譜法使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟3)的鹽析包括:通過常溫旋蒸的方法將步驟2)所得溶液中乙腈的比例降至15%以下，`將所得溶液的pH值用稀氨水調(diào)至6.0~7.0后放置到2-8攝氏度2~20小時(shí)，得到其中高血糖素樣品析出的渾濁液將所得渾濁液進(jìn)行離心處理，上清液作為廢液處理，下層固體用60%~100%的高氯酸水溶液將其溶解后，再用注射用水稀釋一倍后轉(zhuǎn)入步驟4)即可。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述稀氨水濃度為20%。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟4)中的色譜法使用色譜柱，其直徑和長度為 5cmX 25cm, lOcmX 25cm 或 30cmX 25cm。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟4)中的色譜法使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟4)中醋酸銨溶液為0.3%。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟4)中所述鹽酸水溶液的濃度為`0.2%。
【文檔編號】C07K1/36GK103694338SQ201310717379
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】趙忠衛(wèi), 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司