一種多特異性融合抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多特異性融合抗體及其應(yīng)用，特別是一種能同時(shí)與四種殘留藥物發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的抗體，屬于免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過將氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的VH和VL基因進(jìn)行整合，得到能同時(shí)與上述四種殘留藥物發(fā)生反應(yīng)的多特異性抗體。以此多聯(lián)特異性融合單鏈抗體為探針建立一種快速的免疫學(xué)檢測(cè)方法，從而達(dá)到一次性、快速、篩檢多種殘留藥物的目的。
【專利說明】一種多特異性融合抗體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多特異性融合抗體，特別是一種能同時(shí)與四種殘留藥物發(fā)生免疫 學(xué)反應(yīng)的抗體，屬于免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)的單克隆抗體由于其分子本身F。龐大結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得其在疾病診斷和治療方 面存在許多問題：首先，傳統(tǒng)單克隆抗體都是異源性的，誘發(fā)免疫反應(yīng)普遍較強(qiáng)；其次，在 體內(nèi)代謝快，特異性稍差；再次，雜交瘤技術(shù)篩選的單克隆抗體多數(shù)只能保持天然抗體的活 性，且挑選的抗體無中和抗原生物活性的能力，要挑選中和性抗體是相當(dāng)復(fù)雜和困難的。最 后，許多特異性抗體在體內(nèi)并不能夠完全發(fā)揮其預(yù)期的凝集活性；許多優(yōu)良的抗體雜交瘤 細(xì)胞株在傳代過程中穩(wěn)定性不強(qiáng)，容易丟失。再附以制備工作過程繁瑣拖沓和費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使 得單克隆抗體技術(shù)的普及一度受限。
[0003] 單鏈抗體，是在DNA水平上將抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因用一段適當(dāng)?shù)墓押?苷酸（Linker)連起來，使之在適當(dāng)生物體中表達(dá)成為一條單一肽鏈，稱為單鏈抗體 (SinglechainFv，ScFv)。作為一個(gè)重要基因工程抗體，ScFv更易于在原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和 在基因水平進(jìn)行改造。對(duì)ScFv的進(jìn)一步研究中，在取得了重大進(jìn)展的同時(shí)，一些應(yīng)用于臨 床出現(xiàn)的問題也暴露出來，如親和力較低，穩(wěn)定性較差，半衰期短等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)也限制 著ScFv在治療過程中的普及性。
[0004] 利用兩種不同的單鏈抗體的Vh和 '基因，使其在表達(dá)過程中實(shí)現(xiàn)重新組合，形成 具有雙特異性的單鏈抗體，這種雙特異性單鏈抗體可以同時(shí)與兩種抗原特異性地結(jié)合。與 傳統(tǒng)的雙特異性抗體相比，雙特異性單鏈抗體既保持了特異性結(jié)合抗原的特點(diǎn)，又具有以 下優(yōu)點(diǎn)：缺失Fc片段，減少了與FcR陽性細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性；最大限度地降 低了鼠源性蛋白和免疫變態(tài)反應(yīng)的可能性；分子量小，有利于穿透腫瘤組織；避免了傳統(tǒng) 制備雙特異性抗體需要進(jìn)行細(xì)胞雜交的步驟，減少了工作量，提高了制備的成功率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種多特異性融合抗體，是將來源于小鼠的4 種單鏈抗體的V h和 '基因進(jìn)行整合得到，含有8個(gè)抗體重鏈與8個(gè)抗體輕鏈。
[0006] 所述4種單鏈抗體分別是氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單 鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體。
[0007] 所述多特異性抗體，包含（a)氯霉素單鏈抗體的V1^P '基因片段；（b)環(huán)丙沙星 單鏈抗體的Vh和 '基因片段；（c)磺胺二甲嘧啶單鏈抗體的單鏈抗體片段；（d)克倫特羅 單鏈抗體的單鏈抗體片段；所述片段（a)、（b)、（c)、（d)通過有別于組裝單鏈抗體基因的連 接肽連接。
[0008] 所述融合抗體包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域可與氯霉素的表位結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域 可與磺胺二甲嘧啶的表位結(jié)合，第三結(jié)構(gòu)域可與環(huán)丙沙星的表位結(jié)合，第四結(jié)構(gòu)域可與克 倫特羅的表位結(jié)合。
[0009] 編碼所述融合抗體的基因序列為SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 獲得所述融合抗體的方法是通過PCR獲得氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、 磺胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的Vh和 '，并通過重疊 PCR將4個(gè)片段連接起 來，純化后雙酶切、回收、連接到表達(dá)載體PGEX-6P-1，得到重組質(zhì)粒pGEX-CCSC，轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序驗(yàn)證后，將重組質(zhì)粒pGEX-CCSC轉(zhuǎn)化DE3在20°C條件下培養(yǎng)表達(dá)融合抗 體。
[0011] 本發(fā)明所提供的多特異性融合抗體具有廣譜特異、低耗高效和靈敏便捷地同步篩 檢多種殘留獸藥的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為構(gòu)建重組蛋白pET-22b-CPFX - ScFv的載體。
[0013] 圖2為pET-22b-CAP-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE ;
[0014] (1 :未誘導(dǎo)，2?5 :1?4h誘導(dǎo)，6 :空載體對(duì)照，7 :Marker，8?10 :5?7h誘導(dǎo))。
[0015] 圖3為pET-22b-CPFX-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE ;
[0016] (I :0h，2 :lh，3 :2h，4 :3h，5 :4h，6 :5h，7 :Marker，8、9 :空載體對(duì)照）。
[0017] 圖4為pET-22b-SM2-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE ;
[0018] (1 :未誘導(dǎo)，2?5 :1?4h誘導(dǎo)，6 :Marker，7?9 :5?7h誘導(dǎo)，10 :空載體對(duì)照)。
[0019] 圖5為pET-22b-CL-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE ;
[0020] (1 :未誘導(dǎo)，2?5 :1?4h誘導(dǎo)，6 :Marker，7?9 :5?7h誘導(dǎo)，10 :空載體對(duì)照)。
[0021] 圖6為重組質(zhì)粒pGEX-CCSC (DE3)梯度誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE ;
[0022] (M :蛋白 Marker (200,130,97. 4,66. 2,43ku)，1 :誘導(dǎo)的 pGEX-6P-l 載體，2 :誘導(dǎo) 的 pGEX-CCS 載體，3、4 :未誘導(dǎo)的 pGEX-CCS 載體，5-9 :誘導(dǎo)的 pGEX-CCSClh-5h)。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1氯霉素、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克倫特羅單鏈抗體的制備
[0024] 采用化學(xué)合成的方法分別獲得氯霉素、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克倫特羅單鏈 抗體。編碼氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺胺二甲嘧啶單鏈抗體、克倫特羅單鏈抗 體的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 所示。
[0025] 實(shí)施例2氯霉素、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克倫特羅單鏈抗體在pET_22b (+)原 核載體中表達(dá)
[0026] 利用實(shí)施例1中的4個(gè)基因與pET-22b表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建pET-22b-CAP-ScFv、 pET-22b-CPFX-ScFv、pET-22b-SM2-ScFv 表達(dá)載體和 pET-22b-CL-ScFv。以 pET-22b-CPFX -ScFv的構(gòu)建為例進(jìn)行說明，詳見圖1，其余質(zhì)粒的構(gòu)建參見pET-22b-CPFX - ScFv的構(gòu)建方 法。
[0027] 目的基因產(chǎn)物與表達(dá)載體質(zhì)粒的雙酶切體系為如表1。雙酶切的目的片段純化回 收，按表2體系連接，瞬時(shí)離心混勻于管底。4°C連接過夜，備用。
[0028] 表1雙酶切體系
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種多特異性融合抗體，其特征在于，是將氯霉素單鏈抗體、環(huán)丙沙星單鏈抗體、磺 胺二甲嘧啶單鏈抗體和克倫特羅抗體的VH和 '基因進(jìn)行整合得到。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合抗體，其特征在于，所述多特異性抗體，包含（a)氯霉素 單鏈抗體的VH和 '基因片段；（b)環(huán)丙沙星單鏈抗體的VH和 '基因片段；（c)磺胺二甲嘧 啶單鏈抗體的單鏈抗體片段；（d)克倫特羅單鏈抗體的單鏈抗體片段；所述片段（a)、（b)、 (c)、（d)通過有別于組裝單鏈抗體基因的連接肽連接。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合抗體，其特征在于，所述融合抗體包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一 結(jié)構(gòu)域可與氯霉素的表位結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域可與磺胺二甲嘧啶的表位結(jié)合，第三結(jié)構(gòu)域可 與環(huán)丙沙星的表位結(jié)合，第四結(jié)構(gòu)域可與克倫特羅的表位結(jié)合。
4. 編碼權(quán)利要求1所述融合抗體的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所 /_J、i 〇
5. 含有權(quán)利要求4所述基因的質(zhì)?；蚣?xì)胞。
6. 獲得權(quán)利要求1所述融合抗體的方法，其特征在于，是化學(xué)合成序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5所示的4條單鏈抗體基因，連接表達(dá)載 體 pET-22b，分別構(gòu)建 pET-22b-CAP-ScFv、pET-22b-CPFX-ScFv、pET-22b-SM2-ScFv 和 pET-22b-CL-ScFv;設(shè)計(jì)合成引物，通過PCR方法從制備的四個(gè)重組質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得四個(gè)單 鏈抗體的VH和 '基因片段，再通過重疊PCR組裝起來，所得目的基因純化后連接到表達(dá)載 體PGEX-6P-1上，得到重組質(zhì)粒pGEX-CCSC，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選測(cè)序正確的重組質(zhì) 粒pGEX-CCSC轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)BL21 (DE3)，在20°C條件下誘導(dǎo)表達(dá)。
7. 權(quán)利要求1所述融合抗體在殘留藥物檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/46GK104371020SQ201310721847
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王穎, 柳增善, 張東杰, 安宇, 霍方珍 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)