一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應用，屬于免疫快速篩檢【技術(shù)領域】。本發(fā)明通過將環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的VH和VL基因進行整合得到能同時與上述2種殘留藥物發(fā)生反應的多特異性抗體。以此多聯(lián)特異性融合單鏈抗體為探針建立一種快速的免疫學檢測方法，從而達到一次性、快速、篩檢多種殘留藥物的目的。
【專利說明】一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應用，特別是一種能同時與2種殘留藥物發(fā)生免疫學反應的抗體，屬于免疫快速篩檢【技術(shù)領域】。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的單克隆抗體由于其分子本身F。龐大結(jié)構(gòu)特點，使得其在疾病診斷和治療方面存在諸多弊端:首先傳統(tǒng)單克隆抗體的異源性使得誘發(fā)免疫反應普遍較強；其次，在體內(nèi)代謝快，特異性稍差；再次，雜交瘤技術(shù)篩選的單克隆抗體多數(shù)只能保持天然抗體的活性，且挑選的抗體無中和抗原生物活性的能力，要挑選中和性抗體是相當復雜和困難的。最后，許多特異性抗體在體內(nèi)并不能夠完全發(fā)揮其預期的凝集活性；許多優(yōu)良的抗體雜交瘤細胞株在傳代過程中穩(wěn)定性不強，容易丟失。再附以制備工作過程繁瑣拖沓和費時費力，使得單克隆抗體技術(shù)的普及一度受限。
[0003]單鏈抗體，是在DNA水平上將抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因用一段適當?shù)墓押塑账?Linker)連起來，使之在適當生物體中表達成為一條單一肽鏈，稱為單鏈抗體(SinglechainFv, ScFv)。作為一個重要基因工程抗體,ScFv更易于在原核細胞進行表達和在基因水平進行改造。對ScFv的進一步研究中，在取得了重大進展的同時，一些應用于臨床出現(xiàn)的問題也暴露出來，如親和力較低，穩(wěn)定性較差，半衰期短等缺點，這些缺點也限制著ScFv在治療過程中的普及性。`
[0004]利用兩種不同的單鏈抗體的Vh和\基因，使其在表達過程中實現(xiàn)重新組合，形成具有雙特異性的單鏈抗體，這種雙特異性單鏈抗體可以同時與兩種抗原特異性地結(jié)合。與傳統(tǒng)的雙特異性抗體相比，雙特異性單鏈抗體既保持了特異性結(jié)合抗原的特點，又具有以下優(yōu)點:缺失Fe片段，減少了與FcR陽性細胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性；最大限度地降低了鼠源性蛋白，降低了免疫變態(tài)反應的可能性；分子量小，有利于穿透腫瘤組織；避免了傳統(tǒng)制備雙特異性抗體需要進行細胞雜交的步驟，減少了工作量，提高了制備的成功率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應用，是將來源于小鼠的2種單鏈抗體的Vh和\基因進行整合得到，含有4個抗體重鏈與4個抗體輕鏈。
[0006]所述2種單鏈抗體分別是環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體，編碼相應抗體的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3所示。
[0007]所述多特異性抗體，包含(a)環(huán)丙沙星單鏈抗體的Vh和 '基因片段；(b)克倫特羅單鏈抗體的單鏈抗體片段；所述片段(a)、(b)通過有別于組裝單鏈抗體基因的連接肽連接。
[0008]所述融合抗體包含2個結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域可與環(huán)丙沙星的表位結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域可與克倫特羅的表位結(jié)合。[0009]編碼所述融合抗體的基因序列為SEQ ID NO:1所示。
[0010]獲得所述融合抗體的方法是采用自行設計的特異性簡并引物，PCR獲取環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的Vh和\，再通過重疊PCR將重鏈輕鏈片段分別組裝成單鏈抗體，利用柔性linker串聯(lián)連接，純化后雙酶切、回收、分別連接到表達載體pGEX_6P_l，得到重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL，(構(gòu)建方案如圖2所示)轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，測序驗證后，將重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL轉(zhuǎn)化DE3在20°C條件下培養(yǎng)表達融合抗體。
[0011]本發(fā)明所提供的多特異性融合抗體具有廣譜特異、低耗高效和靈敏便捷地同步篩檢多種殘留獸藥的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為構(gòu)建重組蛋白pET-22b_CPFX - ScFv的載體。
[0013]圖2為構(gòu)建重組蛋白pET-22b-CPFX_CL - ScFv的載體。
[0014]圖3pET-22b-CPFX-ScFv不同時間內(nèi)的誘導表達SDS-PAGE分析；
[0015](l,0h ;2，lh ;3，2h ;4，3h ;5，4h ;6，5h ；7,Marker ;8，空載體對照；9，空載體對照)。
[0016]圖4pET-22b-CL-ScFv不同時間內(nèi)的誘導表達SDS-PAGE分析；
[0017](l，2h ;2，3h ;3，4h ;4，5h ;5，對照；6，Marker ;7，6h ;8，7h ;9，8h ;10，9h)。
[0018]圖5IPTG誘導表達雙特異性融合蛋白電泳圖；
[0019](I,Oh ;2，Ih ;3，2h ;4，3h ;5，4h ;6，5h ;7，6h ;8，蛋白 Marker)D
`【具體實施方式】
[0020]實施例1環(huán)丙沙星和克倫特羅單鏈抗體的制備
[0021]采用化學合成的方法分別獲得環(huán)丙沙星和克倫特羅單鏈抗體。編碼環(huán)丙沙星單鏈抗體、克倫特羅單鏈抗體的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示。
[0022]實施例2環(huán)丙沙星和克倫特羅單鏈抗體在pET_22b (+)原核載體中表達
[0023]利用實施例1中的2個基因與pET_22b表達系統(tǒng)，分別構(gòu)建pET-22b-CPFX_ScFV和pET-22b-CL-ScFv。以pET_22b_CPFX - ScFv的構(gòu)建為例進行說明，詳見圖1，pET-22b-CL-ScFv質(zhì)粒的構(gòu)建參見pET_22b_CPFX - ScFv的構(gòu)建方法。
[0024]目的基因產(chǎn)物與表達載體質(zhì)粒的雙酶切體系為如表1。雙酶切的目的片段純化回收，按表2體系連接，瞬時離心混勻于管底。4°C連接過夜，備用。
[0025]表lpET-22b-CPFX_ScFv 雙酶切體系
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種雙特異性融合抗體，其特征在于，是將來源于小鼠的2種單鏈抗體的V1^P '基因進行整合得到；所述2種單鏈抗體分別是環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合抗體，其特征在于，2種單鏈抗體的Vh和\基因通過有別于組裝單鏈抗體基因的連接肽連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合抗體，其特征在于，所述融合抗體包含2個結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域可與環(huán)丙沙星的表位結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域可與克倫特羅的表位結(jié)合。
4.編碼權(quán)利要求1所述融合抗體的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
5.含有權(quán)利要求4所述基因的質(zhì)?；蚣毎?。
6.獲得權(quán)利要求1所述融合抗體的方法，其特征在于，是化學合成序列如SEQID NO:2, SEQ ID NO:3所示的2條單鏈抗體基因，連接表達載體pET_22b，分別構(gòu)建pET-22b-CPFX-ScFv和pET-22b-CL_ScFv ;設計合成引物，通過PCR方法從制備的2個重組質(zhì)粒中擴增獲得2個單鏈抗體的Vh和\基因片段，再通過重疊PCR組裝起來，所得目的基因純化后連接到表達載體PGEX-6P-1上，得到重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，篩選測序正確的重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)BL21 (DE3)，在20°C條件下誘導表達融合抗體。
7.權(quán)利要求1所述融合抗 體在殘留藥物檢測中的應用。
【文檔編號】C07K16/44GK103694354SQ201310749804
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】王穎, 張東杰, 柳增善, 姚笛, 霍方珍 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學