用于治療神經(jīng)炎癥性疾病的因子xii抑制劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)涉及神經(jīng)炎癥性疾病例如多發(fā)性硬化以及施用因子X(jué)II抑制劑以預(yù)防、治療或另外地改善神經(jīng)炎癥性疾病例如多發(fā)性硬化的方法。還提供了抑制FXII的活性試劑和包含所述試劑的藥物組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于治療神經(jīng)炎癥性疾病的因子X(jué)l I抑制劑
[0001]本申請(qǐng)涉及神經(jīng)炎癥性疾病例如多發(fā)性硬化，以及施用因子X(jué)II抑制劑以預(yù)防、治療或另外地改善神經(jīng)炎癥性疾病例如多發(fā)性硬化的效應(yīng)的方法。還提供了抑制FXII活性的試劑和包含所述試劑的藥物組合物。
[0002]多發(fā)性硬化(MS)是一系列神經(jīng)炎癥性疾病的部分，所述神經(jīng)炎癥性疾病包括免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)、脫髓鞘作用和軸突/神經(jīng)元損傷作為它們的病理學(xué)的部分。世界衛(wèi)生組織(ICD-9-CM診斷代碼340)將MS描述為慢性疾病，其特征在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在許多脫髓鞘區(qū)域，具有癥狀例如虛弱、動(dòng)作失調(diào)、感覺(jué)錯(cuò)亂(paresthesis)和言語(yǔ)錯(cuò)亂。MS和其它與其相似的疾病由其中炎癥細(xì)胞侵入神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致脫髓鞘和組織破壞的自身免疫攻擊引起。(Morales 等人，Adv Neurol 2006 ;98:27-45 ;Frohman 等人，N Engl J Med 2006 ；354:942-55)。組織病理學(xué)結(jié)論是具有細(xì)胞浸潤(rùn)(T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)的MS斑，其最終據(jù)信引起少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和軸突損傷。隨著破壞性過(guò)程進(jìn)展，脫髓鞘導(dǎo)致認(rèn)知功能受損。(Ragonese 等人，Eur J Neurol 2008 ; 15:123-7 ;Bergamaschi 等人，Neuroepidem1logy2005 ；25:15-18)。
[0003]脫髓鞘是形成圍繞神經(jīng)軸突的絕緣層的髓鞘的丟失。取決于解剖學(xué)位置，髓磷脂由不同的細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生。少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的軸突的髓鞘，而施旺細(xì)胞形成周?chē)S突的髓鞘。髓磷脂由數(shù)種蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，包括髓磷脂堿蛋白(MBP)、髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、半乳糖腦苷脂(GalC)和鞘磷脂。
[0004]脫髓鞘疾病的體征和癥狀取決于脫髓鞘的位置而變化。一些常見(jiàn)體征和癥狀包括視覺(jué)問(wèn)題(復(fù)視、眼球震顫或視力喪失)、麻刺感或麻痹(感覺(jué)異常)、說(shuō)話(huà)障礙、記憶喪失、熱敏感性、肌肉痙攣、肌無(wú)力和協(xié)調(diào)或平衡的喪失。
[0005]名稱(chēng)“多發(fā)性硬化”是指在腦中和脊髓中在其中髓磷脂喪失的區(qū)域中形成的多個(gè)疤痕(“硬化”)或損傷。MS的疾病模式可變化。根據(jù)美國(guó)全國(guó)多發(fā)性硬化癥學(xué)會(huì)，存在4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化亞型:(I)復(fù)發(fā)緩解型(relapsing remitting), (2)繼發(fā)進(jìn)行型(secondaryprogressive), (3)原發(fā)性進(jìn)行型(primary progressive)和(4)進(jìn)展復(fù)發(fā)型(progressiverelapsing)。復(fù)發(fā)緩解型是最常見(jiàn)的最初病程，特征在于間隔以可持續(xù)數(shù)月至數(shù)年的緩解期的發(fā)作，在所述緩解期不存在疾病的新體征。繼發(fā)進(jìn)行型疾病，如名稱(chēng)所暗示的，開(kāi)始作為復(fù)發(fā)緩解型MS，但明確的緩解期最終消失。原發(fā)性進(jìn)行性亞型描述了其中在初始發(fā)作后從未存在有意義的緩解的疾病。在進(jìn)展復(fù)發(fā)型疾病中，從發(fā)作開(kāi)始存在穩(wěn)定的神經(jīng)衰落，但此外還存在迭合發(fā)作。
[0006]多發(fā)性硬化可使用McDonald標(biāo)準(zhǔn)2010修正版來(lái)診斷,所述診斷依賴(lài)于結(jié)合臨床表現(xiàn)的磁共振成像(MRI)。(Polman等人，Ann Neurol 2011;69:292-302.)。通常地，呈現(xiàn)2或更多次發(fā)作或具有兩個(gè)或更多個(gè)客觀臨床病變的患者被認(rèn)為患有MS而無(wú)需另外的臨床證據(jù)。在具有更少的發(fā)作或更少的可證據(jù)的病變的患者中，診斷基于臨床或臨床和診斷(MRI)發(fā)現(xiàn)顯示的病變?cè)诳臻g和/或時(shí)間上的擴(kuò)散的客觀證據(jù)。
[0007] MS的病因?qū)W還不清楚，但通常接受其為其中身體的免疫系統(tǒng)破壞CNS中的髓磷脂的自身免疫疾病° (Internat1nal Multiple Sclerosis Genetics Consortium ；ffellcomeTrust Case Control Consortium 2, Nature 2011;476:214-9.)。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)入 CNS 的先決條件是通常保護(hù)CNS免受浸潤(rùn)的血腦屏障的破壞。該過(guò)程導(dǎo)致CNS炎癥，其為MS的第二病理學(xué)標(biāo)志。與許多自身免疫疾病一樣，MS在婦女中比在男性中更常見(jiàn)，影響大致每100，000人中的3個(gè)人。(Alonso, 2008.) 0除了 MS以外，還存在其它脫髓鞘炎癥性疾病。例如，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其它脫髓鞘炎癥性疾病包括特發(fā)性炎癥性脫髓鞘疾病、橫貫性脊髓炎和視神經(jīng)脊髓炎(Devic’s病)。炎癥性脫髓鞘還可在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中發(fā)生:實(shí)例包括格-巴二氏綜合征、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、米勒.費(fèi)希爾綜合征和抗-MAG周?chē)窠?jīng)病。
[0008]用于MS的目前治療基于疾病的自身免疫性質(zhì)并且至少部分地基于使用實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行開(kāi)發(fā)。(StUve等人，Arch Neurol.2010 ；67:1307-15.)。由FDA于2010批準(zhǔn)用于治療MS的復(fù)發(fā)型的芬戈莫德是通過(guò)隔離淋巴細(xì)胞、據(jù)認(rèn)為參與介導(dǎo)髓磷脂的破壞的免疫細(xì)胞起作用的磷脂。(GILENYA (芬戈莫德)，處方信息，07/2011版)。芬戈莫德于2010年在歐洲也接受用于治療慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病的孤兒藥候選藥物認(rèn)證(orphan drug designat1n) (EU/3/09/718)。用于MS的老年人治療包括干擾素β-1a和干擾素β-1b以及格拉默醋酸鹽，其為免疫調(diào)節(jié)劑。(Herrmann等人，Am.J.Pathol.2010 ; 177:3051-60 ； Stuve 等人,Arch Neurol.2010 ;67:1307-15.)。那他珠單抗(抗整聯(lián)蛋白α 4的人源化單克隆抗體)于2004年被批準(zhǔn)用于治療具有MS的復(fù)發(fā)型的患者。(TYSABRI (那他珠單抗)處方信息，08/2011版)。其通常用作二線(xiàn)治療，因?yàn)槠涫褂门c增加的發(fā)生威脅生命的病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(PML，進(jìn)行性多病灶腦白質(zhì)病)。那他珠單抗阻斷白細(xì)胞對(duì)某些參與細(xì)胞從血液至組織內(nèi)的通過(guò)的細(xì)胞粘附分子的結(jié)合。因此，那他珠單抗被認(rèn)為通過(guò)阻止免疫細(xì)胞至CNS內(nèi)的通過(guò)，從而阻止髓磷脂的進(jìn)一步破壞起作用。米托蒽醌是阻斷DNA合成的試劑，因此可減弱淋巴細(xì)胞增殖的能力。
[0009]雖然目前批準(zhǔn)的療法的每一種療法在至少減少M(fèi)S的復(fù)發(fā)型的發(fā)作的次數(shù)上顯示一定的效果，但它們的效果有限，并且在許多情況下與顯著的副作用相關(guān)，從而使得長(zhǎng)期治療不現(xiàn)實(shí)。因此，存在對(duì)另外療法的遠(yuǎn)未滿(mǎn)足的生物醫(yī)學(xué)需要。
[0010]因子X(jué)II (FXII)是參與內(nèi)源性凝血級(jí)聯(lián)的活化的絲氨酸蛋白酶。其在1955年被鑒定為通過(guò)與多聚陰離子接觸而被激活(接觸激活)的凝血因子。在體內(nèi)這些表面包括由活化血小板分泌的無(wú)機(jī)多磷酸(PolyP) (Muller等人，2010)、內(nèi)皮細(xì)胞表面(qClqR)、細(xì)胞角蛋白1、尿激酶-纖溶酶原激活物(u-PAR，CD87)、關(guān)節(jié)軟骨、皮膚、脂肪酸、內(nèi)毒素、蛋白聚糖(硫酸肝素、硫酸軟骨素E、肥大細(xì)胞肝素)和淀粉樣蛋白。(Schmaier，2008.)。在FXII已被激活以形成FXIIa后，存在其中FXIIa激活循環(huán)FXII的正反饋反應(yīng)。多種FXII抑制(從小分子變化至蛋白質(zhì))是可獲得的。雖然FXII是內(nèi)源性途徑中起始因子，但因子X(jué)II缺乏不促成出血，因?yàn)橥庠葱?組織因子)途徑是血塊形成的主要途徑。
[0011]盡管其在內(nèi)源性途徑中作用得以公認(rèn)，但因子X(jué)II的生理作用仍然不清楚。(Schmaier, J.Clin.1nvest.2008 ；118:3006-9 ；Stavrou &Schmaier, Thromb.Res.2010.)。FXII通過(guò)緩激肽的形成(通過(guò)激肽-激肽釋放酶系統(tǒng))參與炎癥過(guò)程。緩激肽造成發(fā)紅、熱、腫脹和疼痛的典型炎癥參數(shù)，這通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的活化(以增加血管通透性)、一氧化氮的產(chǎn)生)和花生四烯酸的動(dòng)員，以及通過(guò)刺激感覺(jué)神經(jīng)末稍引起。其還參與缺血的病理性血栓形成。(Kleinschnitz 等人，J.Exp.Med.2006 ;203:513-8.)。FXII 的另一個(gè)作用在于中性粒細(xì)胞的趨化作用、聚集和脫粒。(Wachtfogel等人，1986.)。其還可增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子IL-1的單核細(xì)胞產(chǎn)生，以及參與補(bǔ)體系統(tǒng)。
[0012]某些實(shí)施方案的概述
[0013]因此，F(xiàn)XII參與多個(gè)復(fù)雜途徑，但仍然不清楚FXII在體內(nèi)對(duì)于這些途徑中的任何途徑是否是必需的。例如，缺乏FXII的人即使在大手術(shù)過(guò)程中也不遭受異常出血素質(zhì)。(Schmaier, J.Clin.1nvest.2008 ; 118:3006-9.)。此外，雖然 FXII 可參與纖維蛋白沉積，已報(bào)道其在MS中被激活(Marik等人Brain 2007 ; 130:2800-15)，和參與也可促成MS的緩激肽的激活(Gliibel等人J.Autoimmunity 2011 ;36:106-14),但不清楚其是引起這些效應(yīng)的FXII依賴(lài)性途徑還是共有相同的最終結(jié)果(例如通過(guò)外源性凝血途徑產(chǎn)生的血纖蛋白沉積)的另一個(gè)途徑。因此，目前缺乏FXII在MS的任何病理特性中的作用的直接證據(jù)。
[0014]雖然因子X(jué)II (FXII)在炎癥性脫髓鞘中的作用目前未被承認(rèn)，但本申請(qǐng)的實(shí)施方案提供FXII的抑制劑以預(yù)防、治療或改善多發(fā)性硬化和炎癥性脫髓鞘的其它形式。本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸┯靡蜃覺(jué)II抑制劑以預(yù)防、治療或另外地改善神經(jīng)炎癥性疾病包括多發(fā)性硬化的效應(yīng)的方法?！癋XII抑制劑”是指因子X(jué)II和活化因子X(jué)II (FXIIa)的任一種或兩種的抑制劑。
[0015]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善神經(jīng)炎癥性疾病的方法，包括給有些需要的受試者施用治療有效量的因子X(jué)II (FXII)抑制劑，從而預(yù)防、治療或改善神經(jīng)炎癥性疾病。
[0016]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了因子X(jué)II的抑制劑以用于預(yù)防、治療或改善神經(jīng)炎癥性疾病，包括給有此需要的受試者施用治療有效量的因子X(jué)II (FXII)抑制劑。
[0017]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了因子X(jué)II抑制劑用于預(yù)防、治療或改善神經(jīng)炎癥性疾病的用途，包括給有此需要的受試者施用治療有效量的因子X(jué)II (FXII)抑制劑。
[0018]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑可包括野生型infestin-4多肽序列(SEQ ID NO:2)或其變體，其中所述變體包含:(a) SEQ ID N0:2的N末端氨基酸2-13 ;和N末端氨基酸外部的至少I(mǎi)個(gè)和多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生型infestin-4序列的差異；和/或(b)6個(gè)保守半胱氨酸殘基；和與野生型infestin-4序列至少70%的同源性。
[0019]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑可包括SPINK-1 (SEQ IDNO: 3)，其被突變來(lái)包括SEQ ID NO: 2的N末端氨基酸2-13，或突變的SPINK-1的變體，其中變體包含(a) SEQ ID NO: 2的N末端氨基酸2_13 ;和N末端氨基酸外部的至少I(mǎi)個(gè)和多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生SPINK-1序列的差異和增加變體與野生型infestin-4序列的同源性；和/或(b) 6個(gè)保守半胱氨酸殘基；和與野生型SPINK-1序列至少70%的同源性。
[0020]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑可包括SPINK-1或SPINK-1突變體 K1、K2 或 K3(分別地 SEQ ID N0S: 3、4、5 或 6)。
[0021] 在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑可包括H-D-Pro-Phe-Arg-氯甲基酮(PCK)、AT II1、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、Cl抑制劑、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶素([(S)-1-羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro_Pro-乙醛-二甲基醋酸酯、DX88、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制劑、牛胰蛋白酶抑制劑的突變體、ecotin、YAP(yellowfin sole anticoagulant protein,黃蓋蝶抗凝蛋白)、笑瓜(Cucurbitamaxima)胰蛋白酶抑制劑-V或笑瓜同效抑制劑。
[0022]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑可包含抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗體結(jié)合FXII并抑制其活性和/或激活。
[0023]在其中FXII抑制劑是抗體或其抗原結(jié)合片段的那些實(shí)施方案中，抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段可包含(a)包含SEQ ID N0:9中所示的重鏈CDR1、SEQ ID N0:11中所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 13中所示的重鏈CDR3的VH區(qū)；和/或(b)包含SEQ ID NO: 14中所示的輕鏈⑶Rl、SEQ ID NO: 15中所示的輕鏈⑶R2和SEQ ID NO: 17中所示的輕鏈⑶R3的VL區(qū)。在這些實(shí)施方案中的一些實(shí)施方案中，抗-FXII抗體或其抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)包含SEQ ID NO:9中所示的重鏈CDRl、SEQ ID NO: 10中所示的重鏈CDR2和SEQID NO: 12中所示的重鏈CDR3的VH區(qū)；和/或(b)包含SEQ ID NO: 14中所示的輕鏈CDR1、SEQ ID NO: 15中所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16中所示的輕鏈CDR3的VL區(qū)。在某些實(shí)施方案中，抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段包含含有SEQ ID NO:7的VH區(qū)和包含SEQ IDNO:8的VL區(qū)。在牽涉抗體的任何實(shí)施方案中，抗-FXII抗體可以是IgG。在任何實(shí)施方案中，當(dāng)以1:0.2的FXIIa-α對(duì)抗體的摩爾比使用時(shí)，抗-因子X(jué)II/XIIa單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段可抑制人因子X(jué)IIa-α超過(guò)50%。
[0024]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，可將FXII抑制劑連接于半衰期增強(qiáng)多肽，所述多肽為白蛋白、維生素E結(jié)合蛋白(afamin)、α _甲胎蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、人白蛋白或其變體、免疫球蛋白或其變體、PEG或其變體或IgG的Fe。在這些實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半衰期增強(qiáng)肽通過(guò)接頭連接于FXII抑制劑。在牽涉接頭的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，接頭可以是(a )可切割的；(b)可被內(nèi)源性、外源性或共同凝血途徑的凝血蛋白酶切割；和/或(C)可被因子X(jué)IIa切割。
[0025]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑可包括人白蛋白-接頭-FXII融合蛋白。
[0026]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，神經(jīng)炎癥性疾病可以是多發(fā)性硬化(MS)。在那些牽涉MS的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，MS可以是復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化。在其它牽涉MS的其他方案中，MS可以是原發(fā)性進(jìn)行型多發(fā)性硬化。
[0027]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，神經(jīng)炎癥性疾病可以是橫貫性脊髓炎。
[0028]在本發(fā)明的任何方面的各種實(shí)施方案中，神經(jīng)炎癥性疾病可以是視神經(jīng)脊髓炎(Devic，s 病)。
[0029]本申請(qǐng)中的實(shí)施方案的其它目的和有利方面部分地出現(xiàn)于下列說(shuō)明中并且根據(jù)說(shuō)明書(shū)將部分地很明了，或它們可在實(shí)踐中習(xí)得。實(shí)施方案的目的和有利方面本身將通過(guò)在所附權(quán)利要求中特別指出的元素和組合來(lái)表現(xiàn)出來(lái)。
[0030]附圖概述
[0031]圖1顯示infestin的氨基酸序列(SEQ ID NO:1) ?
[0032]圖 2 比較 infestin-4 (SEQ ID NO: 2), SPINK-1 (SEQ ID NO:3)和 3 個(gè) SPINK-1 變體(Kl (SEQ ID N0:4)、K2(SEQ ID NO:5)和 K3 (SEQ ID NO:6))的氨基酸序列。*表示相同的氨酸酸，I表示相對(duì)于Infestin-4序列相似的氨基酸。infestin-4的加以下劃線(xiàn)的序列用于替代SPINK-1的15個(gè)氨基酸以產(chǎn)生K1。變體K2和K3通過(guò)Kl序列上的另外的點(diǎn)突變(加以下劃線(xiàn)的氨基酸)產(chǎn)生。
[0033]圖3顯示了人白蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)。
[0034]圖4A-D描述了作為時(shí)間的函數(shù)的小鼠的EAE分?jǐn)?shù)。圖4A顯示與對(duì)照小鼠(Con)相比較的FXI I+小鼠。圖4B顯示與對(duì)照小鼠(Con)相比較的FXI+小鼠。圖4C和4D顯示相較于始于免疫當(dāng)天(圖4C)或始于第12天(圖4D)的對(duì)照利用FXII抑制劑PCK處理的小鼠的分?jǐn)?shù)。
[0035]圖5A-5E概述了組織學(xué)和體外功能數(shù)據(jù)。圖5A描述了炎性病灶的數(shù)目，圖5B脫髓鞘區(qū)域/切片，和圖5C對(duì)照小鼠(左條塊)、PCK處理小鼠(中間條塊)和FXII+小鼠(右邊條塊)的軸突計(jì)數(shù)。對(duì)于每一個(gè)條線(xiàn)圖顯示了對(duì)照(Con)與PCK處理小鼠之間的組織學(xué)比較的實(shí)例。圖5D顯示脾細(xì)胞響應(yīng)CD3/CD28或MOG刺激的增殖。圖5E概述了來(lái)自對(duì)照小鼠(左條塊)、PCK處理小鼠(中間條塊)和FXII+小鼠(右條塊)的脾細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌。
[0036]圖6A顯示利用FXII抑制劑、rHA-1nfestin-4處理的小鼠的作為時(shí)間的函數(shù)的EAE分?jǐn)?shù)。圖6B比較對(duì)照(左條塊)小鼠與rHA-1nfestin-4-處理(右圖)小鼠的細(xì)胞因子IL-17的水平。
[0037]圖7顯示利用抗-因子X(jué)II抗體(實(shí)心菱形)或利用同種型對(duì)照抗體(空心方塊)處理的小鼠的作為時(shí)間的函數(shù)的癱瘓分?jǐn)?shù)。
[0038]圖8顯示抗-FXII處理小鼠和對(duì)照小鼠的血液中的細(xì)胞因子GM_CSF、IFN Y、TNF α和IL-1 β的細(xì)胞因子水平。
[0039]詳述
[0040]本申請(qǐng)的實(shí)施方案涉及包括給患者施用至少一種因子X(jué)II (FXII)抑制劑來(lái)預(yù)防、治療或另外地改善神經(jīng)炎癥性疾病的影響的方法。
[0041]本申請(qǐng)的實(shí)施方案的一個(gè)有利方面是FXII抑制劑相較于其它藥物具有改善的安全特征，因?yàn)樗鼈冾A(yù)期被良好地耐受。此外，由于FXII參與若干生理學(xué)級(jí)聯(lián)，因此，其的一種或多種可牽涉炎癥性脫髓鞘疾病例如MS，F(xiàn)XII抑制劑相較于單靶療法可具有更好的功效特征。
[0042]1.炎癥性脫髓鞘疾病
[0043]一個(gè)方面本發(fā)明涉及預(yù)防、治療或另外地改善炎癥性脫髓鞘疾病的影響的方法，包括給有此需要的受試者施用至少一種因子X(jué)II (FXII)抑制劑，從而預(yù)防、治療或改善神經(jīng)炎癥性疾病的影響。因此，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防、治療或改善炎癥性脫髓鞘疾病的影響的包含因子X(jué)II抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0044] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“治療”和“醫(yī)治”不需要癥狀的完全消除，這些術(shù)語(yǔ)不等同于“治愈”或“愈合”。相反地，“治療”和“醫(yī)治”意指疾病的至少一個(gè)體征或癥狀已被減輕、抑制、減弱或延遲。在一些實(shí)施方案中，體征或癥狀是下文中描述的主要或次要終點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)。在某些實(shí)施方案中，“治療”或“醫(yī)治”還可包括改善疾病的影響。然而，一般而言，“改善影響”意指反映患者功能的病損的疾病的一些方面得到改善?？墒褂眉膊〉拇_立標(biāo)準(zhǔn)，包括使用多發(fā)性硬化(MS)的Kurtzke擴(kuò)展殘疾狀態(tài)評(píng)分(EDSS) (KurtzkeJF, Neuroepidem1l.2008 ；31:1-9)來(lái)進(jìn)行功能性評(píng)估,如下文中描述的。如此處所用，“預(yù)防”意指給已知處于發(fā)生炎癥性脫髓鞘疾病的風(fēng)險(xiǎn)中或處于緩解和隨后復(fù)發(fā)的那些疾病中的受試者施用療法，“預(yù)防”可意指抑制處于緩解中的患者的復(fù)發(fā)。如下文中針對(duì)MS指出的，“預(yù)防”還意指滿(mǎn)足一些但非全部MS診斷標(biāo)準(zhǔn)但不進(jìn)展至完全滿(mǎn)足診斷標(biāo)準(zhǔn)的明顯的疾病的患者。
[0045]術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)炎癥性疾病”和“炎癥性脫髓鞘疾病”基本上可互換地用于指人患者或動(dòng)物的在腦或脊髓的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域存在炎癥的病況。然而，術(shù)語(yǔ)不完全等同，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，神經(jīng)炎癥性疾病不一定需要脫髓鞘，盡管脫髓鞘通常發(fā)展下列炎癥。多發(fā)性硬化是人的炎癥性脫髓鞘疾病的一個(gè)實(shí)例。在多種動(dòng)物包括小鼠、大鼠和猴中，炎癥性脫髓鞘可通過(guò)幾個(gè)不同的免疫策略來(lái)實(shí)驗(yàn)地誘發(fā)，所述免疫策略是公知的并且被接受為人疾病的模型。(Reviewed in Krishnamoorthy & ffekerle, Eur.J.Tmmunol 2009;39:2031-35.)。兩個(gè)不同的免疫策略示于實(shí)施例中。所得的誘發(fā)的疾病實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是炎癥性脫髓鞘疾病的另一個(gè)實(shí)例，雖然是實(shí)驗(yàn)性疾病和相應(yīng)地被限制于非人受試者。
[0046]在一些實(shí)施方案中，炎癥性脫髓鞘疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的疾病。示例性疾病包括但不限于多發(fā)性硬化、特發(fā)性炎癥性脫髓鞘疾病、橫貫性脊髓炎和視神經(jīng)脊髓炎(Devic，s 病)。
[0047]在一些實(shí)施方案中，炎癥性脫髓鞘疾病是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的疾病。示例性疾病包括但不限于格-巴二氏綜合征，慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、米勒.費(fèi)希爾綜合征和抗-MAG周?chē)窠?jīng)病。
[0048]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善多發(fā)性硬化的影響的方法，包括給有此需要的受試者施用治療有效量的至少一種因子X(jué)II抑制劑，從而預(yù)防或治療多發(fā)性硬化或改善多發(fā)性硬化的影響。因此，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療多發(fā)性硬化，或用于改善多發(fā)性硬化的影響的包含因子X(jué)II抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0049]在那些牽涉多發(fā)性硬化的實(shí)施方案中，具有MS的受試者可使用“McDonald標(biāo)準(zhǔn)”來(lái)診斷，這依賴(lài)于與臨床表面結(jié)合的磁共振成像(MRI)。(Polman等人，Ann Neurol 2011 ；69:292-302.)。一般而言，呈現(xiàn)兩次或更多次發(fā)作或具有兩個(gè)或更多個(gè)客觀臨床病變的患者被認(rèn)為患有MS而無(wú)需另外的臨床證據(jù)。在具有更少發(fā)作或更少可表明的病變的患者中，診斷基于通過(guò)臨床或臨床和診斷(MRI)發(fā)現(xiàn)顯示的病變?cè)诳臻g和/或時(shí)間上的擴(kuò)散的客觀證據(jù)。病變?cè)诳臻g上的擴(kuò)散的臨床證據(jù)通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的下列區(qū)域的4個(gè)中的至少2個(gè)中的一個(gè)或多個(gè)T2病變來(lái)證明:腦室旁、近皮質(zhì)、幕下或脊髓。病變?cè)跁r(shí)間上的擴(kuò)散通過(guò)根據(jù)跟進(jìn)MRI的新的T2和/或釓增強(qiáng)病變或無(wú)癥狀釓增強(qiáng)和非增強(qiáng)病變隨時(shí)的同時(shí)存在來(lái)證明。原發(fā)性進(jìn)行型MS在具有一年的疾病進(jìn)展(包括可追溯的)加上兩個(gè)或多個(gè)如下方面的受試者中得到診斷:A)基于腦中的至少一個(gè)MS的特征區(qū)域(腦室旁，近皮質(zhì)或幕下)中的一個(gè)或多個(gè)T2病變的空間上的擴(kuò)散的癥狀，或B)基于超過(guò)2個(gè)T2病變的脊髓中的空間上的擴(kuò)散的證據(jù)，和C)寡克隆帶(oligoclonal band)和/或升高的IgG指數(shù)在腦脊髓液中的存在。(Polman 等人，Ann Neurol 2011;69:292-302.)。
[0050]在一些實(shí)施方案中，患者具有或已具有至少一個(gè)臨床發(fā)作或至少一個(gè)客觀臨床病變，但從未呈現(xiàn)足夠數(shù)目的臨床發(fā)作和客觀臨床病變來(lái)使用McDonald標(biāo)準(zhǔn)確立多發(fā)性硬化的診斷。這樣的患者是“處于發(fā)生多發(fā)性硬化的風(fēng)險(xiǎn)”中的患者，并且給“處于發(fā)生MS的風(fēng)險(xiǎn)中”的患者施用FXII抑制劑可用于在受試者不進(jìn)展至可在McDonald標(biāo)準(zhǔn)下作出MS的診斷的點(diǎn)的意義上預(yù)防MS。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了預(yù)防多發(fā)性硬化的方法，包括給處于發(fā)生多發(fā)性硬化的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者施用至少一種FXII抑制劑，從而預(yù)防多發(fā)性硬化。同樣地，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防處于發(fā)生多發(fā)性硬化的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的多發(fā)性硬化的包含因子X(jué)II抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0051]在那些牽涉已被診斷患有多發(fā)性硬化的受試者的實(shí)施方案中，可基于疾病過(guò)程將受試者分類(lèi)成具有(I)復(fù)發(fā)緩解型、(2)繼發(fā)進(jìn)行型，(3)原發(fā)性進(jìn)行型和(4)進(jìn)展復(fù)發(fā)型MS的患者。
[0052]因此，本發(fā)明在某些實(shí)施方案中提供了預(yù)防、治療或改善多發(fā)性硬化的影響的方法，包括給診斷為患有復(fù)發(fā)緩解型MS的患者施用治療有效量的至少一種因子X(jué)II抑制劑，從而預(yù)防或治療復(fù)發(fā)緩解型MS或改善復(fù)發(fā)緩解型MS的影響。此外，本發(fā)明還提供了用于t預(yù)防、治療或改善復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化的影響的包含因子X(jué)II抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0053]在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療或改善多發(fā)性硬化的影響的方法，包括給被診斷為患有繼發(fā)進(jìn)行型MS的患者施用治療有效量的至少一種因子X(jué)II抑制劑，從而預(yù)防或治療繼發(fā)進(jìn)行型MS或改善繼發(fā)進(jìn)行型MS的影響。此外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療或改善繼發(fā)進(jìn)行型多發(fā)性硬化的影響的包含因子X(jué)II抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0054]在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善多發(fā)性硬化的影響的方法，包括給經(jīng)診斷患有原發(fā)性進(jìn)行型MS的患者施用治療有效量的至少一種因子X(jué)II抑制劑，從而預(yù)防或治療原發(fā)性進(jìn)行型MS或改善原發(fā)性進(jìn)行型MS的影響。此外，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防、治療或改善原發(fā)性進(jìn)行型多發(fā)性硬化的影響的包含因子X(jué)II抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0055] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善多發(fā)性硬化的影響的方法，包括給經(jīng)診斷患有進(jìn)展復(fù)發(fā)型MS的患者施用治療有效量的至少一種因子X(jué)II抑制劑，從而預(yù)防或治療進(jìn)展復(fù)發(fā)型MS或改善進(jìn)展復(fù)發(fā)型MS的影響。此外，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防、治療或改善進(jìn)展復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化的影響的包含因子X(jué)II抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0056]改善任何類(lèi)型的MS的影響或治療所述MS的一個(gè)實(shí)例是受試者的殘疾狀態(tài)的減少或至殘疾進(jìn)展的時(shí)間的增加。殘疾狀態(tài)可使用Kurtzke擴(kuò)展殘疾狀態(tài)評(píng)分(EDSS).(Kurtzke JF, Neuroepidem1l 2008 ；31:1-9.)來(lái)評(píng)價(jià)(或打分)。例如，如果抑制劑減少至“殘疾的持續(xù)增加”(被定義為持續(xù)12周的從基線(xiàn)EDSS ^ 1.0開(kāi)始的EDSS的至少I(mǎi)點(diǎn)的增加，或持續(xù)12周的從基線(xiàn)EDSS = O開(kāi)始的EDSS的至少1.5點(diǎn)的增加)的發(fā)作的時(shí)間，則其減少殘疾評(píng)分。改善任何類(lèi)型的MS的影響或治療所述MS的其它實(shí)例可通過(guò)MRI測(cè)量:例如，在確定的時(shí)期例如12、24、36或48月中新的或新近擴(kuò)大的T2高強(qiáng)度病變的中位數(shù)的減少；或在確定的時(shí)期例如12、24、36或48月中Tl釓增強(qiáng)病變數(shù)目的減少。
[0057]一般地，可用于顯示根據(jù)本發(fā)明的FXII抑制劑正在治療MS或改善MS的影響的標(biāo)準(zhǔn)包括下列結(jié)果(單獨(dú)地或以任何亞組合地):對(duì)比增強(qiáng)MRI病變的數(shù)目的程度的減小；殘疾持續(xù)累積風(fēng)險(xiǎn)(Sustained Accumulat1n of Disability) (SAD)等級(jí)的降低；復(fù)發(fā)發(fā)生的減少；至復(fù)發(fā)的時(shí)間的增加；在初始治療后例如1、2、3或更多年無(wú)復(fù)發(fā)的患者的比例的升高；根據(jù)腦掃描的腦萎縮速率的減小；MRI T2病變體積的減小；腦脊髓液(“CSF”)骨橋蛋白水平的改變；擴(kuò)展殘疾狀態(tài)評(píng)分(EDSS)的改善；定時(shí)25英尺走(T25FW)測(cè)試的改善；多發(fā)性硬化損害評(píng)分(MSIS)的改善；多發(fā)性硬化功能復(fù)合短表36健康調(diào)查(Funct1nalComposite Short Form 36Health Survey) (SF36)的改善；腦脊髓液中神經(jīng)絲重鏈的水平的改善；腦脊髓液中髓磷脂堿蛋白水平的改善；標(biāo)準(zhǔn)化腦體積(NBV)、灰質(zhì)體積(GMV)和/或白質(zhì)體積(WMV)的改善；全腦、病變、表現(xiàn)正常的灰質(zhì)(NAGM)或表現(xiàn)正常的白質(zhì)(NAWM)的磁化傳遞率(MTR)的改善；病變中的FA和ADC、GM和NAWM中的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移成像(DTI)的改善；CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)的改善；IgG-指數(shù)的改善；CSF氧化氮代謝物的改善；CSF血清白蛋白濃度商的改善；CSF CXCL13水平的改善；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)水平的改善；新的釓增強(qiáng)病變(GdEL)的減少；根據(jù)T2加權(quán)MRI像的病變體積的減小，根據(jù)T2加權(quán)MRI像的新的病變或擴(kuò)大病變的數(shù)目的減少；這些標(biāo)準(zhǔn)的任意組合；或這些標(biāo)準(zhǔn)的任意亞組合。對(duì)于所述標(biāo)準(zhǔn)中的任何標(biāo)準(zhǔn)，可相對(duì)于治療開(kāi)始時(shí)的時(shí)間判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0058]在那些牽涉復(fù)發(fā)型MS的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的FXII抑制劑也治療或改善MS,如果其減小年復(fù)發(fā)率或增加保持無(wú)復(fù)發(fā)一段確定的時(shí)期(例如6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月、36個(gè)月、48個(gè)月或60個(gè)月(或其間的任何時(shí)間))的患者的百分?jǐn)?shù)的話(huà)。
[0059]EAE模型可用于確定特定FXII抑制劑是否預(yù)防、治療或改善多發(fā)性硬化。EAE模型是被接受的MS動(dòng)物模型，并且已用于開(kāi)發(fā)由FDA批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化的藥物。(E.g., Stiive 等人,Arch.Neurol.2010 ；67:1307-15 ；Yednock 等人,Nature 1992.)。因此，如果特定FXII抑制劑在一個(gè)或多個(gè)EAE模型例如實(shí)施例中描述的那些模型中顯示活性，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可預(yù)期FXII抑制劑也在多發(fā)性硬化的影響的預(yù)防、治療或改善中顯示活性。然而，值得指出的是，EAE模型中的失活不排除在多發(fā)性硬化中的活性。例如，一個(gè)早期的MS治療干擾素β在 EAE模型中不是非常有效。(StUve等人，Arch.Neurol.2010 ；67:1307-15.)。
[0060]I1.FXII 抑制劑
[0061]術(shù)語(yǔ)“因子X(jué)II”和“FXII”各自指因子X(jué)II和活化的因子X(jué)II (FXIIa)的任一個(gè)或兩者。因此，“FXII抑制劑”包括FXII和FXIIa的任一個(gè)或兩者的抑制劑。此外，抗-FXII抗體包括結(jié)合FXII和FXIIa的任一個(gè)或兩者并抑制其的抗體。術(shù)語(yǔ)“FXII抑制劑”還意指包括連接于半衰期延長(zhǎng)多肽的FXII的抑制劑，其在一些實(shí)施方案中包括接頭。
[0062]在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑是FXII的直接抑制劑。術(shù)語(yǔ)“直接”抑制劑意指通過(guò)與FXII (或FXIIa)接觸(例如，結(jié)合)起作用的抑制劑。相反地，間接抑制劑可在無(wú)需接觸FXII (或FXIIa)蛋白的情況下起作用；例如，反義RNA可用于減少FXII基因的表達(dá)，但其不直接與FXII蛋白相互作用。因此，間接抑制劑，與直接抑制劑相反，在FXII蛋白的上游或下游起作用。直接抑制劑的一些實(shí)例示于下文中。FXII抑制劑通常是非內(nèi)源性抑制劑；即，它們不是在具有炎癥性脫髓鞘疾病的受試者的體內(nèi)天然存在的抑制劑。
[0063]A.1nfestin-4
[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝税琲nfestin結(jié)構(gòu)域4( “infestin-4”)的FXII抑制劑。最近，infestin-4據(jù)報(bào)道為活化FXII (FXIIa)的新型抑制劑。Infestin是一類(lèi)來(lái)源于吸血昆蟲(chóng)騷擾錐蝽(已知引發(fā)Chagas病的寄生蟲(chóng)克氏錐蟲(chóng)的主要載體)的中腸的絲氨酸蛋白酶抑制劑。(Campos ITN 等人 32Insect B1chem.Mol.B1.991-997, 2002 ；Campos ITN等人577FEBS Lett.512-516，2004.)。該昆蟲(chóng)使用這些抑制劑阻止攝入的血液凝固。Infestin的全長(zhǎng)前體多肽序列提供于圖1 (SEQ ID NO:1)中。Infestin基因編碼導(dǎo)致可抑制凝血途徑中的不同因子的蛋白質(zhì)的4個(gè)結(jié)構(gòu)域。具體地，結(jié)構(gòu)域4編碼為FXIIa的強(qiáng)抑制劑的蛋白(infestin-4)。Infestin-4已在小鼠中進(jìn)行了施用，但無(wú)出血并發(fā)癥。(W0 2008/098720 ;Hagedorn 等人，Circulat1n 2010 ； 121:1510-17.) ?
[0065]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含infestin-4的變體的FXII抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑包含infestin結(jié)構(gòu)域4和任選地infestin結(jié)構(gòu)域1、2和/或3。已知這些蛋白質(zhì)為FXII的強(qiáng)效抑制劑。(參見(jiàn)WO 2008/098720 ;也參見(jiàn)Campos ITN等人577FEBS Lett.512-516，2004.)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑為(His)6-標(biāo)記的infestin-4構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑是由白蛋白-接頭-1nfestin-4組成的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白-接頭-1nfestin-4是Hagedorn等人Circulat1n 2010 ;117:1153-60 中描述的 rHA-1nfestin-4 蛋白。FXII 的 infestin 抑制劑的實(shí)例描述于 W02008/098720 和 Hagedorn 等人 Circulat1n 2010 ；117:1153-60 中。
[0066]如此處所用，術(shù)語(yǔ)infestin的“變體”是指具有氨基酸突變的多肽，其中“突變”被定義為對(duì)野生型infestin-4序列的置換、缺失或添加，其中這樣的變化不改變多肽抑制FXII的功能性能力。術(shù)語(yǔ)“變體”包括野生型或突變的infestin-4序列的片段。下文中提供了這樣的變體的其它實(shí)例。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，infestin-4變體包含來(lái)自野生型infestin-4序列的氨基末端的氨基酸序列VRNPCACFRNYV(SEQ ID NO:2的殘基2_13)(參見(jiàn)圖2中加以下劃線(xiàn)的序列)和N末端氨基酸外部的至少I(mǎi)個(gè)和多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生型infestin-4序列的差異 ，和/或6個(gè)保守半胱氨酸殘基，和/或至少70%的與野生型infestin-4序列的同源性。因此,在一些實(shí)施方案中，infestin-4的變體包含野生型infestin-4序列的氨基酸2_13的保守N末端區(qū)域，和在這些保守的N末端氨基酸之外的至少I(mǎi)個(gè)或多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生型infestin-4序列的差異。如此處所用，術(shù)語(yǔ)infestin變體的“N末端氨基酸外部”是指沿著所述變體的多肽鏈除包含序列VRNPCACFRNYV即來(lái)自SEQ ID NO:2的氨基酸2_13的連續(xù)氨基酸區(qū)段外的任何氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，infestin-4變體包含6個(gè)保守半胱氨酸殘基并且與野生型infestin-4序列具有至少70%的同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，6個(gè)保守半胱氨酸殘基是野生型infestin-4序列SEQ ID NO:2的位置6、8、16、27、31和48上的氨基酸(參見(jiàn)圖2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體在位置48上包含最后一個(gè)保守半胱氨酸。在其它實(shí)施方案中，半胱氨酸殘基的確切位置和彼此的相對(duì)位置可因infestin-4變體中的插入或缺失而從野生型infestin_4序列的位置6、8、16、27、31和48變化。然而,在這些實(shí)施方案中，infestin-4變體包含所有6個(gè)半胱氨酸并且可與野生型infestin-4序列具有70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或這些百分比之間的任何百分比的同源性。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑包含野生型infestin-4多肽序列的變體(SEQ IDNO:2)，其中變體包含SEQ ID N0:2的N末端氨基酸2-13 ;在所述N末端氨基酸外的至少一個(gè)或多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生型infestin-4序列的差異；6個(gè)保守半胱氨酸殘基；和與野生型infestin-4序列至少70%的同源性。
[0069]在infestin-4變體實(shí)施方案中，infestin-4的變體的特征在于其抑制FXII。抑制FXII的功能性活性可以例如通過(guò)體外和/或體內(nèi)表征來(lái)評(píng)估，所述表征包括測(cè)試FXII酶活性的抑制、延長(zhǎng)的凝血時(shí)間即活化部分凝血活酶時(shí)間(aPTT ;闡明凝血的內(nèi)源性途徑的臨床凝血測(cè)試)的直接測(cè)定或評(píng)價(jià)凝血的體內(nèi)法。
[0070]infestin-4變體的其它實(shí)例為SPINK-1突變體，其描述于下文中。
[0071]B.SPINK-1 突變體
[0072]一個(gè)實(shí)施方案涉及用于人的治療性用途的FXII抑制劑?？墒褂门cinfestin-4具有高度相似性的人蛋白。例如，與Infestin-4具有最高相似性的人蛋白為SPINK-1，在胰腺中表達(dá)的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(也稱(chēng)為胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑，PSTI)。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族是眾多絲氨酸蛋白酶抑制劑家族之一。已描述了來(lái)自不同物種的許多蛋白質(zhì)。(Laskowski M 和 Kato I, 49Ann.Rev.B1chem.593-626, 1980.)
[0073]基于野生型SPINK-1序列(SEQ ID NO: 3)，可產(chǎn)生不同的變體以增加SPINK-1序列與Infestin-4的同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，將SPINK-1突變以包含SEQ ID N0:2的N末端氨基酸2-13，所述序列被認(rèn)為對(duì)于FXII抑制性功能是非常重要的。稱(chēng)為Kl的多肽序列示于SEQ ID N0:4和圖2中。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的SPINK-1的變體也包含野生型infestin-4序列的N末端氨基酸2-13(SEQ ID NO: 2)，和在所述N末端氨基酸外部的至少I(mǎi)個(gè)和多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生型SPINK-1序列的差異以及增加變體與野生型infestin-4序列的同源性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變的SPINK-1的變體包含6個(gè)保守半胱氨酸殘基并且與野生型SPINK-1序列具有至少70%的同源性。突變可以是置換、缺失或添加。如上所定義的，術(shù)語(yǔ)“在N末端氨基酸外部”是指沿著所述變體的多肽鏈除由序列VRNPCACFRNYV即SEQ ID NO:2的氨基酸2-13組成的連續(xù)氨基酸區(qū)段外的任何氨基酸。術(shù)語(yǔ)“變體”包括所述突變的SPINK-1序列的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，6個(gè)保守半胱氨酸殘基可以是位于野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56上的氨基酸(SEQ ID N0:3，參見(jiàn)圖2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體包含最終的保守半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，半胱氨酸的確切位置和彼此的相對(duì)位置可因SPINK-1變體中的插入或缺失而導(dǎo)致的從野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56改變。然而，在這些實(shí)施方案中，SPINK-1變體包含所有6個(gè)半胱氨酸。在實(shí)施方案中，SPINK-1變體的特征還在于其抑制FXII。
[0075]在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑包含SPINK-1 (SEQ ID NO:3)的變體，其中SPINK-1變體包含SEQ ID NO: 2的N末端氨基酸2_13 ;在所述N末端氨基酸外部的至少I(mǎi)個(gè)和多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生型SPINK-1序列的差異以及增加變體與野生型infestin-4序列的同源性；6個(gè)保守半胱氨酸殘基；和與野生型SPINK-1序列至少70%的同源性。
[0076] 給出SPINK-1變體的實(shí)例，其被命名為K1、K2和K3(分別地SEQ ID N0S:4,5和6)。在SPINK-1變體Κ2和Κ3中，相對(duì)于Kl在N末端外產(chǎn)生其它氨基酸置換，以增加與infestin-4的同源性，其中變體的特征還在于它們抑制FXII活性。參見(jiàn)WO 2008/098720。圖2顯示這些變體的氨基酸序列和對(duì)SPINK-1野生型序列的改變的程度。在SPINK-1變體K3的情況下，5個(gè)氨基酸置換增加與infestin-4的同源性。因此在實(shí)施方案中，SPINK-1變體可與野生型 SPINK-1 序列具有 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %或99 %或這些百分比之間的任何百分比的同源性。
[0077]C.其它FXII抑制劑
[0078]FXII的其它抑制劑，包括FXII和FXIIa的抑制劑，描述于W02006/066878中。因此，在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑是抗凝血酶111(AT 111)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、Cl抑制劑、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶素([(S)-1-羧基-2-苯乙基]-氨甲酸基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-乙醒-二甲基醋酸酯、DX88 (DyaxInc.,300Technology Square, Cambridge, MA 02139，USA ;Wi11iams A 和 BairdLG, 29Transfus Apheresis Sc1.255-258，2003中引用的)、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制劑、牛胰蛋白酶抑制劑的突變體、ecotin、黃蓋鰈抗凝蛋白、笑瓜胰蛋白酶抑制劑-V,包括笑瓜同效抑制劑或Hamadarin(如由Isawa H等人，277J.B1l.Chem.27651-27658，2002 公開(kāi)的)。
[0079]在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑為H-D-Pro-Phe-Arg-氯甲基酮(PCK)。(Tans 等人,Eur.J.B1chem.1987 ； 164:637-42 ；Kleinschnitz 等人，J Exp Med.2006 ；203:513-8.)。
[0080]在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑為美國(guó)專(zhuān)利N0.6，613，890中第4至8欄中公開(kāi)的淀粉樣蛋白前體蛋白的Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物。
[0081]D.FXII 抗體
[0082]在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑為結(jié)合FXII并抑制FXII激活和/或活性的抗-FXII抗體?？?FXII抗體已描述于例如WO 2006/066878和Ravon等人，IBlood4134-43，1995中。針對(duì)人因子X(jué)II的其它單克隆抗體(mAb)包括由Pixley等人描述的 B7C9mAb(J B1l Chem 1987 ;262，10140-45)，由 Small 等人描述的 mAb (Blood 1985 ；65:202-10);由 Nuijens 等人描述的 mAb Fl 和 F3 (J.B1l.Chem.1989 ;264:12941-49)；W089/11865中描述的抗FXII的輕鏈的B6F5、C6B7和D2E10mAb ；W090/08835中描述的相對(duì)于FXII選擇性結(jié)合FXIIa-β的mAb ;和冊(cè)91/17258中描述的抗-FXII抗體0T-2。
[0083]另外的抗-因子X(jué)II/FXIIa單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段描述于2011年7月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)n0.61/510，801 (將其通過(guò)引用并入本文)中。那些抗體具有為對(duì)于人因子X(jué)II的結(jié)合親和力2倍以上的對(duì)于人因子X(jué)IIa-β的結(jié)合親和力，并且能夠抑制人因子X(jué)IIa的胺裂解酶活性。在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段具有下列特征的一個(gè)或多個(gè):(a)結(jié)合鼠FXII/FXIIa;(b)包含與SEQ ID NO: 7的序列具有超過(guò)85%的同一性的重鏈可變(VH)區(qū)；(c)包含與SEQ ID NO:8的序列具有超過(guò)85%的同一性的輕鏈可變(VL)區(qū)；(d)包含與SEQ ID NO:9的序列具有至少80%的同一性的重鏈⑶R1，和/或與SEQ ID NO: 10的序列具有至少60%的同一性的重鏈CDR2，和/或與SEQ ID NO: 12的序列具有至少80%的同一性的重鏈⑶R3 ； (e)包含與SEQ ID NO: 14具有至少50%的同一性的輕鏈 CDRUP / 或 SEQ ID NO: 15 的輕鏈 CDR2，和 / 或具有序列 A-X1-W-X2-X3-X4-X5-R-X6-X7的輕鏈⑶R3，其中X1可為A或S，X5可為L(zhǎng)或V，其它Xn可為任意氨基酸(SEQ ID NO: 17)；(f)以好于KT8M的Kd結(jié)合人因子X(jué)IIa-β ; (g)與infestin-4競(jìng)爭(zhēng)對(duì)于人因子X(jué)IIa-β的結(jié)合；或(h)為人IgG或其變體，優(yōu)選人IgG4或其變體。
[0084]在其它實(shí)施方案中，抗-FXII抗體為結(jié)合人FXII的IgG抗體，并且包含(a)含有SEQ ID NO:9中所示的重鏈CDR1、SEQ ID NO: 11中所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 13中所示的重鏈CDR3的VH區(qū)；和/或(b)含有SEQ ID NO: 14中所示的輕鏈CDR1、SEQ ID NO: 15中所示的輕鏈⑶R2和SEQ ID NO: 17所示的輕鏈⑶R3的VL區(qū)。包含SEQ ID NO: 11的重鏈 CDR2 包含序列 Gix1X2X3X4X5X6TvyadsvkG,其中 X1 為 R、N 或 d，X2 為 P、V、I 或 μ ；χ3 為 S、P或A ;Χ4為G、L、V或T ;Χ5可以為任意氨基酸，優(yōu)選地X5為G、Y、Q、K、R、N或M ;并且X6為T(mén)、G 或 S。包含 SEQ ID NO: 13 的重鏈 CDR3 包含序列 ALPRSGYLXAXJJYYYALDV，其中 X1 為1、M或￥32為3或1(而為？、1(、1'或!1;并且乂4為!1、隊(duì)6或0。包含SEQ ID NO: 17的輕鏈CDR3 包含序列 AX1WX2X3X4X5RX6X7，其中 X1 為 A 或 S ;X2 為 D、Y、E、T、W、E 或 S ；X3 為 A、N、1、L、V、P、Q 或 E ;X4 為 S、D、P、E、Q 或 R 仏為 L 或 V ;X6 為 G、L 或 K ;并且父7為 V、A、D、T、M 或G0
[0085]在其它實(shí)施方案中，抗-FXII抗體的抗原結(jié)合片段是結(jié)合人FXII的IgG抗體的片段，其包含(a)包含SEQ ID N0:9中所示的重鏈CDR1、SEQ ID NO: 10所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 12所示的重鏈CDR3的VH區(qū)；和/或(b)包含SEQ ID NO: 14所示的輕鏈CDRl、SEQ ID NO: 15所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示的輕鏈CDR3的VL區(qū)。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方案中，抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段是實(shí)施例3中使用的抗體“3F7”。3F7的可變區(qū)和⑶R的序列示于表1中。
[0087] 表1.
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種用于預(yù)防和/或治療和/或改善神經(jīng)炎癥性疾病的因子X(jué)II抑制劑。
2.用于權(quán)利要求1的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述FXII抑制劑包含野生型infestin-4多肽序列(SEQ ID NO:2)或其變體，其中所述變體包含: (a)SEQ ID N0:2的N末端氨基酸2-13 ;和所述N末端氨基酸外部的至少I(mǎi)個(gè)和多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生型infestin-4序列的差異； 和/或 (b)6個(gè)保守半胱氨酸殘基；和與野生型infestin-4序列至少70%的同源性。
3.用于權(quán)利要求1的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述FXII抑制劑包含SPINK-1(SEQID NO: 3)，其被突變來(lái)包括SEQ ID NO: 2的N末端氨基酸2_13，或所述突變的SPINK-1的變體，其中變體包含 (a)SEQ ID NO:2的N末端氨基酸2-13 ;和所述N末端氨基酸外部的至少I(mǎi)個(gè)和多至5個(gè)氨基酸突變，所述突變導(dǎo)致與野生SPINK-1序列的差異和增加變體與野生型infestin-4序列的同源性； 和/或 (b)6個(gè)保守半胱氨酸殘基；和與野生型SPINK-1序列至少70%的同源性。
4.用于權(quán)利要求3的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述FXII抑制劑包括SPINK-1或SPINK-1 突變體 K1、K2 或 K3(分別地 SEQ ID NOS: 3、4、5 或 6)。
5.用于權(quán)利要求1的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述FXII抑制劑包括以下一種或多種:H-D-Pro-Phe-Arg-氯甲基酮(PCK)、AT II1、抑肽酶、α -1蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶素([(S) -1-竣基-2-苯乙基]-氛甲酸基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-乙醒-二甲基醋酸酯、DX88、脯氨酰寡肽酶的抑制劑，特別是Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制劑、牛胰蛋白酶抑制劑的突變體、ecotin、YAP(黃蓋鰈抗凝蛋白)、筍瓜胰蛋白酶抑制劑-V或筍瓜同效抑制劑。
6.用于權(quán)利要求1的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述FXII抑制劑包含抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體結(jié)合FXII并抑制其活性和/或激活。
7.用于權(quán)利要求6的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段包含:(a) VH區(qū)，所述VH區(qū)包含SEQ ID N0:9中所示的重鏈CDR1、SEQ ID N0:11中所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 13中所示的重鏈CDR3 ;和/或(b) VL區(qū)，所述VL區(qū)包含SEQ IDNO: 14中所示的輕鏈CDR1、SEQ ID NO: 15中所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 17中所示的輕鏈 CDR3。
8.用于權(quán)利要求6或7的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段包含:(a) VH區(qū)，所述VH區(qū)包含SEQ ID N0:9中所示的重鏈CDR1、SEQ ID N0:10中所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 12中所示的重鏈CDR3 ;和/或(b)VL區(qū)，所述VL區(qū)包含SEQID NO: 14中所示的輕鏈CDRl、SEQ ID NO: 15中所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16中所示的輕鏈CDR3。
9.用于權(quán)利要求6至8的任一項(xiàng)的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述抗-FXII抗體或其抗原結(jié)合片段包含VH區(qū)和VL區(qū)，所述VH區(qū)包含SEQ ID NO: 7，所述VL區(qū)包含SEQ IDN0:8。
10.用于權(quán)利要求6至9的任一項(xiàng)的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述抗-FXII抗體是IgG0
11.用于權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中將FXII抑制劑連接于半衰期增強(qiáng)多肽，所述多肽為白蛋白、維生素E結(jié)合蛋白、α -甲胎蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、人白蛋白或其變體、免疫球蛋白或其變體、PEG或其變體、或IgG的Fe。
12.用于權(quán)利要11的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述半衰期增強(qiáng)多肽通過(guò)接頭連接于FXII抑制劑。
13.用于權(quán)利要12的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述接頭是 (a)可切割的； (b)可被內(nèi)源性、外源性或共同凝血途徑的凝血蛋白酶切割；和/或 (C)可被因子X(jué)IIa切割。
14.用于權(quán)利要求11至13的任一項(xiàng)的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述FXII抑制劑是人白蛋白-接頭-FXII融合蛋白。
15.用于權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述神經(jīng)炎癥性疾病是多發(fā)性硬化、橫貫性脊髓炎或視神經(jīng)脊髓炎(Devic’ s病)。
16.用于權(quán) 利要求15的用途的因子X(jué)II抑制劑，其中所述多發(fā)性硬化是復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化或原發(fā)性進(jìn)行型多發(fā)性硬化。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK104080470SQ201380007416
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】S·莫伊特, K·格比爾, C·克萊茵施尼茨, B·邁肯齊, M·諾爾蒂 申請(qǐng)人:德國(guó)杰特貝林生物制品有限公司, Csl有限公司, 朱利葉斯-馬克西米利維爾茨堡大學(xué), 威斯特法倫威廉明斯特大學(xué)