用免疫球蛋白治療粘膜炎的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含免疫球蛋白的組合物，所述免疫球蛋白用于由局部應(yīng)用治療粘膜炎。尤其是，本發(fā)明涉及用于治療粘膜炎的包含含有J鏈的IgA和分泌組分的組合物。
【專利說明】用免疫球蛋白治療粘膜炎 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及包含免疫球蛋白的組合物，所述免疫球蛋白用于由局部應(yīng)用治療粘膜 炎。尤其是，本發(fā)明涉及用于治療粘膜炎的包含含有J鏈的IgA和分泌組分的組合物。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 癌患者患各種治療-相關(guān)的后遺癥。食道粘膜炎化學(xué)治療和放射是最致衰弱 的不利效果之一（Sonis ST(2009)Oral Oncol 45,1015-20)。疼痛，粘膜潰瘍形成，及需 要腸胃外營養(yǎng)的食品攝取困難嚴(yán)重影響患者舒適性及增加局部以及系統(tǒng)性感染的風(fēng)險 伍1^叩，1^的 &1(2003)0&11(3抓98:1531-9)。此外，粘膜炎造成隨后化學(xué)治療或放射治療 周期延遲。其可使需要化學(xué)治療的治療中斷或劑量減小，其可對總體存活具有有害效應(yīng)。粘 膜炎也作為經(jīng)濟(jì)問題新出現(xiàn)，由于其管理需要昂貴的治療及延長的住院。
[0003] 粘膜炎的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)治療主要依賴于控制減輕疼痛程度，但不致粘膜炎中涉及的病 理機(jī)制。
[0004] 理解粘膜炎的復(fù)雜的病理生理學(xué)對于作出預(yù)防性和/或治療性策略是關(guān)鍵的。當(dāng) 前概念涉及5個重疊期（Sonis ST(1998)0ral Oncol 34:39-43) :(1)粘膜炎在施用細(xì)胞毒 性藥物或放射期間起始。損傷在第1次可見和臨床可定量的可能由DNA損傷和/或活性氧 導(dǎo)致的變化發(fā)生（例如粘膜紅斑）之前的天開始。（2)損傷應(yīng)答通路和促-炎性級聯(lián)被活 化。⑶隨這些信號傳導(dǎo)通路的擴(kuò)增的惡性循環(huán)，例如TNF-α釋放，NF-κΒ活化，及活性 氧，其被認(rèn)為增強(qiáng)細(xì)胞死亡和由此介導(dǎo)粘膜損傷。（4)可見潰瘍形成發(fā)展，受粘膜表面上多 種微生物性菌群的存在負(fù)面地影響，增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子釋放（Ratner，AJ等人（2005)Proc Natl Acad Sci USA 102:3429-34)?？谇缓拖赖墓采蚣嫘圆≡w侵襲潰瘍和可導(dǎo)致 菌血癥。（5)粘膜屏障的再生會僅在毒性刺激和促炎信號減弱，及嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)恢復(fù)了 之后發(fā)生。
[0005] 這些階段和病理生理事件中的一些可用體外研究及在動物模型中再造。上皮細(xì)胞 暴露于放射或一般用于化學(xué)治療的化學(xué)品（例如甲氨喋呤）是模擬抗-癌治療對局部存在 的上皮細(xì)胞的效應(yīng)和潛在側(cè)損傷的適當(dāng)?shù)姆椒?。此對?yīng)于口腔粘膜炎的早期/起始階段 (上述階段1，2和3)。可用于此的上皮細(xì)胞包括角質(zhì)化的上皮細(xì)胞系（例如.底特律532) 和非-角質(zhì)化的上皮細(xì)胞系（例如.H376)。類似地，上皮細(xì)胞暴露于存在于口腔小型生物 群的機(jī)會性病原體模擬口腔粘膜炎的晚期階段（階段3和4)，尤其由局部存在的微生物導(dǎo) 致的發(fā)炎永存可在該系統(tǒng)中研究。存在于口腔微生物群系的典型機(jī)會性病原體包括鏈球菌 屬（Streptococcus)物種，特別緩癥鏈球菌（S.mitis)及肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)及也 在某種程度上包括莫拉菌屬（Moraxella)物種，包括粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)(The Human Microbiome Project Consortium(2012)Nature 486:207-214)(Dewhirst FE(2010) J. Bacteriol 192:5002-5017)。
[0006] 此外，倉鼠，大鼠和小鼠中的各種體內(nèi)模型被良好建立，常使用及也被調(diào)控機(jī)構(gòu)接 受。最通常使用的模型基于暴露于放射或放射和化學(xué)治療的組合的金色敘利亞倉鼠；已在 模型中描述預(yù)防性和治療性干預(yù)（Watkins B(2010)Oral Dis 16:655-660)。
[0007] 在癌治療強(qiáng)度和粘膜炎發(fā)展風(fēng)險之間有直接關(guān)聯(lián)。已在之前治療周期中，在發(fā)展 粘膜炎的患者中觀察到增加的風(fēng)險。應(yīng)激因素諸如焦慮也增加風(fēng)險。粘膜微生物區(qū)系的性 質(zhì)和程度和存在的微生物區(qū)系由癌治療的可能的修飾也可增強(qiáng)炎性刺激。
[0008] 促-炎性信號的破壞和微生物負(fù)荷的減小已被鑒定為治療和/或預(yù)防粘膜炎的 潛在靶。在多于一個比較性，隨機(jī)化的試驗中測試的僅7種劑被發(fā)現(xiàn)具有顯著效應(yīng)，但 觀察的改善微小。含有多粘菌素，妥布霉素和兩性霉素 B的口腔錠劑被發(fā)現(xiàn)具有有利的 效應(yīng)（Stokman MA et al (2003)J Cancer 88:1012-6 ;Wijers OB et al (2001) Int J Radiot Oncol Biol Phys 50:343-52)，盡管在粘膜炎中使用局部抗微生物劑不被常規(guī)建議 (Donelly JP et al (2003)Lancet Infect Dis 3:405-12)。目前認(rèn)為，微生物可不導(dǎo)致粘 膜炎起始，但可在隨后階段起到作用。最近，重組角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（KFG)被顯示顯著 地改善粘膜炎（Blijelevens N &Sonis，S(2007)Ann Oncol 18:817-26)。
[0009] 因此，對于由癌-相關(guān)的治療方案導(dǎo)致的粘膜炎的有效治療有強(qiáng)需求。迫切地需 要預(yù)防和治療食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎的新方法。
[0010] 【發(fā)明概述】
[0011] 本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎，可由局部施用免疫球蛋 白，尤其是IgA和/或IgM有效治療。
[0012] 因此，本發(fā)明的一方面是包含免疫球蛋白的組合物，所述免疫球蛋白用于通過在 受試者中局部施用預(yù)防或治療食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎。
[0013] 優(yōu)選地，免疫球蛋白包含IgA和/或IgM，更優(yōu)選地，免疫球蛋白包含含有J鏈的 IgA或含有J鏈的IgM或其組合。優(yōu)選地，免疫球蛋白可獲自血或其組分，諸如血漿或血漿 級分。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物也包含分泌組分。優(yōu)選分泌組分是重組體分泌組分。
[0014] 在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，組合物包含分泌-樣IgA。組合物也可包含與另一免疫球 蛋白組合的分泌-樣IgA,優(yōu)選組合IgM,優(yōu)選分泌-樣IgM。
[0015] 本發(fā)明的再一方面是上述組合物，其被配制以提供與受粘膜炎影響的（或處于受 影響的風(fēng)險的）粘膜區(qū)的長接觸時間。優(yōu)選地，組合物被制成霜劑，凝膠，糖漿，膠凍劑，在 受影響的粘膜附近溶解的固體形式，或其組合。另一優(yōu)選的組合物是被配制成適宜于在吞 咽或吐出之前在口中保留幾分鐘的液體組合物。優(yōu)選地，液體制劑包含調(diào)味物質(zhì)，從而味道 是舒適的。該物質(zhì)可賦予水果諸如草莓，蘋果，桃，藍(lán)莓的味道；焦糖，巧克力的味道；也可 使用香味道，諸如干酪或番茄。組合物也可包含其他適合的賦形劑，例如增強(qiáng)免疫球蛋白的 穩(wěn)定性的穩(wěn)定化劑。
[0016] 本發(fā)明的仍另一方面是上述組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜減少微生物，諸如細(xì)菌 或真菌的附著和/或侵入。微生物可為粘膜表面上微生物區(qū)系的部分。
[0017] 本發(fā)明的再一方面是上述組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜促進(jìn)粘膜創(chuàng)傷治愈。優(yōu)選 地，本發(fā)明的組合物刺激上皮細(xì)胞以分泌生長因子，例如角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子。
[0018] 本發(fā)明的仍再一方面是本發(fā)明的組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜發(fā)揮抗-炎性效 應(yīng)?？?炎性效應(yīng)可為：
[0019] (a)抑制促-炎性細(xì)胞因子表達(dá)；和/或
[0020] (b)刺激抗-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。
[0021] 本發(fā)明的另一方面是上述組合物，其中受試者是處于發(fā)展食道粘膜炎的風(fēng)險，諸 如經(jīng)歷或即將經(jīng)歷化學(xué)治療和/或放射治療的癌患者。尤其是，處于發(fā)展粘膜炎的風(fēng)險的 受試者是作為之前化學(xué)治療和/或放射治療法治療的結(jié)果而發(fā)展粘膜炎的癌患者。之前化 學(xué)治療和/或放射治療法治療可為在接收化學(xué)治療和/或放射治療之后緩解，但其中癌已 再現(xiàn)及顯示另一系列化學(xué)治療和/或放射治療的患者中一系列治療周期中治療的早先周 期，或一系列治療周期的治療部分。優(yōu)選地，當(dāng)患者的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)開始降低時開始施 用組合物。優(yōu)選地，治療在患者的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)在正常以下的時期維持。
[0022] 本發(fā)明的組合物被施用給受試者達(dá)6次/天，優(yōu)選達(dá)5次/天，更優(yōu)選達(dá)4次/天， 甚至更優(yōu)選達(dá)3次/天，最優(yōu)選2次/天或甚至更低頻度。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，組合物包含用于治療粘膜炎的另外的有效劑，諸如生長因 子或防腐劑。也包括在本發(fā)明中的是包含本發(fā)明的組合物和第2活性劑的產(chǎn)品，其作為用 于在食道粘膜炎治療中同時，分離或連續(xù)使用的組合的制備物。該第2活性劑可為，例如， 促進(jìn)創(chuàng)傷治愈的劑，諸如生長因子，抗微生物劑諸如防腐劑，例如防腐漱口水，或抗-炎性 劑。
[0024] 【發(fā)明詳述】
[0025] 如上所述，癌患者中的粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎，仍被認(rèn)為是主要醫(yī)療問題，及 有對有效治療的需求。本發(fā)明人現(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)，食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎，可由局 部施用免疫球蛋白，尤其是IgA和/或IgM來有效治療。
[0026] 因此，本發(fā)明的一方面是包含免疫球蛋白的組合物，所述免疫球蛋白通過在受試 者中局部施用而用于預(yù)防或治療食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎。優(yōu)選免疫球蛋白是人免 疫球蛋白。
[0027] 優(yōu)選地，免疫球蛋白包含IgA或IgM或其組合，更優(yōu)選地，免疫球蛋白包含含有J 鏈的IgA或含有J鏈的IgM或其組合。優(yōu)選地，免疫球蛋白可獲自血或其組分，諸如血漿， 冷凍的差的血漿或血漿級分。更優(yōu)選地，免疫球蛋白純化自在為純化其他血漿蛋白，例如免 疫球蛋白G而處理血漿期間獲得的側(cè)級分。優(yōu)選免疫球蛋白不獲自乳或初乳。優(yōu)選地，免 疫球蛋白在純化之后未通過體外改變糖基化，例如由糖殘基，例如甘露糖或唾液酸或半乳 糖的酶促添加或去除來修飾。優(yōu)選地，免疫球蛋白不是純抗-TNF抗體或就抗-TNF富集的 或純化自用TNF- α免疫的人或動物供體的免疫球蛋白。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，組合物也包含分泌組分。優(yōu)選分泌組分是重組體分泌組分， 優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞系中產(chǎn)生的分泌組分。
[0029] 本文所用的術(shù)語"分泌組分"指稱特異性結(jié)合于含有J-鏈的免疫球蛋白的蛋白， 及涉及或可源于或相同于多聚體免疫球蛋白受體（plgR)，優(yōu)選哺乳動物plgR，更優(yōu)選靈長 類動物plgR，最優(yōu)選人plgR的細(xì)胞外部分。優(yōu)選地，分泌組分賦予含有J-鏈的免疫球蛋白 增加的穩(wěn)定性。分泌組分以其傳統(tǒng)，狹義（在本文被稱為"天然的分泌組分"）是多聚體免 疫球蛋白受體（PlgR)的細(xì)胞外部分，其通常在分泌期間與包含J鏈的二聚體或多聚體IgA 或五聚體IgM結(jié)合。含有J鏈的IgA/IgM在上皮細(xì)胞的基底外側(cè)表面結(jié)合于多聚體免疫球 蛋白受體及由胞吞轉(zhuǎn)運被攝入細(xì)胞。此受體復(fù)合物然后在運輸?shù)缴掀ぜ?xì)胞的腔表面之前通 過細(xì)胞隔室運輸。胞吞轉(zhuǎn)運的IgA/IgM-pIgR復(fù)合物然后通過蛋白水解釋放，及多聚體免疫 球蛋白受體（PlgR)的部分（被稱為天然的分泌組分）保持與含有J鏈的IgA/IgM結(jié)合，釋 放分泌IgA/IgM。但是，有證據(jù)表明，IgA的反向胞吞轉(zhuǎn)運（即從腔表面到基底外側(cè)表面） 也可發(fā)生。
[0030] 人plgR被克隆及測序，其序列作為SwissProt登錄號P01833可利用，及顯示于 SEQ ID N0:1。人plgR是具有764個氨基酸殘基的糖蛋白，其含有信號肽（殘基1?18)， 細(xì)胞外部分（殘基19?638)，跨膜區(qū)（殘基639?661)，及細(xì)胞質(zhì)區(qū)（殘基662?764)。 殘基19?603被認(rèn)為結(jié)合于上述含有J鏈的IgA或含有J鏈的IgM，及此糖蛋白的此部分 通常被稱為分泌組分（"天然的分泌組分"）。
[0031] 在本發(fā)明的組合物中使用的分泌組分可包含任何能與含有J鏈的IgA結(jié)合的細(xì)胞 外PlgR序列。例如，分泌組分可包含來自哺乳動物源，例如來自靈長類動物，牛，馬，貓，狗， 兔，豚鼠，大鼠或小鼠的PlgR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其變體。也涵蓋來自幾種哺乳動物物種的 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其變體的功能雜交體以在本發(fā)明中使用，例如通過將來自不同物種的免疫 球蛋白-樣結(jié)構(gòu)域融合進(jìn)分泌組分-樣蛋白而制備的。功能分泌組分也可通過融合一系列 正常存在的免疫球蛋白-樣結(jié)構(gòu)域而形成，例如兔分泌組分是僅由結(jié)構(gòu)域1，4和5組成的 有功能的。但是，優(yōu)選使用人分泌組分或其功能變體。
[0032] 因此在本發(fā)明的組合物中使用的分泌組分優(yōu)選包含SEQ ID NO: 1的殘基19?603 或其功能變體。功能變體可包括缺失，插入和/或取代，優(yōu)選取代是保守性取代，例如堿性 氨基酸殘基用另一堿性氨基酸代替，疏水氨基酸用另一疏水氨基酸代替，等。變體分泌組分 在序列上與SEQ ID NO: 1的殘基19?603具有至少50%同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO: 1的殘 基19?603具有至少55%，60%，65%，70%，75%，80%，更優(yōu)選至少85%或甚至90%，甚 至更優(yōu)選至少92 %，94 %，95 %，97 %，98 %或甚至99 %同一性。最優(yōu)選，分泌組分包含SEQ ID NO: 1的殘基19?603或甚至由SEQ ID NO: 1的殘基19?603組成。
[0033] 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如何由重組技術(shù)產(chǎn)生分泌組分。CH0細(xì)胞中人分泌組分的表 達(dá)的一例已被 Phalipon 等人（Phalipon A 等人（2002) Immunity 17:107-115)描述，但本 發(fā)明不限于由此系統(tǒng)產(chǎn)生的分泌組分。例如，期望的cDNA序列可合成產(chǎn)生或使用從表達(dá) PlgR的細(xì)胞或組織分離的RNA作為模板經(jīng)RT-PCR克隆。然后可將cDNA插入哺乳動物表達(dá) 載體諸如PCDNA3-許多替代性的表達(dá)載體是可利用的及為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。然后會將 重組表達(dá)載體導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞系，諸如CH0, Cos，HEK293或BHK。其他細(xì)胞系是可利用 的和也可使用。將該載體導(dǎo)入細(xì)胞系的方法包括脂轉(zhuǎn)染，電穿孔和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 其他技術(shù)。通常然后選擇及克隆帶有表達(dá)載體及表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞。也可使用病毒表達(dá) 系統(tǒng)，例如，痘苗病毒可用于在哺乳動物細(xì)胞中以高水平表達(dá)蛋白，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可用 于在昆蟲細(xì)胞中以高水平表達(dá)蛋白。也可采用酵母或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，及該表達(dá)系統(tǒng)已由本 領(lǐng)域技術(shù)人員所知。植物表達(dá)系統(tǒng)也可使用及已由本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
[0034] 在本發(fā)明的組合物中使用的分泌組分或其變體也可包含標(biāo)簽，諸如六-組氨酸標(biāo) 簽，其可輔助純化得到的蛋白。如果該標(biāo)簽經(jīng)可切割的接頭附接，標(biāo)簽可在本發(fā)明中使用之 前切割下。類似地，分泌組分可作為融合蛋白產(chǎn)生。再次，可使用可切割的接頭，從而融合 偶體可在本發(fā)明中使用之前自分泌組分切割下。
[0035] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可然后用標(biāo)準(zhǔn)方法純化表達(dá)的蛋白。
[0036] 分泌組分也可從天然的源，優(yōu)選從乳，唾液或粘液得到。優(yōu)選分泌組分具有人來 源，但來自其他物種的分泌組分也可在本發(fā)明中使用。
[0037] 組合物之中分泌組分和J鏈之間的摩爾比在1:10和10:1之間，優(yōu)選在1:5和5:1 之間，更優(yōu)選在1:2和2:1之間。
[0038] 在組合物中使用的分泌組分的量可為在組合物中1部分（以重量計）分泌組分比 至少50部分（以重量計）蛋白，優(yōu)選在組合物中1部分比至少40,30,20，15，10，最優(yōu)選1 部分分泌組分比至少5部分蛋白。
[0039] 在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，組合物包含分泌-樣IgA。組合物也可包含與另一免疫球 蛋白組合的分泌-樣IgA，優(yōu)選組合IgM，優(yōu)選分泌-樣IgM。在另一優(yōu)選的本發(fā)明的方面， 組合物也可單獨包含分泌-樣IgM或組合其他免疫球蛋白。
[0040] 本發(fā)明的再一方面是上述組合物，其被配制為提供與受粘膜炎影響的（或處于受 影響的風(fēng)險的）粘膜區(qū)的長接觸時間。"接觸時間"指稱組合物或其部分在受影響的粘膜表 面或處于風(fēng)險的粘膜表面保持有活性的時間量。優(yōu)選地，接觸時間相比幾分鐘，更優(yōu)選幾小 時，甚至更優(yōu)選幾天更久，最優(yōu)選對于發(fā)揮預(yù)防或治療粘膜炎的生物學(xué)效應(yīng)足夠長。優(yōu)選， 組合物制成霜劑，凝膠，糖漿，膠凍劑，在受影響的粘膜附近溶解的固體形式，或其組合。組 合物也可制成片劑，以單獨或組合形式包含一種或更多適合的賦形劑諸如蔗糖，乳糖，麥芽 糊精，淀粉（例如來自玉米的），纖維素衍生物，例如羥乙基纖維素，甲基纖維素，或丙烯酸 月旨，甲基丙烯酸樹脂，油（例如，橄欖油），蜂蠟或類似劑。其也可包含泡騰組分。凝膠可， 例如，使用豬明膠或基于淀粉的材料，丙二醇，PEG 40,山梨酸鉀，苯甲酸鈉，苯扎氯銨，蔗 糖，透明質(zhì)酸鈉，羥乙基纖維素或類似劑形成。糖漿可通過添加一種或更多糖，糖多元醇如 甘油或山梨糖醇，防止糖的再結(jié)晶的酸，緩沖劑，螯合劑，調(diào)味劑和香料增強(qiáng)劑，著色劑來形 成。膠凍劑可，例如，通過使用明膠，例如豬明膠形成。
[0041] 或者，使用液體組合物，其被配制為適宜于在吞咽或吐出之前在口中保留幾分鐘。 優(yōu)選地，液體制劑包含調(diào)味物質(zhì)，從而味道是舒適的。該物質(zhì)可賦予水果諸如草莓，蘋果， 桃，藍(lán)莓的味道；焦糖，巧克力，堅果或類似味道；也可使用香味，諸如干酪或番茄。組合物 也可包含其他適合的賦形劑，例如增強(qiáng)免疫球蛋白的穩(wěn)定性的穩(wěn)定化劑，著色劑，緩沖劑物 質(zhì)等。
[0042] 組合物可直接應(yīng)用于口中，如果受試者處于發(fā)展口腔粘膜炎的風(fēng)險，其也可以被 設(shè)計為在食道的其他部分釋放的制劑經(jīng)口攝取。其也可經(jīng)肛門遞送，及可以用于此遞送形 式的適合的制劑供給。其可以控制其在食道的特定區(qū)釋放的制劑遞送。本領(lǐng)域技術(shù)人員能 如期望配制本發(fā)明的組合物而達(dá)到與粘膜期望的接觸時間。
[0043] 本發(fā)明的仍另一方面是上述組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜減少微生物，諸如細(xì)菌 或真菌的附著和/或侵入。微生物可為粘膜表面上微生物區(qū)系的部分，例如口腔小型生 物群或腸小型生物群。優(yōu)選地，組合物包含與微生物和/或由微生物產(chǎn)生的毒素結(jié)合的 免疫球蛋白。優(yōu)選地，由微生物附著和/或侵入完整或損傷的粘膜表面降低至少25%，優(yōu) 選至少30 %，35 %，40 %，45 %，更優(yōu)選至少50 %，理想地至甚至更大程度諸如至少60 %， 70 %，80 %，90 %，例如，以阻止細(xì)胞內(nèi)促-炎性下游級聯(lián)的活化，其在特定微生物表面組 分（例如，PAMP，病原體關(guān)聯(lián)的分子模式）與暴露的表面或細(xì)胞內(nèi)PRR(模式識別受體，例 如，Toll-樣受體）結(jié)合后發(fā)生。
[0044] 本發(fā)明的再一方面是上述組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜促進(jìn)粘膜創(chuàng)傷治愈。優(yōu) 選地，本發(fā)明的組合物刺激上皮細(xì)胞分泌一種或更多生長因子，例如角質(zhì)形成細(xì)胞生長因 子（KGF)，或其他創(chuàng)傷治愈促進(jìn)因子諸如上皮生長因子（EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子（例 如.bFGF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落-刺激因子（GM-CSF)，轉(zhuǎn)化生長因子（例如.TGF- α或 β)，源于血小板的生長因子（PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)。組合物可由此刺激上皮 細(xì)胞和固有層的成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)組分，諸如膠原，層粘連蛋白或纖連蛋白及促 進(jìn)血管發(fā)生。
[0045] 優(yōu)選地，刺激分泌生長因子是生物學(xué)顯著的，例如生長因子的分泌被刺激達(dá)到對 靶細(xì)胞的顯著效應(yīng)的程度。
[0046] 本發(fā)明的仍再一方面是本發(fā)明的組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜發(fā)揮抗-炎性效 應(yīng)。本發(fā)明的組合物的抗-炎性效應(yīng)可還表征為：
[0047] (a)抑制促-炎性細(xì)胞因子表達(dá)；和/或
[0048] (b)刺激抗-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。
[0049] 優(yōu)選地，粘膜中一種或更多關(guān)鍵促-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)被本發(fā)明的組合物減 少，更優(yōu)選地，2種或更多關(guān)鍵促-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少，甚至更優(yōu)選，3種或更多 促-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少。優(yōu)選地，促-炎性細(xì)胞因子選自IL-1，IL-6, IL-8, IL-17， IFN-γ，TNF-a，MCP-1，IP10。優(yōu)選地，表達(dá)的減小是減小至少25%，優(yōu)選至少30%，35%， 40 %，45 %，更優(yōu)選至少50 %，理想地至甚至更大程度諸如至少60 %，70 %，80 %，90 %或甚 至更高。
[0050] 優(yōu)選地，一種或更多關(guān)鍵抗-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)被本發(fā)明的組合物刺激，更優(yōu) 選地，2種或更多抗-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)被刺激，甚至更優(yōu)選，3種或更多抗-炎性細(xì)胞 因子的表達(dá)被刺激。優(yōu)選地，抗-炎性細(xì)胞因子選自IL-IRa，IL-4, IL-10, IL-11，IL-13， TGF- β。優(yōu)選地，表達(dá)的刺激是刺激至少2倍，更優(yōu)選至少5,10,20, 50倍甚至更優(yōu)選至少 100倍，最優(yōu)選高于500倍或甚至更高。
[0051] 更優(yōu)選地，通過本發(fā)明的組合物提供促-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)的減小和抗-炎性 細(xì)胞因子的表達(dá)的刺激。
[0052] 本發(fā)明的另一方面是上述組合物，其中處于發(fā)展食道粘膜炎的風(fēng)險的受試者是經(jīng) 歷或即將經(jīng)歷化學(xué)治療和/或放射治療的癌患者。尤其是，處于發(fā)展粘膜炎的風(fēng)險的受試 者是作為之前化學(xué)治療和/或放射治療法治療的結(jié)果而發(fā)展粘膜炎的癌患者。之前化學(xué)治 療和/或放射治療法治療可為一系列治療周期中的早先治療周期，或在接收化學(xué)治療和/ 或放射治療之后緩解，但其中癌已再現(xiàn)及另一系列的化學(xué)治療和/或放射治療被指示的患 者中一系列治療周期的治療部分。
[0053] 本發(fā)明的組合物可預(yù)防性地或作為對有活性的，存在的粘膜炎的治療而給出。優(yōu) 選地，治療在粘I吳炎癥狀發(fā)生之如起始。治療可在開始化學(xué)治療和/或放射治療之如，冋時 或之后起始。優(yōu)選地，在接收化學(xué)治療的患者中，當(dāng)患者變得中性粒細(xì)胞減少（即，絕對嗜 中性粒細(xì)胞計數(shù)（ANC)〈0.5X10 9/L)，從而處于發(fā)展粘膜炎的風(fēng)險時開始施用組合物。優(yōu)選 地，貫穿中性粒細(xì)胞減少時期持續(xù)治療，直到ANC開始恢復(fù)或達(dá)到0. 5X 109/L和粘膜炎臨 床上消退。常誘導(dǎo)粘膜炎的化學(xué)治療劑包括，尤其是，甲氨蝶呤，蒽環(huán)類抗生素，5-氟尿嘧啶 和骨髓摘除化學(xué)治療方案。優(yōu)選地，在接收局部放射治療的患者中，在治療的整個持續(xù)時間 期間施用組合物和直到粘膜炎消退。
[0054] 本發(fā)明的組合物被施用給受試者達(dá)6次/天，優(yōu)選達(dá)5次/天，更優(yōu)選達(dá)4次/天， 甚至更優(yōu)選達(dá)3次/天，最優(yōu)選2次/天或甚至更低頻度。
[0055] 在本發(fā)明的另一方面，組合物包含用于治療粘膜炎的另外的有效劑，諸如生長因 子或防腐劑。也包括在本發(fā)明中的是產(chǎn)物，其包含本發(fā)明的組合物和第2活性劑作為組合 的制備物，所述第2活性劑用于在治療食道粘膜炎中同時，分離或連續(xù)使用。該第2活性劑 可為，例如，促進(jìn)創(chuàng)傷治愈的劑，諸如生長因子，抗微生物劑諸如防腐劑，例如防腐漱口水， 或抗-炎性劑。
[0056] 本發(fā)明會在以下非限制性例中，參照以下圖例證： 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0057] 圖1.用0. 5 μ g/ml的蛋白/mm凝膠槽免疫印跡分析（10 %十二燒基硫酸鈉-聚 丙烯酰胺凝膠電泳），隨后蛋白印跡轉(zhuǎn)移和使用mAbl7C7 (特異于三聚體和單體UspAl和 UspA2)[小圖A]，mAb24B5(特異于單體UspAl)[小圖B]，及mAblOF3(特異于CopB)[小圖 C]檢測0ΜΡ。綴合了 HRP的第二山羊抗-小鼠 IgG抗體用于第一抗體檢測。
[0058] 圖2.用0. 4μ g/ml的蛋白/mm凝膠槽免疫印跡分析（10%十二燒基硫酸鈉-聚丙 烯酰胺凝膠電泳），隨后蛋白印跡轉(zhuǎn)移和作為第一抗體源使用人合并的唾液（〇. 3g/l)[小 圖A]，血漿IgA F4[小圖B]或合并的血漿IgG ( Privigen? )[小圖c]，及用于使用化 學(xué)發(fā)光可視化的適當(dāng)?shù)木Y合了 HRP的第二抗體來檢測抗體結(jié)合。
[0059] 圖3.使用IgA F4的附著抑制測定。將MEM和MEM-PBS用作陰性對照。將補(bǔ)充5mg/ ml的IgA F4的035E. 1和035. 1用作陽性對照?？傮wp值（單因素 AN0VA)是〈0. 0001 ;* 指示顯著性水平〈0.05。
[0060] 圖4.使用IgA F5A的附著抑制測定。將MEM和MEM-PBS用作陰性對照。將補(bǔ)充 5mg/ml的IgA F5A的035E. 1和035. 1用作陽性對照?？傮wp值（單因素 AN0VA)是〈0· 001 ; *指示顯著性水平〈0.05。
[0061] 圖5.使用IgG ( Privigen? )的附著抑制測定。將ΜΕΜ,ΜΕΜ-脯氨酸和MEM-PBS 用作陰性對照。將補(bǔ)充l〇mg/ml的IgG的035E. 1和035E. 1用作陽性對照。總體p值（單 因素 AN0VA)是0.009 ;柱間差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。
[0062] 圖6.使用IgM F5A的附著抑制測定。將MEM和MEM-PBS用作陰性對照。將補(bǔ)充 5mg/ml的IgM F5A的035E. 1和035. 1用作陽性對照?？傮wp值（單因素 AN0VA)是〈0· 001 ; *指示顯著性水平〈0.05。
[0063] 圖7.展示10mg/ml濃度的IgA F4顯著地抑制細(xì)菌穿透上皮細(xì)胞的粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)侵入測定?？傮wp值（單因素 AN0VA)是0. 014 指示顯著性水平〈0. 05。 無法利用顯示細(xì)胞侵入的完全抑制的可靠的對照。
[0064] 圖8.展示10mg/ml濃度的合并的人血漿IgG ( Privigen? )顯著地抑制細(xì)菌 穿透上皮細(xì)胞的粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)侵入測定?？傮wp值（單因素 AN0VA)是 0. 015 ;*指示顯著性水平〈0. 05。無法利用顯示細(xì)胞侵入的完全抑制的可靠的對照。
[0065] 圖9.展示5和2. 5mg/ml濃度的IgM F5A顯著地抑制細(xì)菌穿透上皮細(xì)胞的粘膜炎 莫拉菌（M. catarrhalis)侵入測定?？傮wp值（單因素 AN0VA)是〈0· 0001 ;*指不顯著性 水平〈0. 05。無法利用顯示細(xì)胞侵入的完全抑制的可靠的對照。
[0066] 圖10.通過使用用粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)外膜蛋白（0ΜΡ)刺激的底特律 562細(xì)胞評定IgA F4的抗-炎性活性。在0ΜΡ刺激時，將增加的濃度的IgA應(yīng)用于細(xì)胞。 在刺激起始時（t = 〇)和24h后（t = 24)，使用多重懸浮液陣列（Luminex technology)測 量由底特律562細(xì)胞分泌MCP-1 (A)，IL-8 (B)和IL-6 (C)。陰性對照是未添加0ΜΡ的樣品。
[0067] 圖11.通過使用H376和HGF-1細(xì)胞評定IgA F4的抗-炎性活性。增加濃度的IgA 應(yīng)用于靜止H376和HGF-1細(xì)胞或在刺激時應(yīng)用（HGF-1細(xì)胞）。在刺激之后24h，使用多重 懸浮液陣列（Luminex technology)測量由 H376 分泌 IP-10(A)和 G-CSF(B)和由 HGF-l(C) 細(xì)胞分泌IP-10。
[0068] 圖12.使用IgA F4的附著抑制測定。IgA F4干擾肺炎鏈球菌（S. pneumoniae) R6(A)和緩癥鏈球菌（S.mitis) (B)向H376細(xì)胞的附著能力。
[0069] 圖13.使用IgA F4的細(xì)胞毒性測定。對H376細(xì)胞的γ -輻射-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 的IgA F4的劑量效應(yīng)減小。（A)如在時間線上描繪實施實驗。（B)在輻射之后24h，通過使 用CytoTox-Glo?細(xì)胞毒性測定（Promega)測量細(xì)胞死亡。數(shù)對應(yīng)于在用毛地黃皂苷處理 的H376細(xì)胞樣品中測量的與總細(xì)胞毒性相關(guān)的比細(xì)胞死亡。
[0070] 圖14.使用IgA F4的創(chuàng)傷治愈測定。（A)如在時間線中描繪實施實驗。（B，C，D)通 過以不同時間間隔捕獲劃痕的像記錄單層細(xì)胞中人工間隔的閉合，和測量間隔尺寸。100% 創(chuàng)傷表皮細(xì)胞再生對應(yīng)于人工間隔的全恢復(fù)。
[0071] 圖15.上皮細(xì)胞系上IgA受體的分析。對H376和底特律細(xì)胞實施⑶71和⑶89(或 關(guān)聯(lián)同種型對照）的染色及通過使用流式細(xì)胞儀分析。
[0072] 圖16.由ELISA評定IgA F4和IgG制備物中的抗-TNF活性。將來自ELISA板的 孔用TNFa (lyg/ml)包被和進(jìn)一步阻斷。將增加的濃度IgA F4，IgG和抗-TNFa抗體（單 克隆，英利昔單抗）應(yīng)用于孔。在一些孔中，加入游離的TNFa以抑制測試的抗體的特異 性結(jié)合（競爭測定；條）。在洗滌之后，結(jié)合TNF a的免疫球蛋白用HRP-標(biāo)記的特定第二 抗體揭示。 【實施例】
[0073] 實施例中包括的研究顯示，免疫球蛋白可具有組合的抗微生物和抗-炎性/ 促-創(chuàng)傷治愈效應(yīng)，及因此是有效預(yù)防和治療食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎的有吸引力 的選項。
[0074] 為了模擬口咽腔的粘膜上皮細(xì)胞層，使用上皮細(xì)胞系。用于該研究的適合的細(xì)胞 系的一例是人咽細(xì)胞系底特律562(ATCC CCL138)。使用的其他適合的細(xì)胞系是H376,源于 口底的鱗狀癌細(xì)胞系，及HGF-1，牙齦成纖維細(xì)胞細(xì)胞系。作為粘膜微生物區(qū)系的部分的微 生物的一例，我們使用了粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis)，其是典型鼻-及口咽病 原體，以及口腔小型生物群中發(fā)現(xiàn)的其他細(xì)菌，諸如鏈球菌屬（Streptococcus)物種。此模 型實驗系統(tǒng)被認(rèn)為對于初步體外實驗適合，因為該細(xì)胞系的來源對應(yīng)于經(jīng)口施用的免疫球 蛋白的旨在的（優(yōu)選的）作用位點。此外，底特律細(xì)胞已之前顯示在暴露于細(xì)菌（活的或 滅活的全細(xì)菌或細(xì)菌表面組分）后呈現(xiàn)促炎活化。選擇粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)，其 是兼性病原體，其唯一的天然的棲息地是人咽，，因為其體外粘附于及穿透底特律細(xì)胞的能 力，及因為其誘導(dǎo)促炎介質(zhì)諸如IL-6, IL-8, TNFa，MCP-1和GM-CSF分泌。此外，粘膜炎莫 拉菌（M. catarrhalis)的特定外膜蛋白（例如，UspAl和UspA2)均通過與CEACAM1和TLR2 結(jié)合來介導(dǎo)附著和侵入及引發(fā)促炎級聯(lián)。這些外膜蛋白的等基因敲除突變體是可利用的。 粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)的UspAl和UspA2是被人免疫系統(tǒng)識別的知道的免疫原及 在健康個體中誘導(dǎo)特定血楽和唾液IgA和IgM。此外，將鏈球菌屬（Streptococcus)物種， 尤其是緩癥鏈球菌（S.mitis)及肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)用作存在于口腔中的典型機(jī) 會性病原體。由此，此體外模型適合于評定人免疫球蛋白制備物對細(xì)菌附著和侵入及對發(fā) 炎的細(xì)菌誘導(dǎo)的效應(yīng)。
[0075]【實施例1 :源于血漿和源于唾液的免疫球蛋白制備物包含識別粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)的抗體】
[0076] 為了測試是否我們的免疫球蛋白制備物可具有抗-微生物效應(yīng)，我們首先要建立 是否它們含有識別在口-咽道的粘膜表面上發(fā)現(xiàn)的潛在病原體的抗體。作為該微生物的一 例，我們使用了粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)。
[0077] 1. 1.細(xì)菌株和人細(xì)胞系。粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)株25238購自美國典型 培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)。實驗室株035E是自患中耳炎的兒童的中耳分離物。在腦-心臟 輸注（BHI)瓊脂板（Difco,底特律，MI)上，于37°C，在5% C02氣氛中或于37°C和200旋 轉(zhuǎn)/分鐘（rpm)，在BHI肉湯中培養(yǎng)細(xì)菌。在一些實驗中，通過將活細(xì)菌重懸浮于PBS和于 60°C溫育60min來將細(xì)菌熱-滅活。在補(bǔ)充10%的熱滅活的胎牛血清（FCS)，2mM的L-谷 氨酰胺，ImM丙酮酸鈉 （Sigma, St. louis，M0)，IX非必要氨基酸（Sigma)，100U/ml青霉素， 及 100 μ g/ml 鏈霉素的 Eagle 氏最小必要培養(yǎng)基（MEM ;Invitrogen, Basel, Switzerland) 中，于37°C，在5%C02中維持人咽細(xì)胞系底特律562(ATCC CCL 138)。
[0078] 【1.2.試劑】合并的人免疫球蛋白同種型（IgA( "IgA F4" [50mg/ml]，"IgA F5A"[50mg/ml)]IgG( Privigen? [lOOmg/ml]和 IgM( "IgM F5A"[10mg/ml])，分別）獲 自CSL Behring, Bern, Switzerland。IgG制備物是可商購的人靜脈內(nèi)IgG(IVIG)制備物 (Privigen? )。純化的人血漿IgA和igM級分是實驗產(chǎn)物。由mphq柱的連續(xù)洗脫和由 親和層析的隨后分離從血楽產(chǎn)生IgA。自CSL Behring AG(Berne, Switzerland)的IVIg制 備過程的AIEX層析步驟，在用pH6. 5的10mM磷酸鹽/30mM乙酸鹽進(jìn)行Macro-Prep High Q(Bi〇-Rad，Hercule，CA)柱的后洗滌之后，通過用pH7. 6的55mM酒石酸鹽/5mM乙酸鹽洗 脫獲得級分F4。將級分F5隨后用pH5. 0的50mM磷酸鹽/25mM檸檬酸鹽洗脫。使F4和F5 在PBS中由超濾/滲濾達(dá)到大致lmG/mL，然后由親和層析，使用IgSelect樹脂（GE Healt hcare, Glattbrugg, Switzerland)耗盡IgG。在F4負(fù)荷的IgSelect層析的流通物中直接 收獲IgA F4。為了獲得IgA F5,由親和層析，使用CaptureSelect人IgM樹脂（Bioaffinity Company BAC)使F5負(fù)荷的IgSelect流通物耗盡IgM。此CaptureSelect人IgM樹脂的洗 脫產(chǎn)生這里使用的IgM F5級分。使IgA F4, IgA F5和IgM F5由超/滲濾達(dá)到終濃度。
[0079] 【1. 3.免疫印跡分析】由 EDTA-緩沖劑方法（Murphy TF & Loeb MR(1989)Microb Pathog 6 :159-74)制備株25238和035E的外膜蛋白（0ΜΡ)制備物，及分別以圖1和2中 0. 5和0. 4μ g/mm的凝膠槽的蛋白濃度由SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺）解析。隨后將凝膠 電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜（Imm〇bil〇n-P?，Millipore 公司，Bedford，MA)。通過使用單克 隆抗體（17C7(Aebi C 等人（1997) Infect Immun65:4367-77)，24B5 (Cope LD 等人（1999) J Bacteriol 181 :4026-34)，10F3(Aebi C 等人（1998) Infect Immun 66 :3113-9) [0.5% 的mAb上清液，不知道絕對濃度])和唾液或上述的合并的人IgA或IgG(0. 4μ g/ml)作 為第一抗體和1:4000-稀釋的用辣根過氧化物酶（Sigma Corp.，St. louis, M0)標(biāo)記的山 羊-抗-人IgA或IgG作為第二抗體實施免疫印跡分析。將SuperSignal West Pico化學(xué) 發(fā)光底物（Pierce Chemical Co·, Rockford, IL)用于抗體結(jié)合的檢測。
[0080] 圖 1 展不，類似于株 035E (Helminen ME 等人（1993) Infect Tmmun 61 :2003-10 ; Helminen ME 等人（1994) J Infect Dis 170 :867-72 ;Cope LD 等人（1999) J Bacteriol 181 :4026-34)，株 ATCC 25238 的 0ΜΡ 與針對主要 0ΜΡ UpAl (mAb 17C7 和 mAb24B5)， UspA2(mAbl7C7)和CopB(mAblOF3)的3種單克隆抗體強(qiáng)烈反應(yīng)，從所述株產(chǎn)生這些mAbs， 且其是粘膜炎莫拉菌（Mcatarrhalis)的主要和更臨床關(guān)聯(lián)種系發(fā)生系1的標(biāo)準(zhǔn)代表 (Meier PS 等人（2005) Vaccine 23 :2000-8)。
[0081] 我們隨后使用標(biāo)準(zhǔn)免疫印跡測定（Stutzman等人（2003) Infect Immun 71 : 6793-8)確認(rèn)，人血漿和唾液含有與來自株ATCC 25238和035E的粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis) 0ΜΡ反應(yīng)的抗體。圖2展示，人唾液和0ΜΡ含有被人IgA (唾液，0ΜΡ)和/ 或IgG識別的多種抗原。
[0082] 重要的是首先確定，株ATCC 25238在表達(dá)上皮細(xì)胞粘附素 （mAbs 17C7和25B4) 中與標(biāo)準(zhǔn)035E種系發(fā)生組1株（其在世界上用作粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)的參照 小兒中耳分離物）類似地發(fā)揮作用（Bootsma HJ等人（2000) J Infect Dis 181 :1376-87)， 及用于可利用的單克隆抗體的產(chǎn)生。圖1顯示這是事實。此外，如顯示于圖2,血漿來源的 IgA和IgG識別相同的ATCC 25238外膜表位，其還確證此株在我們的實驗系列中的有用性。 這里已注意到，UspAl主要粘附素（與mAbs 17C7和24B5具有反應(yīng)性）含有與人纖連蛋白 反應(yīng)及與 CEACAM 1 反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域（Brooks MJ 等人（2008) Infect Immun 76 :5322-9)和應(yīng) 由此能結(jié)合廣泛的人上皮細(xì)胞系。免疫印跡中不同條帶的產(chǎn)生支持抗體通過使用它們的特 異性抗原-結(jié)合（Fab)結(jié)構(gòu)域結(jié)合外膜囊泡的觀點。
[0083] 【實施例2 :細(xì)菌粘接于上皮細(xì)胞的抑制】
[0084] 為了進(jìn)一步證實我們的免疫球蛋白制備物的抗-微生物效應(yīng)，測試是否免疫球蛋 白制備物在抑制粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)粘接于咽上皮細(xì)胞系底特律562中有效。
[0085] 如之前描述，用以下修改，體外測量粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)粘附于人上 皮細(xì)胞的能力（Aebi C等人（1998) Infect Immun 66:3113-9)。將底特律562細(xì)胞（? 3X 105細(xì)胞/孔）在24孔組織培養(yǎng)板中，在補(bǔ)充0. 1 % FCS但無抗生素的MEM中生長過夜 至鋪滿單層，之后在MEM中洗滌3次。使細(xì)菌生長過夜及調(diào)整至適當(dāng)?shù)母腥緩?fù)數(shù)（Μ0Ι)。將 活細(xì)菌加入孔中的無 FCS、補(bǔ)充適當(dāng)?shù)臐舛鹊拿庖咔虻鞍祝ㄈ缫陨隙温?. 2描述制備的）或 對照（例如對于IgG測定是脯氨酸），但無抗生素的MEM中，以1，500rpm離心5min，及隨后 于37°C溫育30分鐘。然后將孔在MEM中洗滌5次，經(jīng)胰蛋白酶處理，及將懸浮液定量培養(yǎng)， 以測定附著的細(xì)菌數(shù)。將株035E. 1(8卩，由等位基因取代產(chǎn)生的等基因 uspAl粘附素敲除 突變體（Aebi C等人（1998) Infect Immun 66 :3113-9))用作陽性（即，附著抑制）對照。 數(shù)據(jù)表示為粘附于上皮細(xì)胞的原接種物的細(xì)菌的比例。各測定以一式三份進(jìn)行和實施至少 3次實驗，導(dǎo)致每研究的條件至少9個數(shù)據(jù)點。由錐蟲藍(lán)排除及商業(yè)LDH測定（BioChain Institute, Inc.，Hayward, CA)在形態(tài)學(xué)上查明細(xì)胞活力。
[0086] IgA F4 (圖3)和IgA F5 (圖4)均以5mg/ml的濃度顯著地抑制附著。補(bǔ)充5mg/ ml的IgA的陽性對照035. 1和035. 1的附著顯著地更低。由合并的人血楽IgG的附著的抑 制是顯著總體上的，但柱間差異未達(dá)到的統(tǒng)計學(xué)意義，盡管圖5提示IgG濃度-依賴性抑制 性效應(yīng)。IgM F5A級分，另一方面，如顯示于圖6展示強(qiáng)附著-抑制效應(yīng)。
[0087] 5mg/ml的濃度的IgA F4和IgA F5被發(fā)現(xiàn)顯著地抑制向底特律細(xì)胞附著（見圖3 和圖4)。似乎有劑量-效應(yīng)曲線。陽性對照株035. 1 (缺少主要粘附素 UspAl表達(dá)的等基因 突變體）的附著也顯著地更低（未示出顯著性）。這些發(fā)現(xiàn)指示，血漿IgA大致在生理學(xué)唾 液濃度一個l〇gl〇以上的濃度能抑制粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)與咽上皮細(xì)胞體外結(jié) 合。這些數(shù)據(jù)支持其作為中和"粘膜"抗體阻止細(xì)菌表面組分（例如，0MP，L0S)的促-炎性 效應(yīng)的潛力。對純化的血漿IgM F5A記載了類似發(fā)現(xiàn)（圖6)。對血漿IgG ( Privigen? ) 也觀察到類似趨勢（圖5)，盡管未獲得統(tǒng)計學(xué)意義。值得一說的是，結(jié)合的IgG (以及IgM) 強(qiáng)烈活化人補(bǔ)體及細(xì)菌結(jié)合隨后殺滅或調(diào)理素作用可在防止粘膜炎中是不期望的。但是， 未知補(bǔ)體是否及以何程度在人腔中活動。
[0088] 【實施例3 :上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵入被免疫球蛋白抑制】
[0089] 如之前顯示（Spaniol V等人（2008)Microbes Infect 10 :3 ?11)，粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)能在兒童和年輕成年中穿透上皮細(xì)胞和甚至體內(nèi)定位進(jìn)粘膜下咽軟組織 (Heiniger N等人（2007)J Infect Dis 196:1080-7)。由此，我們研究了人免疫球蛋白體 外抑制咽上皮細(xì)胞穿透的潛力，以進(jìn)一步展示免疫球蛋白制備物的潛在益處。
[0090] 如之前描述，加以下修飾，通過使用慶大霉素保護(hù)測定估計細(xì)菌侵入（Spaniol V et al(2008)Microbes Infect 10:3-11)。在無抗體的培養(yǎng)基中制備細(xì)胞。在洗滌之 后，以30的Μ0Ι添加細(xì)菌以及指示的濃度的如以上段落1. 2描述制備的各免疫球蛋白，以 l，500rpm離心5min及于37°C，在5% C02中溫育3h。為了測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)，將感染的單 層在PBS中洗滌3次，及于37°C用硫酸慶大霉素（200μ g/ml)處理2h。在洗滌之后，細(xì)胞 通過用0. 25 %胰蛋白酶-EDTA處理而自塑料表面分開，通過添加1 %皂苷裂解，及在PBS中 連續(xù)稀釋，用于定量細(xì)菌培養(yǎng)。通過在慶大霉素暴露之后恢復(fù)的cfu數(shù)除以接種的cfu數(shù) 來計算侵入比。
[0091] 圖7展示，相比0. lmg/ml，10mg/ml濃度的IgA F4顯著地抑制底特律562咽細(xì)胞 的穿透。l〇mg/ml與陰性對照（MEM-PBS)的比較未達(dá)到顯著性。類似地，相比MEM-PBS陰性 對照，l〇mg/ml的人合并的血楽IgG ( Privigen? )顯著地抑制侵入。血楽IgM F5也是如 此，其相比MEM-PBS對照和0. lmg/ml的最低IgG濃度，以5mg/ml展示顯著的侵入抑制。作 為圖7?9中的分散量度，我們使用了平均值（SEM)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。我們也被迫克制不表示 "陽性"對照在底特律細(xì)胞穿透中完全失效，因為得不到那樣的細(xì)菌。
[0092] 再更典型的細(xì)胞外病原體最近已被發(fā)現(xiàn)能穿透粘膜上皮細(xì)胞層或穿過粘膜上皮 細(xì)胞層胞吞轉(zhuǎn)運，例如，非可分型的流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae) (Eldika， N&Sethi S(2006)Curr Opin Pulm Med 12 :118_24)，金黃色葡萄球菌屬（Staphylococcus aureus) (Que YA等人（2005) J Exp Med 201 :1627-35)等。細(xì)胞內(nèi)存留可為避免粘膜免疫 及接近宿主的上皮下及-最終-血管空間的手段。此可在患者中與發(fā)熱中性粒細(xì)胞減少癥 和粘膜炎具有特定關(guān)聯(lián)。我們使用建立的慶大霉素保護(hù)測定測量了上皮穿透的免疫球蛋 白-介導(dǎo)的抑制，并發(fā)現(xiàn)，全部3種同種型能抑制底特律細(xì)胞的穿透。在IgA F4(圖7)和 IgM F5A (圖9)的情況中，分別以10mg/ml和5mg/ml觀察到顯著抑制。再次，血漿IgG (圖 8)也發(fā)現(xiàn)類似趨勢，盡管不統(tǒng)計學(xué)地顯著。
[0093]【實施例4 :上皮細(xì)胞因子/趨化因子釋放由免疫球蛋白的調(diào)節(jié)】
[0094] 為了顯示免疫球蛋白的抗-炎性效應(yīng)的潛力，研究是否免疫球蛋白制備物對由上 皮細(xì)胞的細(xì)胞因子/趨化因子釋放具有效應(yīng)。
[0095] 制備底特律單層細(xì)胞及在增加的濃度的IgA F4的存在下，用不同濃度的粘膜炎 莫拉菌（M. catarrhalis)OMP(關(guān)于OMP制備，見實施例1. 3)刺激。陰性對照由含或不含 OMP的培養(yǎng)基組成。在刺激之后0和24小時時間收集個體上清液，然后保持于-80°C直到 分析。在本實驗中，在檢測之前，將樣品溫育16小時過夜。作為基質(zhì)溶液，我們使用了含 0. 1% FCS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Sigma, R8758)。在制備樣品之后，用Bioplex 200分 析儀（BioRad)獲取數(shù)據(jù)。使底特律細(xì)胞的制備物暴露于各種濃度的免疫球蛋白，和在Bern 大學(xué)的感染性疾病學(xué)會實施OMP。在CSL Behring，Bern進(jìn)行細(xì)胞因子/趨化因子的測定。
[0096] 在0時間，底特律細(xì)胞接收補(bǔ)充或未補(bǔ)充0ΜΡ的新鮮培養(yǎng)基和不同濃度的IgA F4。 由于此原因，及如顯示于圖l〇A，B，C，在此時間，在上清液中幾乎檢測不到細(xì)胞因子。在 24h，無任何0ΜΡ，底特律562細(xì)胞分泌可檢測的水平的MCP-1，IL-8和IL-6 (圖10A，B，C)。 MCP-1是調(diào)控單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞募集的關(guān)鍵趨化因子。其涉及許多疾病（Deshmane SL等 人（2009) J. Int. &Cyt. Res. 29, 6, 313?326)。IL-8(或嗜中性粒細(xì)胞趨化因子）是向組織 募集嗜中性粒細(xì)胞的趨化因子。其也與口腔前庭中的發(fā)炎關(guān)聯(lián)（Ertugrul AS等人（2013) J Periodont Res ;48 :44?51)。最后，還有，IL-6是發(fā)炎的重要介質(zhì)，及已顯示在照射的成 纖維細(xì)胞中被誘導(dǎo)（Brach MA 等人（1993) J. Biol. Chem. 268:8466 - 8472 ;Rincon Μ (2012) Trends Immunol. 33(11)571-577)。重要的是，培養(yǎng)基中添加0ΜΡ分別增加 MCP-1，IL-8和 IL-6產(chǎn)生約10,3及7倍。而且，盡管低量的IgA F4對0ΜΡ-誘導(dǎo)的趨化因子/細(xì)胞因子產(chǎn) 生幾乎無效應(yīng)，l〇mg/ml IgA醒目地減少MCP-1，及在較少程度上，IL-8和IL-6分泌。
[0097] 為了支持這些結(jié)果，我們旨在測試對另外的細(xì)胞系的IgA F4活性?？诘捉M織代表 在口腔粘膜炎過程期間損傷的組織之一。我們發(fā)現(xiàn)了新細(xì)胞系，H376(人口腔鱗狀細(xì)胞癌； HPACC 06092005)，其來源于口底。除了 H376之外，我們選擇研究牙齦成纖維細(xì)胞（HGF-1 細(xì)胞系；ATCC? CRL-2014?)，由于它們位于頰上皮細(xì)胞下，和會在口腔粘膜炎過程中感 覺發(fā)炎。
[0098] 在以下實驗中，我們分析了 H376和HGF-1細(xì)胞的細(xì)胞因子特征。
[0099] 在2種濃度的IgA F4(在MEM中制備的5和10mg/ml)存在下制備單層細(xì)胞。陰性 對照由培養(yǎng)基單獨（純MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，Life technologies, 51200-046)組成。在24小 時收集個體上清液。將HGF-1細(xì)胞用已知刺激成纖維細(xì)胞的促-炎性細(xì)胞因子（例如重組 IL-Ιβ 和 TNFa,均在 50ng/ml ;分別獲自 Milteni(130-093-893)和 P印rotech(300-01A)) 刺激。在刺激之后，然后使上清液保持于-80°C直到分析。作為基質(zhì)溶液，我們使用了 MEM。 在制備樣品之后，用BiopleX200分析儀（BioRad)獲取數(shù)據(jù)。
[0100] H376細(xì)胞分泌IP-10,其是與發(fā)炎關(guān)聯(lián)的IFN-Y-誘導(dǎo)的蛋白（Liu Μ等人（2011) Cytokine growth Factor Rev. 22(3)，121-130)和分泌G-CSF，其代表能在炎性位點募集嗜 中性粒細(xì)胞的炎性介質(zhì)（Suzuki S(2002)Blood 99:1863-1865)(圖 ΙΙΑ,Β)。在圖 11A 和 B 中，我們顯示，用IgA 5mg/ml治療H376細(xì)胞強(qiáng)烈減少IP-10和G-CSF產(chǎn)生約50%。增加 IgA濃度至10mg/ml未進(jìn)一步減少G-CSF產(chǎn)生，但相比5mg/ml的IgA稍微更佳地減少IP-10 產(chǎn)生（圖11A，B)。H376細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞和可具有活化的表型。我們不可排除，IP-10和 G-CSF水平無法如在原代頰上皮細(xì)胞中那么高。
[0101] HGF-1是牙齦成纖維細(xì)胞。它們未以穩(wěn)定狀態(tài)產(chǎn)生任何IP-10 (圖11C)。但是，當(dāng) 將炎性分子諸如IL-Ιβ和TNF-α應(yīng)用于它們的培養(yǎng)基（純MEM)時，有清楚的IP-10產(chǎn)生 的誘導(dǎo)。以相當(dāng)?shù)臐舛龋啾菼L_13，TNFa在IP-10誘導(dǎo)中更有力。在兩個條件下，在刺 激時添加 IgA強(qiáng)烈減少IP-10產(chǎn)生，最高IgA F4濃度顯示最強(qiáng)減小。然而，5mg/ml的IgA F4顯示非常近似的免疫抑制效應(yīng)（圖11c)。
[0102] 總之，我們的數(shù)據(jù)首次顯示，IgA F4對不是骨髓樣細(xì)胞的細(xì)胞（例如上皮細(xì)胞）發(fā) 揮免疫抑制效應(yīng)。這是非常有價值的信息，由于在口腔粘膜炎過程期間，會由上皮細(xì)胞和成 纖維細(xì)胞響應(yīng)電離輻射和/或細(xì)菌定居而上調(diào)促-炎性趨化因子和細(xì)胞因子。這些結(jié)果指 示，在口腔粘膜炎過程期間，IgA可潛在地將其免疫抑制效應(yīng)靶向廣范圍的細(xì)胞子集（例如 嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞，等）。
[0103] 【實施例5 :由免疫球蛋白抑制由除粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)之外的細(xì)菌誘 導(dǎo)的附著，侵入和上皮細(xì)胞因子/趨化因子釋放的調(diào)節(jié)】
[0104] 在類似實驗中，如描述于實施例1?4,研究了其他微生物諸如除粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)之外的細(xì)菌，或真菌。它們包括但不限于病原性和機(jī)會性病原性物種， 如大腸埃希氏菌（Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus),銅 綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，草綠色鏈球菌（Streptococcus viridans)組， 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)，奠腸球菌（Enterococcus faecalis)/屎腸 球菌（Enterococcus faecium)，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)，產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)，流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)，釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes)，緩癥鏈球菌 (Streptococcus mitis)，白色假絲酵母（Candida albicans)和許多厭氧細(xì)菌物種。獲得 了如在實施例1?4中描述的類似結(jié)果：IgA制備物含有針對上述的細(xì)菌或真菌的特異性 抗體；上皮細(xì)胞的附著和侵入被抑制；炎性細(xì)胞因子應(yīng)答被抑制。用其他上皮細(xì)胞系（胃腸 道和結(jié)腸的粘膜襯的代表）獲得類似結(jié)果。
[0105] 【實施例6 :動物模型中粘膜炎的防止】
[0106] 在口腔粘膜炎的動物模型中測試適當(dāng)配制的免疫球蛋白制備物。在自Ryu等人適 應(yīng)的CD89-轉(zhuǎn)基因小鼠模型中由同時化學(xué)-及放射治療（CCRT)預(yù)防性地應(yīng)用免疫球蛋白 及隨后粘膜炎誘導(dǎo)（J. radiat. Res.，51，595?601，2010)。我們測量了免疫球蛋白治療對 口腔粘膜炎的程度和嚴(yán)重性，而且對與創(chuàng)傷-治愈和從CCRT得到的組織損傷的分辨率關(guān)聯(lián) 的因素的效應(yīng)?？谇徽衬ぱ讎?yán)重性的實際指標(biāo)是體重減輕，舌及頰粘膜萎縮（上皮厚度）。 此外，通過測量上皮層厚度，粘膜中基底細(xì)胞數(shù)，增殖標(biāo)志物KI-67, mRNA轉(zhuǎn)錄物的組織定 量（由組織樣品的原位雜交和RT-PCR)和生長因子如KGF，上皮生長因子，纖維細(xì)胞生長因 子，血管內(nèi)皮生長因子A等的蛋白表達(dá)來評定治療效果。該分析會產(chǎn)生關(guān)于作為免疫排除 的結(jié)果和潛在地也由于IgA與表達(dá)CD89的細(xì)胞的直接相互作用的細(xì)胞內(nèi)促炎級聯(lián)下調(diào)的 信息。相比非-處理的動物，用IgA處理的小鼠失更少體重和它們的舌和頰粘膜被欠嚴(yán)重 影響。用分泌-樣IgA處理的小鼠甚至被更佳地保護(hù)。
[0107] 或者，使用口腔粘膜炎的倉鼠模型，類似于描述于Watkins等人（Oral Dis 2010, 16:655-660)。給敘利亞金色倉鼠每天3次預(yù)防性地施用（例如起始于第-3天）適 當(dāng)配制的IgA制備物（或?qū)φ帐敲劫|(zhì)溶液）經(jīng)研究的整個持續(xù)時間達(dá)第28天。在急性放 射-誘導(dǎo)的粘膜炎模型中，在第〇天照射（40Gy) -個外翻的頰囊，另一頰囊保持未處理用 于對照?；蛘撸诜执蔚姆派?誘導(dǎo)的粘膜炎模型中，應(yīng)用60Gy的累積劑量，分為7. 5Gy的 8個部分，如描述于（Watkins, Oral Dis 2010, 16:655-660)。在組合順鉬和急性放射-誘導(dǎo) 的粘膜炎的又另一模型中，通過在第〇天組合順鉬（5mg/kg)和35Gy放射來誘導(dǎo)疾病。從 第6天起始直到研究結(jié)束（一般在第28天）每天進(jìn)行口腔粘膜炎的臨床評估及體重監(jiān)測。 評分系統(tǒng)描述于（Watkins Oral Dis, 201016:655-660)。此外，收集組織和血漿樣品及貫穿 組織分析的研究，測定血漿中的炎性標(biāo)志物及為各種組織的基因表達(dá)研究而適當(dāng)加工。未 處理的/媒質(zhì)處理的動物發(fā)展口腔粘膜炎，疾病峰約第16?18天，自發(fā)治愈，通過粘膜炎 消退證明，約第18?20天起始。用IgA治療的動物相比對照動物具有顯著地更低粘膜炎 分值及體重減輕更少，并行欠嚴(yán)重的組織發(fā)現(xiàn)及減少的炎性標(biāo)志物（包括但不限于炎性細(xì) 胞因子和趨化因子）水平。由基因-表達(dá)分析技術(shù)在mRNA表達(dá)水平確認(rèn)了發(fā)炎減小和促 進(jìn)創(chuàng)傷-治愈。用分泌-樣IgA治療甚至更有效。
[0108] 【實施例7 :機(jī)會性病原體附著于頰上皮細(xì)胞的抑制】
[0109] 為了確證及進(jìn)一步加強(qiáng)我們的在實施例2中提供的我們的免疫球蛋白制備物的 抗-微生物效應(yīng)的數(shù)據(jù)，我們測試了 IgA干擾細(xì)菌附著于H376上皮細(xì)胞的能力。
[0110] 頰微生物區(qū)系由對于硬壁菌門（Firmicutes)優(yōu)勢的廣泛的細(xì)菌株組成（The Human Microbiome Project Consortium(2012)Nature486:207-214)(Dewhirst FE(2010) J.Bacteriol 192:5002-5017)。重要的是，非-包裹的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)及緩癥鏈球菌（Streptococcus mitis)(均來自硬壁菌門（Firmicutes))是遺 傳上非常接近的。緩癥鏈球菌（S.mitis)已知代表主要口腔機(jī)會性病原體和當(dāng)上皮屏障破 裂（如可一般在患口腔粘膜炎的患者中發(fā)生）時，可潛在地導(dǎo)致感染。非-包裹的肺炎鏈 球菌（S. pneumoniae)良好粘附于上皮和可導(dǎo)致粘膜感染包括結(jié)膜炎，但不是侵襲性疾病。 由此，在此工程的情景中，肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)R6和緩癥鏈球菌（S.mitis)是對于 研究細(xì)菌和口腔粘膜上皮之間的相互作用有用的模型生物。
[0111] 體外測量細(xì)菌分離物粘附于人上皮細(xì)胞的能力，如之前在實施例2中描述及在文 獻(xiàn)（Aebi C等人（1998)Infect Immun 66 :3113-9)描述，具有以下修飾。使H376細(xì)胞（? 3 X 105細(xì)胞每孔）在24孔組織培養(yǎng)板中，在補(bǔ)充0. 1 % FCS，但無抗生素的MEM中生長過 夜至鋪滿單層，之后在MEM中洗滌3次。使細(xì)菌生長過夜及調(diào)整至適當(dāng)?shù)母腥緩?fù)數(shù)（Μ0Ι)。 將活細(xì)菌加入孔中的無 FCS、補(bǔ)充適當(dāng)?shù)臐舛鹊拿庖咔虻鞍祝ㄈ缫陨隙温?.2描述制備的） 或?qū)φ眨ɡ鐚τ贗gG測定是脯氨酸），但無抗生素的MEM中，以1，500rpm離心5min，及隨 后于37°C溫育30分鐘。然后將孔在MEM中洗滌5次，經(jīng)胰蛋白酶處理，及將懸浮液定量培 養(yǎng)，以測定附著的細(xì)菌數(shù)。數(shù)據(jù)表示為粘附于上皮細(xì)胞的原接種物的細(xì)菌的比例。各測定 以一式三份進(jìn)行和實施至少3次實驗，導(dǎo)致每研究的條件至少9個數(shù)據(jù)點。由錐蟲藍(lán)排除 及商業(yè)LDH測定（BioChain Institute, Inc.，Hayward, CA)在形態(tài)學(xué)上查明細(xì)胞活力。
[0112] 如顯示于圖12A，肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)R6非常良好地粘附于來源于口底的 H376細(xì)胞。在洗滌之后，多于60%的細(xì)菌仍附著于細(xì)胞。重要的是，添加2mg/ml的IgA F4 足以醒目地阻斷上皮細(xì)胞上肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)R6的附著。大致75%的細(xì)菌可被 預(yù)防粘附于細(xì)胞。增加的IgA劑量顯示，細(xì)菌附著的稍微更多抑制。在圖12B中，測試了 H376上緩癥鏈球菌（S.mitis)的附著。我們發(fā)現(xiàn)，緩癥鏈球菌（S.mitis)以相比肺炎鏈球 菌（S. pneumoniae)R6更少程度結(jié)合于上皮細(xì)胞。但是，IgAF4明顯以5mg/ml的最大效應(yīng) 抑制緩癥鏈球菌（S.mitis)附著。由此，在顯示口腔粘膜炎癥狀的患者的口腔前庭中施用 IgA F4可保護(hù)頰上皮免于條件致病菌病原體定居。
[0113] 【實施例8 :IgA保護(hù)上皮細(xì)胞免于離子化照射誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性】
[0114] 用于治療帶有腫瘤的患者的放射治療靶向增殖細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）。通過產(chǎn)生 DNA斷裂和活性氧，γ-電離輻射通常誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。盡管相信，頰上皮細(xì)胞更耐受放 射，因為它們的低周轉(zhuǎn)，重復(fù)的放射仍可對這些細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。為了研究是否在電離輻 射之后，IgA對細(xì)胞存活具有影響，我們照射了 H376及在24h之后測量了細(xì)胞毒性。
[0115] 如描繪于圖13A，將H376以3X104細(xì)胞/孔（96孔板）接種于ΜΕΜ(80μ 1)中，及 于37°C保持2小時。然后將IgA F4(5或10mg/ml)和/或MEM加入孔，以達(dá)到100μ 1的最 終體積（一式三份）。一天后，將細(xì)胞用4Gy照射，及返回37°C。在輻射之后24h，通過使 用CytoTox-Glo?細(xì)胞毒性測定試劑盒（Promega，G9291)評定細(xì)胞毒性。此試劑盒測量在 細(xì)胞死亡過程期間釋放的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的量。
[0116] 如顯示于圖13B，多于30%的H376在接收電離輻射之后死亡。H376細(xì)胞用IgA F4 的預(yù)防性治療以劑量依賴性方式減少此細(xì)胞毒性。l〇mg/ml的IgA在24h抑制細(xì)胞死亡幾 乎50%，和5mg/ml的IgA抑制幾乎30%。因此，向上皮細(xì)胞添加 IgA提供存活優(yōu)勢，和可 減少重復(fù)的放射對患者上皮的效應(yīng)。
[0117] 【實施例9 :對創(chuàng)傷表皮細(xì)胞再生的有益效應(yīng)】
[0118] 盡管在口腔粘膜炎期間控制細(xì)菌定居和炎性信號具有關(guān)聯(lián)，逐漸明白口腔粘膜炎 癥狀的減小需要在頰上皮潰瘍形成之后快速傷口閉合。KGF在創(chuàng)傷表皮細(xì)胞再生中起到重 要作用。此是為何KGF是目前用于治療口腔粘膜炎的少數(shù)的被許可的藥物之一的原因之 一。為了進(jìn)一步描繪在口腔粘膜炎期間IgA的潛在作用，我們在受傷的上皮上測試IgA。為 了再現(xiàn)放射對細(xì)胞上皮的潛在體外損傷效應(yīng)，我們在劃痕測定中使用它們之前照射了單層 細(xì)胞。
[0119] 用來測試創(chuàng)傷治愈的主要測定是常見的劃痕測定。其由劃單層細(xì)胞及經(jīng)時捕獲圖 像以便測量人工創(chuàng)傷的閉合組成。如顯示于圖14A，我們在MEM(500 μ 1最終體積）中接種? 3Χ 105Η376細(xì)胞/孔（24孔板），和將板于37°C保持2h。然后將免疫球蛋白（例如IgA或 IgG或培養(yǎng)基對照）加入孔，和將板于37°C再放置22小時。在此步驟，將板以2Gy，4Gy照 射，或保持未處理，及返回到37°C。24h后，用P1000端，通過各孔的單層細(xì)胞制造劃痕。為 了防止劃的細(xì)胞落入人工間隔，移出培養(yǎng)基，將單層細(xì)胞用MEM洗滌一次，然后將補(bǔ)充或未 補(bǔ)充免疫球蛋白的MEM加入孔。在不同時間點，使用顯微鏡捕獲像，和測量間隔尺寸。100% 創(chuàng)傷表皮細(xì)胞再生對應(yīng)于人工創(chuàng)傷的全恢復(fù)。
[0120] 以2個劑量（10mg/ml和5mg/ml)測試IgA F4,而以10mg/ml使用IgG。有趣的 是，以穩(wěn)定狀態(tài)，IgA對人工間隔閉合顯示稍微正面效應(yīng)（圖14B)。相反，IgG似乎減慢傷 口閉合。當(dāng)劃照射的單層細(xì)胞時，IgA的作用變得更清楚（圖14C和D)。IgA F4維持照射 的H376細(xì)胞的遷移和分裂，而未處理的照射的細(xì)胞未以相同的速度覆蓋人工間隔。而且， 當(dāng)將細(xì)胞用4Gy照射時，IgA效應(yīng)更強(qiáng)。當(dāng)以2Gy和4Gy照射細(xì)胞時，在上皮細(xì)胞上觀察到 IgG的負(fù)面效應(yīng)（圖14C，D)。
[0121] 【實施例10 :IgA與上皮細(xì)胞的特異性結(jié)合】
[0122] 為了獲得IgA在細(xì)菌刺激和創(chuàng)傷表皮細(xì)胞再生過程中調(diào)控上皮細(xì)胞功能的潛在 機(jī)理的信息，我們分析了底特律562和H376上皮細(xì)胞上IgA受體的細(xì)胞表面表達(dá)。
[0123] 幾種受體已被描述結(jié)合IgA。它們是⑶89,⑶71 (轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）， ASGP-R，F(xiàn)CAMR(Fca/mR，CD351)和 pIgR(CD300e)(Monteiro 等人（2003)六111111.1^￥· Immunol. 21:177-204)。CD89在骨髓樣細(xì)胞上表達(dá)，而ASGP-R，F(xiàn)CAMR和plgR分別存在于 肝細(xì)胞上，B-淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，及腸上皮細(xì)胞上。僅⑶89以高特異性結(jié)合IgA。
[0124] 因為許多細(xì)胞類型需要由轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵攝取，其被轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體（例如 CD71)的結(jié)合驅(qū)動，由此CD71在許多細(xì)胞類型（除了高度分化的細(xì)胞外）上潛在地表達(dá) (Pomka P等人（1999) IJBCB 31,1111-1137)。但是，其水平在細(xì)胞間顯著地改變。至今， CD71 已被顯示結(jié)合單體 IgA 和分泌 IgA (Moura 等人（2001) J. Exp. Med. 194, 4, 417-425)。因 此，其是頰上皮細(xì)胞上IgA的潛在靶。
[0125] 為了控制此受體的表達(dá)，我們于37°C用ACCUTASE(eBioscience)輕輕分開PBS IX-洗滌的H376和底特律562細(xì)胞10分鐘，用1XPBS洗滌它們，及在1XPBS中，在 冰上，使用抗-人CD71(BD Biosciences，克隆A59)抗體將它們?nèi)旧?0分鐘。同種型對 照抗體用于評定背景熒光的水平。將CD89(僅在骨髓樣細(xì)胞上表達(dá)）用作陰性對照（BD Biosciences，克隆M-A712)。在2個洗滌步驟之后，在FACS Canto II流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson)上運行樣品。
[0126] 如顯示于圖15,我們發(fā)現(xiàn)底特律562和H376上皮細(xì)胞明顯表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。相 反，及如預(yù)期，在上皮細(xì)胞上未檢測到⑶89。
[0127] 【實施例11 :IgA F4制備物不與TNFa反應(yīng)】
[0128] 在最近幾年，靶向和/或抑制負(fù)責(zé)發(fā)炎或促進(jìn)腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵蛋白的免疫球蛋白 (例如單克隆抗體）的產(chǎn)生強(qiáng)烈增加。在慢性疾病以及自免疫疾病中，抗-TNFa-特異性抗 體已顯示減緩被治療的患者中的發(fā)炎。
[0129] 如顯示于實施例4(圖10和11)，IgA下調(diào)由上皮細(xì)胞的促-炎性分子產(chǎn)生。為 了排除觀察的IgA的抗-炎性效應(yīng)中抗-TNF活性的涉及，我們測定了我們的多克隆IgA和 IgG制備物中TNFa特異性抗體的水平。
[0130] 于 37°C，在 96_ 孔板（樣品板）（Nunc Maxisorb)中以在 PBS(pH7· 4)中 1 μ g/ ml (50 μ L/孔）包被TNF-α經(jīng)2h。然后將孔用300 μ 1洗滌緩沖劑（IXPBS, 0.05 % (v/ v)吐溫-20)洗漆一次，及于37°C用Smart Block (Candor Bioscience)阻斷2小時。平行 地，制備無包被的TNF-α的結(jié)合對照板（空白板）。洗滌步驟后，將Ig樣品（IgA F4/IgG Privigen/英利昔單抗）稀釋于 LowCrossBuffer (LCB) (Candor Bioscience)。在一些孔中， 添加游離的TNF-α，以抑制抗體結(jié)合。將樣品（1〇〇 μ 1)移液到板中，及于37°C溫育2小時。 溫育后，將孔洗滌3次，和將板于37°C用關(guān)聯(lián)第二抗體（多克隆兔抗-人IgG-HRP(Dak 〇 ; 0. 5yg/ml)或多克隆兔抗-人IgA HRP(Dako;0. 5yg/ml))，在抗體緩沖劑（LCB)中溫育 30分鐘。如之前所述將孔洗滌4次，和隨后用超-敏感TMB (Fitzgerald)顯影。用1M鹽酸 (Merck)停止反應(yīng)，和在 450nm 處由 EnVision Multilabel 讀取器（Perkin Elmer)測量吸 光度。
[0131] 圖16展示，我們的IgG和IgA F4制備物均含有可忽略量的抗-TNFa抗體。以 相當(dāng)?shù)臐舛?，IgA和IgG對TNFa的反應(yīng)性分別是抗-TNFa特異性抗體（英利昔單抗）的 1. 2X 106和1. 1 X 105分之一，由此，IgA免疫抑制活性是不依賴于TNF a的抗-TNF a活性。
【權(quán)利要求】
1. 包含免疫球蛋白的組合物，所述免疫球蛋白用于通過在受試者中局部施用來預(yù)防或 治療食道粘膜炎。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中食道粘膜炎是口腔粘膜炎。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中免疫球蛋白包含IgA或IgM或其組合。
4. 權(quán)利要求3的組合物，其中免疫球蛋白包含含有J鏈的IgA。
5. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中免疫球蛋白可獲自血或其組分。
6. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其也包含分泌組分。
7. 權(quán)利要求6的組合物，其中分泌組分是重組體分泌組分。
8. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中組合物包含分泌-樣IgA。
9. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中組合物包含與另一免疫球蛋白組合的分 泌-樣IgA。
10. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其被配制為提供與受粘膜炎影響的或處于受粘 膜炎影響的風(fēng)險的粘膜區(qū)的長接觸時間。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中制劑選自：霜劑，凝膠，糖漿，膠凍劑，接近受影響的粘 膜溶解的固體形式，或其組合。
12. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中局部施用于粘膜減少一種或更多微生物的 附著和/或侵入。
13. 權(quán)利要求12的組合物，其中微生物是細(xì)菌和/或真菌。
14. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜促進(jìn)粘膜創(chuàng)傷治愈。
15. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中局部應(yīng)用于粘膜發(fā)揮抗-炎性效應(yīng)。
16. 權(quán)利要求15的組合物，其中抗-炎性效應(yīng)是 (a) 抑制促-炎性細(xì)胞因子表達(dá)；和/或 (b) 刺激抗-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。
17. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中受試者是處于發(fā)展食道粘膜炎的風(fēng)險的受 試者諸如經(jīng)歷或即將經(jīng)歷化學(xué)治療和/或放射治療的癌患者。
18. 權(quán)利要求17的組合物，其中處于風(fēng)險的受試者是作為之前化學(xué)治療和/或放射治 療法治療的結(jié)果而發(fā)展粘膜炎的癌患者。
19. 權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的組合物，其中當(dāng)患者的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)開始降低時 開始施用組合物。
20. 權(quán)利要求19的組合物，其中治療在患者的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)在正常以下的時期維 持。
21. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中組合物被施用給受試者達(dá)6次/天。
22. 前述權(quán)利要求之任一項的組合物，其中組合物包含用于治療粘膜炎的另外的有效 齊U，或其中患者也正使用另一劑，諸如防腐漱口水。
【文檔編號】C07K16/12GK104254543SQ201380013092
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月9日
【發(fā)明者】C·艾比, S·C·魯爾, A·紹布, S·梅斯舍爾, A·祖爾舍爾, C·P·沃納爾伯格 申請人:瑞士杰特貝林生物制品有限公司, 伯爾尼大學(xué)