T細(xì)胞的方法和材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了生成CD8+T細(xì)胞的方法和材料，所述CD8+T細(xì)胞能夠識(shí)別表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。例如，提供了在體內(nèi)或體外使用由SLAFLPESFD氨基酸序列組成的多肽來生成CD8+T細(xì)胞的方法和材料，所述CD8+T細(xì)胞能夠識(shí)別并裂解表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。
【專利說明】用于生成能夠識(shí)別表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞的CD8+T細(xì) 胞的方法和材料
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年2月17日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列第61/600, 480號(hào)的權(quán)益。 在先申請(qǐng)的公開內(nèi)容被認(rèn)為是本申請(qǐng)公開的部分（且通過引用納入本文）。
[0003] 背景
[0004] 1.【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及生成⑶8+T細(xì)胞的方法和材料，所述⑶8+T細(xì)胞能夠識(shí)別表達(dá)HER2/neu 多肽的癌細(xì)胞。例如，本發(fā)明涉及在體內(nèi)或體外使用由SLAFLPESFD氨基酸序列組成的多肽 來生成⑶8+T細(xì)胞的方法和材料，所述⑶8+T細(xì)胞能夠識(shí)別表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。
[0006] 2.背景信息
[0007] 癌癥疫苗能夠刺激或恢復(fù)免疫系統(tǒng)，從而對(duì)抗癌癥。在一些情況下，可設(shè)計(jì)癌癥疫 苗以通過加強(qiáng)患者對(duì)癌癥的防御來治療已有癌癥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了生成⑶8+T細(xì)胞的方法和材料，所述⑶8+T細(xì)胞能夠識(shí)別表達(dá)HER2/ neu多肽的癌細(xì)胞。例如，本發(fā)明提供了在體內(nèi)或體外使用由SLAFLPESFD氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)組成的多肽來生成CD8+T細(xì)胞的方法和材料，所述CD8+T細(xì)胞能夠識(shí)別并裂解表 達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。由SLAFLPESFD氨基酸序列組成的多肽可稱作SLAFLPESFD多 肽、P373-382多肽或由SEQ ID NO: 1中所列氨基酸序列組成的多肽。如本文所述，可以將 SLAFLPESFD多肽或包含SLAFLPESFD多肽的疫苗組合物在一定條件下給予癌癥患者，所述 患者帶有表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞，在該條件下，患者產(chǎn)生能夠識(shí)別和裂解這些癌細(xì)胞 的⑶8+T細(xì)胞。在一些情況下，這類⑶8+T細(xì)胞可稱作使用SLAFLPESFD多肽生成的⑶8+T細(xì) 胞。
[0009] 所具有的生成⑶8+T細(xì)胞的能力（所述⑶8+T細(xì)胞能夠識(shí)別并裂解表達(dá)HER2/neu 多肽的癌細(xì)胞）使臨床醫(yī)師能夠向癌癥患者提供額外的有效治療選擇。例如，本發(fā)明提供 的疫苗可單獨(dú)使用或與其他癌癥治療選擇聯(lián)用以向癌癥患者提供有效的CD8+T細(xì)胞群體， 所述⑶8+T細(xì)胞被設(shè)計(jì)用于殺死表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。
[0010] 總的來說，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種多肽（例如純化的多肽），所述多肽的序列 由SEQ ID NO: 1所列氨基酸序列組成。在一些情況下，所述多肽可包括N和/或C末端修 飾。
[0011] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括多肽（例如純 化的多肽）或主要由多肽組成，所述多肽的序列由SEQ ID NO: 1所列氨基酸序列組成。在 一些情況下，所述多肽可包括N和/或C末端修飾。所述組合物可包括佐劑。所述佐劑可 以是油和水的混合物。所述佐劑可以是蒙塔尼ISA-51。所述組合物可包括IL-2、IL-12、 GM-CSF 或林塔托利（rintatolimod)。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種增加 CD8+T細(xì)胞數(shù)目的方法，所述細(xì)胞能夠殺死表 達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。所述方法包括使CD8+T細(xì)胞群體接觸多肽（例如純化的多肽） 或主要由上述步驟組成，所述多肽的序列由SEQ ID NO: 1所列氨基酸序列組成。接觸步驟 可以離體方式進(jìn)行。接觸步驟可以體內(nèi)方式進(jìn)行。
[0013] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在人體內(nèi)增加 CD8+T細(xì)胞數(shù)目的方法，所述細(xì)胞能 夠殺死表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。所述方法包括將疫苗組合物給予人或主要由上述步 驟組成，所述組合物包括多肽（例如純化的多肽）或主要由多肽組成，所述多肽的序列由 SEQ ID NO: 1所列氨基酸序列組成。在一些情況下，所述多肽可包括N和/或C末端修飾。 所述人可包含表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。所述組合物可包括佐劑。所述佐劑可以是油 和水的混合物。所述佐劑可以是蒙塔尼ISA-51。所述組合物可包括IL-2、IL-12、GM-CSF 或林塔托利。所述方法可包括向所述人給予11^-2、11^-12、61^5?、林塔托利或其組合。所 述方法還可包括向所述人給予曲妥珠單抗。
[0014] 除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常所理解的相同。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以采用類似于或等同于本文所 述的那些方法和材料，但下文描述了合適的方法和材料。本文中述及的所有出版物、專利申 請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)都通過引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本說明書（包括定 義在內(nèi)）為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例都僅是說明性的，并不意在構(gòu)成限制。
[0015] 從下文的詳述和所附權(quán)利要求中能夠很容易地了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖IA顯示了通過蛋白酶體或免疫蛋白酶體催化鑒定衍生自HER-2/neu 19聚體多 肽（FAGCKKIFGSLAFLPESFD)的多肽的示例性總離子色譜。
[0017] 圖IB顯示了來自圖IA所述反應(yīng)的示例性提取離子色譜，檢測(cè)了來自19聚體多肽 的 HER-2/neu p369-377 的加工。
[0018] 圖IC顯示了示例性提取離子色譜，表明p373-382(SLAFLPESFD)是通過蛋白酶體 或免疫蛋白酶體催化由HER-2/neu衍生的23聚體（QEFAGCKKIFGSLAFLPESFD⑶）經(jīng)加工得 到的。
[0019] 圖2A顯示了 HER-2/neu多肽p373-382結(jié)合至TAP缺陷的T2細(xì)胞。
[0020] 圖2B顯示了 HER-2/neu多肽p373-382與T2細(xì)胞間劑量依賴的飽和結(jié)合。
[0021] 圖2C顯示了與高親和性流感衍生的HLA-A2結(jié)合多肽GILGFVFTL(p58-66)相比， HER-2/neu多肽p373-382與p369-377的相對(duì)結(jié)合親和性。
[0022] 圖3A顯示了 IFN- γ ELIspot分析，該分析顯示針對(duì)HER-2/neu多肽p373-382生 成的CD 8T細(xì)胞對(duì)加載有p373-382或p369-377的自體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答。
[0023] 圖3B顯示了 IFN- γ ELIspot分析，該分析表明針對(duì)HER-2/neu多肽p373-382生 成的⑶8T細(xì)胞對(duì)表達(dá)HER-2/neu的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答并釋放IFN- γ。
[0024] 圖3C顯示了細(xì)胞毒性T細(xì)胞分析，該分析表明針對(duì)HER-2/neu多肽p373-382生 成的⑶8T細(xì)胞裂解表達(dá)HER-2/neu的腫瘤細(xì)胞。
[0025] 圖4A-B使用IFN- γ ELIspot分析顯示MHC I型封閉抗體阻礙了針對(duì)HER-2/neu多 肽P373-382生成的CD 8T細(xì)胞的IFN- γ應(yīng)答（圖4A :抗HLA-A2 ;和圖4B :抗HLA-ABC)。
[0026] 圖4C-D使用細(xì)胞毒性T細(xì)胞試驗(yàn)顯示MHC I型封閉抗體阻斷了針對(duì)HER-2/neu 多肽P373-382生成的⑶8T細(xì)胞的裂解應(yīng)答（圖4C :抗HLA-A2 ;和圖4D :抗HLA-ABC)。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 本發(fā)明提供了生成⑶8+T細(xì)胞的方法和材料，所述⑶8+T細(xì)胞能夠識(shí)別表達(dá)HER2/ neu多肽的癌細(xì)胞。例如，本發(fā)明提供了在體內(nèi)或體外使用由SEQ IDN0:1中所列氨基酸序 列組成的多肽生成⑶8+T細(xì)胞的方法和材料，所述⑶8+T細(xì)胞能夠識(shí)別并裂解表達(dá)HER2/neu 多肽的癌細(xì)胞。在一些情況下，本發(fā)明提供了 SLAFLPESFD多肽和包含SLAFLPESFD多肽的 疫苗組合物以及使用SLAFLPESFD多肽或包含SLAFLPESFD多肽的疫苗組合物生成⑶8+T細(xì) 胞的方法，所述CD8+T細(xì)胞能夠識(shí)別表達(dá)HER2/neu多肽的癌細(xì)胞。
[0029] 在一些情況下，本發(fā)明所提供的多肽（例如由SEQ ID NO: 1所列氨基酸序列組成 的多肽）可與樹突細(xì)胞聯(lián)用以治療癌癥。例如，可使用與SLAFLPESFD多肽接觸的樹突細(xì)胞 治療癌癥。
[0030] 本發(fā)明提供的SLAFLPESFD多肽可以是基本純的。對(duì)于多肽而言，術(shù)語"基本純"表 示多肽已與其天然狀態(tài)下伴隨的細(xì)胞組分分離。例如，通過合成制備的多肽可以是基本純 的多肽。通常，當(dāng)本發(fā)明提供的多肽是至少6〇重量百分比（例如， 90^^95%或99% )、不含蛋白質(zhì)和天然產(chǎn)生的在天然狀態(tài)下相關(guān)的有機(jī)分子時(shí)，可以認(rèn)為 該多肽是基本純的。一般而言，基本純的多肽可在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上產(chǎn)生單一主 條帶。
[0031] 可使用多種方法制備本發(fā)明提供的SLAFLPESFD多肽。由于其相對(duì)短的尺寸， SLAFLPESFD多肽可根據(jù)已知方法在溶液中或固相自動(dòng)合成器上合成。參見例如Stewart和 Young, Solid Phase Polypeptide Synthesis (《固相多肽合成》），第2版,皮爾期1化學(xué)公 司（Pierce Chemical Co. )(1984) ;Tam 等，J. Am. Chem. Soc, 105:6442 (1983) ;Merrifield， The Polypeptides (《多膚》），Gross 和 Meienhofer 編，學(xué)術(shù)出版社（academic Press)，紐 約，第1-284頁（1979)。在一些情況下，本發(fā)明提供的多肽（例如SLAFLPESFD多肽）可使 用氨基化合物（如NH2)或游離酸（如C00H) C末端合成，兩者均能夠結(jié)合HLA-A2。
[0032] 在一些情況下，可以使用重組DNA技術(shù)，其中將編碼本發(fā)明提供的SLAFLPESFD多 肽的核酸序列插入表達(dá)載體中，將其（如通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，并在適于 表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些方法通常是本領(lǐng)域已知的，通常參見例如Sambrook等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》），冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（Cold Spring Harbor Press)，冷泉港，紐約（I982)，以及 Ausubel 等（編），Current Protocols in MolecularBiology (《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》），約翰韋利森出版公司（John Wiley and Sons, Inc.)，紐約（1987)，以及例如美國專利號(hào) 4, 237, 224 ;4, 273,875 ;4, 431，739 ; 4, 363, 877 ;和 4, 428, 941。
[0033] 本發(fā)明還提供了由表1所列氨基酸序列之一組成的多肽（例如基本純的多肽）。 這類多肽可以與本文所述SLAFLPESFD多肽相同的方式制備和使用。
[0034] 在一些情況下，本發(fā)明提供的多肽可與⑶8+T細(xì)胞群體孵育以生成⑶8+T細(xì)胞的活 化庫，所述⑶8+T細(xì)胞能夠識(shí)別p373-382或HER2/neu多肽。例如，本發(fā)明提供的一種或多 種多肽（例如SLAFLPESFD多肽）可以離體方式使用以制備可用于治療癌癥的抗原特異性 CD8+T細(xì)胞。在一些情況下，本發(fā)明提供的多肽可用于生成能夠單獨(dú)使用的活化HER2/neu多 肽特異性CD8+T細(xì)胞庫，或與單克隆抗體療法、CTL療法或者單克隆抗體療法和CTL療法聯(lián) 用以治療癌癥。例如，抗HER-2/neu單克隆抗體療法可與使用p373-382多肽生成的⑶8+T 細(xì)胞的輸注聯(lián)用以治療癌癥（例如乳腺癌）。在一些情況下，賀賽?。ㄇ字閱慰梗┋煼?與使用Ρ373-382多肽生成的CD8+T細(xì)胞的輸注聯(lián)用以治療癌癥（例如乳腺癌）。
[0035] 本發(fā)明還提供了包含免疫原性有效量的一種或多種本發(fā)明提供的多肽的疫苗組 合物。本發(fā)明提供的疫苗組合物可用作預(yù)防性或治療性疫苗?？墒褂萌我夂线m的技術(shù)給 予和制備本發(fā)明提供的疫苗組合物，所述技術(shù)包括但不限于他處所述的那些技術(shù)（參見例 如，美國專利申請(qǐng)
【發(fā)明者】K·L·納特森, A·M·漢努 申請(qǐng)人:梅約醫(yī)學(xué)教育與研究基金會(huì)