三環(huán)核苷及由其制備的低聚化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供新的三環(huán)核苷及由其制備的低聚化合物。預(yù)期將一個(gè)或多個(gè)三環(huán)核苷結(jié)合到低聚化合物中增強(qiáng)了低聚化合物的一種或多種性質(zhì)。這樣的低聚化合物也可以包括在雙鏈組合物中。在某些實(shí)施方案中，預(yù)期本文提供的低聚化合物與靶RNA的一部分雜交，導(dǎo)致靶RNA喪失正常功能。
【專利說明】三環(huán)核苷及由其制備的低聚化合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通式I描述的烷基-取代的三環(huán)核苷及由其制備的低聚化合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 反義技術(shù)是一種降低特定基因產(chǎn)物表達(dá)的有效方法，且因此可用于治療、診斷和 研究應(yīng)用。通常，反義技術(shù)的原理為：反義化合物（寡核苷酸或其類似物的序列）與靶核酸 雜交，并調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性或功能，比如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。不論特定機(jī)制如何，其序列特異 性使反義化合物作為靶標(biāo)驗(yàn)證和基因功能化的工具，以及作為選擇性地調(diào)節(jié)涉及疾病發(fā)病 機(jī)理的基因表達(dá)的治療劑受:到關(guān)注。
[0004] 化學(xué)修飾的核苷通常摻入到反義化合物中以增強(qiáng)其性質(zhì)，比如核酸酶抗性、藥代 動(dòng)力學(xué)或?qū)Π蠷NA的親和性。
[0005] 化學(xué)修飾已改善了反義化合物的效力和功效，從而提高了他們口服遞送或皮下給 藥的可能性，或降低了他們導(dǎo)致副作用的可能性。增強(qiáng)反義化合物效力的化學(xué)修飾允許以 較低劑量給藥，其降低了毒性的可能性。增強(qiáng)降解抗性的修飾導(dǎo)致從體內(nèi)清除減慢，允許低 頻率給藥。
[0006] 三環(huán)核苷的合成（Steffens 等，Helvetica Chimica Acta，1997,80, 2426-2439)及 其摻入到低聚化合物已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了報(bào)道（Steffens等，J. Am. Chem. Soc.，1997,119, IlM8-IlM9 ;Steffens 等，J.Am.Chem.Soc.，l"9，m，3249-3255 ;Renneberg 等，J.Am. Chem. Soc.，2002,124, 5993-6002 ;Scheidegger 等，Chem. Eur. J.，2006,12, 8014-8023)。 完全修飾的三環(huán)寡核苷酸與未修飾的寡脫氧核苷酸相比顯示在抵抗胎牛血清中溶核降解 (nucleolytic degradation)方面更穩(wěn)定，并且在細(xì)胞分析中產(chǎn)生生物學(xué)反義作用，比如突 變 ￠-球蛋白的剪接修復(fù)（Renneberg 等，Nucleic Acids Res. 2002,30,2751_2757);或親 環(huán)素 A 中的外顯子跳讀（exon skipping) (Ittig 等，Nucleic Acids Research，2004, 32， 346-353)。
[0007] 發(fā)明簡述
[0008] 本文提供具有式I的三環(huán)核苷和由其制備的低聚化合物。更特別地，具有式I的三 環(huán)核苷用于在低聚化合物的一個(gè)或多個(gè)位置摻入。在某些實(shí)施方案中，本文提供的低聚化 合物的特征在于一種或多種增強(qiáng)的性質(zhì)，比如核酸酶穩(wěn)定性、細(xì)胞滲透性、生物利用度或毒 性。在某些實(shí)施方案中，如本文提供的低聚化合物與靶RNA的一部分雜交，導(dǎo)致靶RNA喪失 正常功能。本文提供的低聚化合物也用作診斷應(yīng)用中的引物和探針。在某些實(shí)施方案中， 本文提供的包含三環(huán)核苷的低聚物顯著地改善了一與未修飾的DNA或RNA低聚物相比一細(xì) 胞攝取而不依賴于轉(zhuǎn)染試劑比如脂質(zhì)體。在某些實(shí)施方案中，本文提供的包含三環(huán)核苷的 低聚物顯示顯著提高的熱穩(wěn)定性（雙鏈體解鏈溫度）一與未修飾的DNA或RNA低聚物相比。
[0009] 變量單獨(dú)地在本文中更詳細(xì)地定義。應(yīng)當(dāng)理解，本文提供的具有式I的三環(huán)核苷 和低聚化合物包括所公開實(shí)施方案和本文定義的變量的所有組合。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供由通式I描述的三環(huán)核苷：
[0011]
【權(quán)利要求】
1. 通式I所述的三環(huán)核苷： 其中：
-Bx為雜環(huán)堿基部分； -T1和T2中一個(gè)為羥基（-0H)或保護(hù)的羥基，且T1和T2中另一個(gè)為磷酸酯或反應(yīng)性磷 基團(tuán)； -q1和q2各自獨(dú)立地為H、F或Cl， -q3、q4和q5的至少一個(gè)獨(dú)立地為通式-A1-Xh-A2-Yn描述的基團(tuán)，其中： -A1為Ck -烷基、Ck -鏈烯基或Ck-炔基，k為選自O(shè)至20范圍的整數(shù)， -Xh 為-C( = 0)-、-C( = 0)0-、-C( = 0)NR-、-0-、-S-、-NR-、-C( = 0)R、-C( = 0)OR、-C( = 0)NR2-、-OR、-SR或-NR2，每個(gè)R獨(dú)立地選自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙?；?2-輕乙基,且h為0或1, -A2為Ci-烷基、Ci-鏈烯基或Ci-炔基，i為選自0至20范圍的整數(shù)， -Y為連接到A1和/或A2上任一個(gè)碳原子的取代基，選自-F、-Cl、-Br、= 0、 -0R、-SR、-NR2、-NR3+、NHC( =NH)NH2、-CN、-NC、-NC0、-NCS、-SCN、-C0R、-C02R、C0NR2、-R， 每個(gè)R獨(dú)立地選自Η、甲基、乙基、丙基、丁基、乙?；?-羥乙基，且η為0、1、2、3、4、5或 6， -其中k+i等于至少1， -q3、q4和q5的其它基團(tuán)獨(dú)立地為H、F或C1， -Z1 和Z2 中一個(gè)為H，且Z1 和Z2 中另一個(gè)為H、-0H、F、C1、0CH3、0CF3、0CH2CH3、0CH2CF3、OCH2-CH=CH2,O(CH2)2-OCH3^O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2^OCH2C( = 0)-N(H)CH3>OCH2C(= 0)-N(H) - (CH2)2-N(CH3) 2 或OCH2-N(H)-C( =NH)NH2。
2. 權(quán)利要求1的三環(huán)核苷，其中Bx為尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌 呤或鳥嘌呤。
3. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中T1為羥基或保護(hù)的羥基，并且其中T2為選 自H-膦酸酯或亞磷酰胺的反應(yīng)性磷基團(tuán)。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中T1為4, 4' -二甲氧三苯甲基，且T2為二異 丙基氰基乙氧基亞磷酰胺或受控多孔玻璃表面。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中q3為通式-A1Xh-A2-Yn所描述，且q4和q5 彼此獨(dú)立地為H、F或Cl。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中k為3至16的整數(shù)，h為0，i為0,且η為 1、 2 或 3。
7. 前述權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中k為I，h為I，X為-0-、C00-、C0NH-或 C0NR-，i為3至16的整數(shù)，且η為1、2或3。
8. 前述權(quán)利要求6至7中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中η為1且Y選自NH2、NHR、NR2、NR3+ 和NHC( =NH)NH2，R具有上述定義的含義。
9. 權(quán)利要求8的三環(huán)核苷，其中Y處于ω-位。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中i+k的和為3至16的整數(shù)，特別是3至 12,更特別地5至10。
11. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷，其中A1為CH2，h為I，Xh為-C( = 0)O-，-C(= 〇)NH-，A2為C2至C16烷基，Yn為NH2，且η為0或1。
12. 權(quán)利要求1的三環(huán)核苷，其中A1為CH2。
13. 權(quán)利要求1的三環(huán)核苷，其中k為0。
14. 三環(huán)核苷，誅白
其中Bx選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤。
15. 低聚化合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至0中任一項(xiàng)的至少一種三環(huán)核苷，其中所述 低聚化合物包含8至40個(gè)單體亞單元。
16. 權(quán)利要求15的低聚化合物，其中每個(gè)Bx獨(dú)立地為尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲 基胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。
17. 權(quán)利要求15至16中任一項(xiàng)的低聚化合物，其中每個(gè)核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地為磷酸 二酯核苷間連接基團(tuán)或硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。
18. 權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的低聚化合物，其包含第一區(qū)域，該第一區(qū)域具有至少 兩個(gè)連續(xù)的式II的三環(huán)核苷。
19. 權(quán)利要求18的低聚化合物，其包含具有至少兩個(gè)連續(xù)的單體亞單元的第二區(qū)域， 其中第二區(qū)域中的每個(gè)單體亞單元為不同于所述第一區(qū)域的式II三環(huán)核苷的修飾核苷。
20. 權(quán)利要求19的低聚化合物，其進(jìn)一步包含位于所述第一和第二區(qū)域之間的第三區(qū) 域，其中所述第三區(qū)域中的每個(gè)單體亞單元獨(dú)立地為不同于第一區(qū)域的各個(gè)式II三環(huán)核 苷和第二區(qū)域的各個(gè)單體亞單元的核苷或修飾核苷。
21. 權(quán)利要求15至20中任一項(xiàng)的低聚化合物，其包含具有6至14個(gè)連續(xù)單體亞單元 的內(nèi)部區(qū)域、所述內(nèi)部區(qū)域在每側(cè)側(cè)接1至5個(gè)連續(xù)單體亞單元的外部區(qū)域的帶間隙的低 聚化合物，其中每個(gè)外部區(qū)域的每個(gè)單體亞單元為式II的三環(huán)核苷，并且內(nèi)部區(qū)域中的每 個(gè)單體亞單元獨(dú)立地為核苷或修飾核苷。
22. 權(quán)利要求15至21中任一項(xiàng)的低聚化合物，其包含一個(gè)或幾個(gè)選自以下的核苷酸嵌 段：
其中T3和T4具有上述給出的含義。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至0中任一項(xiàng)的三環(huán)核苷用于寡核苷酸固相合成方法中的用途。
【文檔編號】C07H19/06GK104321334SQ201380025398
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月15日
【發(fā)明者】C·勒曼, B·杜戈維施, J·萊塔德 申請人:伯爾尼大學(xué)