重組微生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物，其被遺傳修飾以i)通過發(fā)酵碳源合成烴單體，和ii)使至少由其能夠合成的烴單體構(gòu)成的聚合物解聚。本發(fā)明還涉及使用這種類型的遺傳修飾的微生物來生產(chǎn)烴單體的方法，以及這種微生物與能夠合成關(guān)注的聚合物的另一種微生物的共培養(yǎng)物。
【專利說明】重組微生物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)在聚合物合成中使用的烴單體的重組微生物。更準(zhǔn)確地，本 發(fā)明涉及這樣的微生物，其已被遺傳修飾以生產(chǎn)以從碳源，而且通過培養(yǎng)基中存在的聚合 物的解聚生產(chǎn)這種類型的單體。本發(fā)明還涉及使用這種類型的重組微生物用于生產(chǎn)單體的 方法，以及從所生產(chǎn)的單體合成聚合物的方法。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 聚合物用于大量【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是以塑料材料的形式，從食品包裝至醫(yī)藥領(lǐng)域，經(jīng) 由服裝、汽車工業(yè)等。作為一個實例，聚酰胺，并且更具體地尼龍被用于制造鞋子的鞋底并 且為用于手術(shù)縫合的微絲形式。類似地，某些聚酯（例如，聚對苯二甲酸乙二醇酯-PET，聚 乳酸-PLA等）被用于制造衣服和包裝，而且為用于制造汽車或其他部件的熱固性樹脂的 形式。
[0003] 直至最近，用于大部分工業(yè)中的聚合物才獲自不可再生化石能源如油。然而，與循 環(huán)這樣的聚合物材料相關(guān)的困難和不可再生化石能源的日益增加的缺乏使得利用它們更 成問題。
[0004] 因此，多年來，從可再生原料或從生物質(zhì)制造聚合物已處于開發(fā)中。例如，聚乳酸 (PLA)是從乳酸生產(chǎn)的生物可降解聚合物，其具有可與獲自石油化學(xué)工業(yè)的聚合物相當(dāng)?shù)?機(jī)械性能。微生物已被分離和/或開發(fā)，因其從適合可再生碳源生產(chǎn)烴單體和/或聚合物 的能力。
[0005] 作為實例，各種微生物已被開發(fā)以從碳源如淀粉、戊糖等生產(chǎn)乳酸。尤其是，表達(dá) 乳酸脫氫酶的重組酵母菌已被生產(chǎn)以在恰當(dāng)培養(yǎng)基中合成乳酸（W003102152)。
[0006] 類似地，酵母菌已被遺傳修飾以表達(dá)富馬酸還原酶以及從富馬酸生產(chǎn)琥珀酸 (W02009065778) 〇
[0007] 通常，這樣的微生物（重組的或其他形式的）必須在包含昂貴基質(zhì)（葡萄糖、蔗糖 等）的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了改善這樣的微生物的生產(chǎn)性能，還必需優(yōu)化培養(yǎng)條件（溫 度，攪拌，碳源的性質(zhì)等），這趨于進(jìn)一步增加生產(chǎn)成本。
[0008] 為了降低生產(chǎn)成本，已嘗試從不能直接升級的生物質(zhì)如甜菜汁 (W02008000699)、麥汁（Boudjelal et al. - Rev.Energ. Ren, :Production et Valorisation-Biomasse [Biomass - Production and Upgrading] (2001) 41-46)等直接生 產(chǎn)這些代謝物。然而，生物質(zhì)促進(jìn)其中的微生物生長的預(yù)處理復(fù)雜并且冗長，這意味著生產(chǎn) 成本不可能以滿意方式降低。
[0009] 而且，通過微生物生產(chǎn)的烴單體的量在困難的情況下僅超過30g/升，即使在最佳 培養(yǎng)條件下。
[0010] 另外，通過微生物生產(chǎn)的烴單體和/或相關(guān)聚合物的量仍然較低并且相關(guān)成本對 其成為用于聚乙烯（PE)和其他石油化學(xué)聚合物的實際替代方案來說太高。盡管從可再生 源生產(chǎn)聚合物的想法有吸引力，但是目前沒有用于通過發(fā)酵生產(chǎn)的系統(tǒng)，其克服成本和/ 或收率的問題并且其可以滿意地響應(yīng)于需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是通過提供能夠生產(chǎn)在聚合物合成中使用的大量烴單體的重組微 生物至少部分地克服所述問題中的至少一個。
[0012] 為此，本發(fā)明提供一種微生物，尤其是細(xì)菌、酵母菌或真菌，其被遺傳修飾以能夠 通過碳源發(fā)酵而合成一種或多種單體并且同時或其他地使培養(yǎng)基中存在的聚合物解聚以 釋放組成其的單體。通過該相同微生物由此產(chǎn)生的單體來源于兩種不同且獨(dú)立的來源。此 夕卜，這種類型的本發(fā)明微生物的使用意味著聚合物可以循環(huán)，并且因此塑料廢物聚集的問 題可以被克服。事實上，能夠通過本發(fā)明微生物解聚的聚合物可以被整合到制造自塑料材 料的產(chǎn)物而且也可以在培養(yǎng)基中以溶液或其他方式直接可用。有利地，本發(fā)明的微生物能 夠?qū)⒏叻肿恿烤酆衔锊粌H解聚成具有低分子量的低聚物，而且直接解聚成前段或單體。
[0013] 因此，本發(fā)明涉及一種微生物，其被遺傳修飾以
[0014] i)通過碳源發(fā)酵而合成烴單體，和
[0015] ii)使至少由其能夠合成的烴單體構(gòu)成的聚合物解聚。
[0016] 本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)烴單體的方法，包括以下步驟：
[0017] -使根據(jù)本發(fā)明的微生物與碳源并且與能夠由所述微生物解聚的聚合物接觸，和 任選地
[0018] -回收所產(chǎn)生的烴單體。
[0019] 本發(fā)明還設(shè)計了微生物的共培養(yǎng)物，其包含根據(jù)本發(fā)明的至少第一微生物和至少 第二微生物，任選地被遺傳修飾，其能夠合成至少由通過所述第一微生物產(chǎn)生的單體構(gòu)成 的聚合物。
[0020] 本發(fā)明還涉及一種使用根據(jù)本發(fā)明的微生物的共培養(yǎng)物的用于合成聚合物的方 法，包括以下步驟：
[0021] -使微生物的共培養(yǎng)物與碳源并且與能夠通過第一微生物降解的聚合物接觸，和 任選地
[0022] -回收通過第二微生物產(chǎn)生的聚合物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1 :在四種濃度水平的蛋白酶K存在下PLA至乳酸的降解（+ 125夂_2_58/" 3 75夂 ? 5g/L) 〇
[0024] 圖2 :乳酸桿菌（L. lactis) IL 1403在沒有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和 3. 75g/L的蛋白酶K( )或具有20g/L的PLA(a)的CDM中的生長速率（A)和生物質(zhì)（B) 的變化。
[0025] 圖3 :乳酸桿菌IL 1403在沒有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和3. 75g/L的 蛋白酶K( )或具有20g/L的PLA(a)的CDM中的葡萄糖的濃度（A)和特定葡萄糖消耗速 率⑶的變化。
[0026] 圖4 :乳酸桿菌IL 1403在沒有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和3. 5g/L的蛋 白酶K( )或具有20g/L的PLA( A)的CDM中的乳酸鹽（A)的濃度的變化以及在沒有PLA 的條件和具有PLA的條件之間的乳酸鹽差（B)的計算。
[0027] 圖5 :乳酸桿菌IL 1403在沒有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和3. 75g/L的 蛋白酶K( )或具有20g/L的PLA( ▲)的⑶M中的乳酸鹽的特定生產(chǎn)速率的變化。

【具體實施方式】
[0028] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"微生物"是指任何單細(xì)胞真核有機(jī)體如酵母菌、微藻 和真菌，或原核有機(jī)體如細(xì)菌。
[0029] 優(yōu)選地，所述微生物是來自選自以下的屬的微生物：曲霉屬（Aspergillus),貪 銅菌屬（Cupriavidus),梭菌屬（Clostridium),棒狀桿菌屬（Corynebacterium),埃希氏 菌屬（Escherichia),假單胞菌屬（Pseudomonas),子囊菌酵母屬（Yarrowia),氣單胞菌 屬（Aeromonas),念珠菌屬（Candida),伯霍爾德桿菌屬（Burkholderia) ,Thermobifida, 鐮刀菌屬（Fusarium),畢赤氏酵母（Pichia),酵母菌屬（Saccharomyces)和芽孢桿菌 屬（Bacillus)。優(yōu)選地，所述微生物選自黑曲霉菌（Aspergillus Niger),鉤蟲貪銅 菌（Cupriavidus necator),丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum),谷氨酸 棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum),大腸桿菌（Escherichia coli),銅綠假單 胞菌（Pseudomonas aeruginosa),惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida),蟲媒假單胞 菌（Pseudomonas entomophila),食油假單胞菌（Pseudomonas oleovorans),解脂子囊 菌酵母（Yarrowia Iipolytica),嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila),熱帶念珠菌 (Candida tropicalis)，南極假絲酵母（Candida antartica)，Burkholderia xenovorans， 鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei),類鼻疽伯霍爾德桿菌（Burkholderia pseudomallei)，嗜高溫放線菌（Thermobifida fusca),爺病鎌刀菌（Fusarium solani), 畢赤酵母（Pichia pastoris),釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae),枯草桿菌 (Bacillus subtilis)和巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium) 〇
[0030] 術(shù)語"遺傳修飾的"微生物是指所述微生物的基因組已以以下方式被修飾，即所述 微生物表現(xiàn)出合成和解聚的兩種路徑。作為實例，所述微生物可以是天然能夠由碳源合成 關(guān)注的單體并且被遺傳修飾以表達(dá)對于所期望的解聚所需的一種酶或多種酶，反之亦然。 所述微生物也可以不是天然表現(xiàn)出所期望的合成和解聚路徑中的任一個，并且被遺傳修飾 用于這兩種路徑。所述微生物也可以天然地具有這些路徑中的一個和/或另一個，并且被 遺傳修飾以促進(jìn)和/或增強(qiáng)所涉及基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，微生物的基因組被修飾以整 合編碼在用于生物合成烴單體的路徑中和/或在聚合物的解聚中涉及的至少一種酶，或編 碼其生物學(xué)活性片段的至少一個核酸序列。所述核酸序列可以使用任何合適的分子克隆方 法已被引入到所述微生物或其原種之一的基因組中。在本發(fā)明的上下文中，"微生物的基因 組"是指在所述微生物中含有的所有遺傳物質(zhì)，包括例如在質(zhì)粒、游離體（印isome)、合成的 染色體等中所含有的染色體外遺傳物質(zhì)。所引入的核酸序列可以是異源序列，即它不以天 然狀態(tài)存在于所述微生物中，或者同源序列。有利地，轉(zhuǎn)錄單位被引入到包含微生物的基因 組中，其包含關(guān)注的核酸序列，在一個或多個啟動子的控制下放置。
[0031] 由本發(fā)明的微生物利用的碳源優(yōu)選包括精制糖如葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖等， 而且植物或動物起源的任何有機(jī)物質(zhì)，或生物質(zhì)，其能夠通過所述微生物降解以產(chǎn)生可發(fā) 酵糖。因此，碳源可以包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)纖維素等，生物質(zhì)例如糖蜜和/或蔗渣， 制糖廢水或廢液，糖結(jié)晶母液等。所述碳源也可以包括甘油或油（甘油三酯）。在所有情況 下，碳源不包括通過解聚本發(fā)明的聚合物所產(chǎn)生的單體。
[0032] 本發(fā)明的同時發(fā)酵和解聚特性由以下事實定義，即在相同生理-化學(xué)條件（例如， 溫度、PH和/或培養(yǎng)基）下，使微生物同時（或在極短時間內(nèi)，例如最多約15分鐘內(nèi)）與 碳源并且與聚合物接觸。因此，由所述兩種路徑（發(fā)酵和解聚）產(chǎn)生的烴單體可以在培養(yǎng) 基中同時回收。
[0033] 術(shù)語"烴單體"是指基本上由碳原子和氫構(gòu)成的脂肪族或芳香族單體。其通常包 含1至8個碳原子，優(yōu)選2至6個碳原子。烴單體也可以包含至少一個雜原子如氮或氧，通 常以酸、醇、胺官能等的形式。
[0034] 本發(fā)明的烴單體可以尤其是為二羧酸或其衍生物之一如酸二酐，二醇，羥基酸如 α -羥基酸，二酯、內(nèi)酯、環(huán)狀二酯（乙交酯，丙交酯等），二胺或羥胺。
[0035] 這些單體的非限制性例舉由以下構(gòu)成：乳酸，乙醇酸，3-羥基丁酸，4-羥基戊酸， 丁二醇，丙二醇，乙二醇，琥珀酸，戊二酸，己二酸，對苯二甲酸，呋喃二甲酸，己內(nèi)酯，己內(nèi)酰 胺，腐胺，尸胺、己二胺，酯，酯酰胺等。
[0036] 術(shù)語"低聚物"是指包含多于一種單體，并且比供給微生物的聚合物更少的單體的 一系列根據(jù)本發(fā)明的單體。
[0037] 能夠通過本發(fā)明的微生物解聚的聚合物是主鏈基本上由碳原子構(gòu)成的聚合物，并 且尤其是聚酯和/或聚酰胺。本發(fā)明的聚合物可以是均聚物或共聚物，其可以是支化的。 聚酯可以是脂肪族和/或芳香族的?？梢粤信e的脂肪族的實例是聚乳酸（PLA)，聚羥基鏈 烷酸酯（PHA)，聚（琥珀酸丁二醇酯）（PBS)，聚（琥珀酸-共-己二酸丁二醇酯）（PBSA)或 聚-β-己內(nèi)酯（PCAPA)。可以特別例舉的脂肪族聚酯是聚（對苯二甲酸乙二醇酯）（ΡΕΤ)， 聚（三亞甲基對苯二甲酸乙二醇酯）（PTT)，聚（對苯二甲酸丁二醇酯）（PBT)或聚（己二酸 酯對苯二甲酸酯丁二醇酯）（PBAT)?？梢蕴貏e例舉的聚酰胺包括聚（己內(nèi)酰胺）或尼龍-6 ; 聚（i^一酰胺）或尼龍-11 ;聚（己二胺-己二酸酯）或尼龍_6, 6。
[0038] 本發(fā)明特別設(shè)計了脂肪族聚酯的解聚和所述聚酯的所有或部分的酯化中間體酸 和/或醇的合成，如，例如，聚乳酸（PLA)的解聚和乳酸的合成；聚（3-羥基丁酸酯）（PHB) 的解聚和3-羥基丁酸的合成；聚（3-羥基丁酸酯-共-4-羥基戊酸酯）（PHBV)的解聚和 3_羥基丁酸和/或4-羥基戊酸的合成；聚（琥珀酸丁二醇酯）（PBS)的解聚和1，4- 丁二 醇和/或琥珀酸的合成；聚（琥珀酸酯-共-己二酸丁二醇酯）（PBSA)的解聚和1，4- 丁二 醇和/或琥珀酸和/或己二酸的合成。
[0039] 本發(fā)明還設(shè)計了芳香族聚酯的解聚和所有或部分的相關(guān)單體的合成，如，例如，聚 (對苯二甲酸乙二醇酯）（PET)的解聚和乙二醇和/或?qū)Ρ蕉姿岬暮铣?；聚（三亞甲基?苯二甲酸乙二醇酯）（PTT)的解聚和1，3-丙二醇和/或?qū)Ρ蕉姿岬暮铣?；聚（對苯二?酸丁二醇酯）（PBT)的解聚和1，4- 丁二醇和/或?qū)Ρ蕉姿岬暮铣?；聚（己二酸對苯二?酸丁二醇酯）的解聚和1，4- 丁二醇和/或己二酸和/或?qū)Ρ蕉姿岬暮铣伞?br> [0040] 本發(fā)明還設(shè)計了聚酰胺的解聚和所有或部分的相關(guān)單體的合成，如，例如，聚（己 內(nèi)酰胺）或尼龍-6的解聚和己內(nèi)酰胺或6-氨基-己酸的合成；聚^一酰胺）或尼龍-11 的解聚和i^一酰胺的合成；聚（己二胺-己二酸）或尼龍_6, 6的解聚和己二胺和/或己二 酸的合成。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明，相同的微生物能夠合成至少一種烴單體并且能夠解聚至少由相同單 體構(gòu)成的聚合物。根據(jù)本發(fā)明，所述微生物能夠以從其回收關(guān)注的單體的方式解聚所述聚 合物。在其中聚合物包含其他單體的情況下，所述聚合物可以僅被部分地解聚以釋放關(guān)注 的單體，其他單體可以可能地以低聚物的形式在最終解聚形式中。
[0042] 在本發(fā)明的特別實施方式中，微生物也被遺傳修飾以減弱用于其能夠合成的烴單 體降解的至少一種路徑。
[0043] 事實上，在一些情況下，本發(fā)明的微生物可以天然地能夠利用其合成的單體作為 用于其生長的碳源。然而，這些單體可以是特別工業(yè)上感興趣的，特別是用于隨后的聚合物 合成，并且它可以有利地防止它們的降解。為此，根據(jù)本發(fā)明，使用適當(dāng)?shù)闹亟M/缺失方法， 可以缺失編碼在關(guān)注的單體的降解中涉及的一種酶或多種酶的所有或部分基因。還可以減 弱在關(guān)注的單體的降解中涉及的所有或一部分基因的表達(dá)。為此，例如，可以引入一個或多 個編碼調(diào)控子如轉(zhuǎn)錄因子、RNA、siRNA等的核酸序列，其能夠減弱這些基因的表達(dá)。類似地， 可以修飾在關(guān)注的單體的降解中涉及的基因的至少一個的啟動子序列，以減弱/防止其中 的轉(zhuǎn)錄。
[0044] 為了防止合成的單體降解，還可能的是，代替或作為上述遺傳修飾的補(bǔ)充，定期地 使用于微生物的培養(yǎng)基富含可以易于由所述微生物吸收的基質(zhì)，以使其優(yōu)先利用那些基質(zhì) 而不是所合成的單體。
[0045] 本發(fā)明的微生物還可以被遺傳修飾以能夠合成完全或部分由其能夠合成的單體 構(gòu)成的聚合物。作為實例，微生物可以被遺傳修飾以整合和表達(dá)編碼特定聚合物合成酶的 核酸序列。因此，相同的微生物，依據(jù)本發(fā)明，可以在要循環(huán)/降解的聚合物的發(fā)酵和靶向 解聚的輔助下生產(chǎn)單體。在其中關(guān)注的聚合物是雜聚合物的情況下，可以使培養(yǎng)基富含所 述聚合物的其他一種組成單體或多種組成單體。
[0046] 特別地，本發(fā)明設(shè)計了脂肪族聚酯如聚乳酸（PLA)、聚羥基鏈烷酸酯（PHA)等的解 聚和所有或部分相關(guān)單體的合成。
[0047] 因此，在第一實施方式中，本發(fā)明的微生物被遺傳修飾以解聚PLA并因此獲得乳 酸，并且伴隨地由碳源合成乳酸。
[0048] 解聚PLA的酶有利地選自絲氨酸蛋白酶、脂肪酶和PLA解聚酶。優(yōu)選地，用于解 聚PLA的酶選自白色念球菌（Tritirachium album)的蛋白酶K、來自黑曲霉（Aspergillus niger)的脂肪酶、來自皺裙念珠菌（Candida rugosa)的脂肪酶AY、來自稻根霉菌 (Rhizopus oryzae)的脂肪酶F、來自伯克霍爾德菌屬（Burkholderia sp.)的脂肪酶PS或 來自隱球菌屬（Cryptococcus sp.)的S-2珠的脂肪酶角質(zhì)酶樣酶。類似地，用于合成乳酸 的酶有利地是乳酸脫氫酶。在一個特別實例中，微生物是乳酸微生物，例如，乳酸菌，天然分 泌乳酸脫氫酶，即處于野生狀態(tài)。
[0049] 本發(fā)明還提供一種用于生產(chǎn)烴單體的方法，包括以下步驟：
[0050] -使根據(jù)本發(fā)明的微生物與碳源并且與能夠通過所述微生物解聚的聚合物接觸， 和任選地
[0051] -回收所產(chǎn)生的烴單體。
[0052] 通過發(fā)酵和通過解聚生產(chǎn)的烴單體有利地存在于培養(yǎng)基中。然后可以使用任何已 知技術(shù)處理富含這些單體的培養(yǎng)基，以分離它們和/或純化它們。.
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，可以生產(chǎn)所有種類的單體，簡單地通過改變所使用的微生物和所引 入的遺傳修飾。微生物的選擇以及要提供的遺傳修飾依照本申請的教導(dǎo)在本領(lǐng)域技術(shù)人員 能力范圍內(nèi)。
[0054] 用于使微生物與碳源和聚合物接觸的條件，如溫度、pH等可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員 改變以優(yōu)化或有利于通過聚合物解聚生產(chǎn)單體和通過由碳源開始的發(fā)酵生產(chǎn)單體。
[0055] 本發(fā)明還提出至少兩種微生物的共培養(yǎng)物，例如在發(fā)酵罐中，其中的一種是本發(fā) 明的遺傳修飾的微生物，第二種微生物本身能夠合成由至少通過本發(fā)明的微生物生產(chǎn)的單 體構(gòu)成的聚合物。
[0056] 因此，通過本發(fā)明的微生物生產(chǎn)和培養(yǎng)基中分泌的單體由第二種微生物使用來生 產(chǎn)關(guān)注的聚合物，其然后可以在任何類型的工業(yè)中被利用。本發(fā)明的方法因此可以用來徹 底循環(huán)聚合物，從它們解聚成可以再次使用的單體，至它們以可以以用于新應(yīng)用的塑料形 式使用的新聚合物形式再利用。
[0057] 因此，例如，本發(fā)明的微生物是遺傳修飾的乳酸菌，其表達(dá)至少一種乳酸脫氫酶和 至少一種能夠解聚PLA的選自PLA解聚酶、蛋白酶和脂肪酶的酶。這種乳酸菌可以與另一 種微生物共培養(yǎng)，其可以被遺傳修飾，其可以合成PLA。有利地，選擇兩種共培養(yǎng)的微生物以 使它們對于培養(yǎng)基中存在的碳源，優(yōu)選糖類不發(fā)生競爭。在本發(fā)明的某些實施方式中，術(shù)語 "包括"可以表示"基本上由……構(gòu)成"或"由……構(gòu)成"。
[0058] 實施例
[0059] 根據(jù)以下實施例將更好地理解本發(fā)明，這些實施例通過完全非限制性的舉例說明 本發(fā)明的方式給出。
[0060] 實施例1 :表汰PLA解聚酶的重纟目乳酸菌
[0061] 方法和裝置
[0062] 用來制備重組質(zhì)粒的克隆技術(shù)是與在由Sambrook等1989的出版物中描述的 技術(shù)一致的那些（"Molecular cloning:a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.，'）。
[0063] 將來自具有序列 SEQ ID N。I (Nakamura et al. 2〇01_Appl. Environ. Microbiol. 67:345-353)的擬無枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.)K104_l 的 pld 基因通過同 源性重組引入到質(zhì)粒 pNZ8048 中（Kuipers et al. 1998 -J. Biotechnol. 64:15-21)。整合 該pld基因的重組質(zhì)粒稱為"pNZ-pld"。
[0064] 野生型株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)MG1363使用由Ho等在1995年 描述的方法通過電穿孔通過引入到細(xì)胞中的質(zhì)粒pNZ-pld轉(zhuǎn)化（"Transformation of Lactococcus by electroporation''Methods Mol. Biol. 47:195-199)。整合 pNZ-pld 質(zhì)粒 的重組細(xì)菌表示為"MG1363-pNZ-pld"。陰性對照"MG1363-pNZ8048"對應(yīng)于通過空質(zhì)粒 PNZ8048轉(zhuǎn)化的野生型株乳酸乳球菌MG1363。
[0065] PLA解聚酶活性
[0066] MG1363-pNZ-pld 和 MG1363-pNZ8048 株在 30°C、在厭氧條件下在具有 CDM( "化學(xué) 成分確定的培養(yǎng)基"）的2L發(fā)酵罐中平行地培養(yǎng)。
[0067] 向培養(yǎng)基中加入葡萄糖以達(dá)到1%的最終濃度（重量/體積），并且通過自動添加 NaOH將pH保持在6. 5。
[0068] 培養(yǎng)物各自分成兩個次培養(yǎng)物，每批次的次培養(yǎng)物（MG1363-pNZ-pld_l/ MG1363-pNZ8048-l 和 MG1363-pNZ-pld-2/MG1363-pNZ8048-2)被保持在相同條件下。
[0069] 僅第二批次（MG1363-pNZ-pld-2/MG1363-pNZ8048-2)接受摩爾質(zhì)量為 220, OOODa 的PLA (Shimadzu Co. -Kyoto, Japan)，乳化到培養(yǎng)基中至0· 1% (重量/體積）。
[0070] 通過米用在 Nakamura 等 _2〇01 ( "Purification and characterization of an extracellular poly(L-lactic-acid)depolymerase from a soil isolate Amycolatopsis sp. Strain K104-1，'Appl. Environ. Microbiol. 67:345-353)中描述的方 法，PLA解聚酶活性在培養(yǎng)2天后測量。
[0071] 來自第一批次的培養(yǎng)物上清在培養(yǎng)兩天后移出并通過質(zhì)譜法（Varian Inova500) 分析以評價乳酸含量。
[0072] 對于兩個樣品（MG1363-pNZ-pld-l 和 MG1363-pNZ8048-l)，觀察到在 90Da 的單個 峰，對應(yīng)于通過發(fā)酵由細(xì)菌產(chǎn)生的乳酸。因此，該重組株MG1363-pNZ-pld良好適合于通過 存在于培養(yǎng)基中的葡萄糖發(fā)酵來生產(chǎn)乳酸。
[0073] 同時，來自第二批次的培養(yǎng)物上清移出并通過質(zhì)譜法（Varian Inova 500)分析以 評價存在的乳酸低聚物（基本上為二聚體和三聚體）的量。
[0074] 對于兩個樣品（MG1363-pNZ-pld-2 和 MG1363-pNZ8048-2)，在 220, OOODa 觀察 到峰，對應(yīng)于在培養(yǎng)基中存在的PLA，和對應(yīng)于乳酸的在90Da的峰。而且，對于對應(yīng)于 MG1363-pNZ-pld-2的培養(yǎng)基的樣品，觀察懂啊具有中間分子量的多個峰存在，這些峰對于 MG1363-pNZ8048-l缺乏。這些中間峰對應(yīng)于各自大小的乳酸低聚物，其證實培養(yǎng)基的PLA 確實已通過重組株MG1363-pNZ-pld-2降解。
[0075] 表達(dá)PLA解聚酶的重組株MG1363-pNZ-pld事實上能夠通過發(fā)酵和解聚培養(yǎng)基中 存在的高分子量PLA而生產(chǎn)乳酸。
[0076] 實施例2 :乳酸牛產(chǎn)的評價
[0077] 實施例 1 的培養(yǎng)物上清，對應(yīng)于批次 MG1363-pNZ-pld-l，MG1363-pNZ-pld-2, MG 1363-pNZ8048-l和MG1363-pNZ8048-2,通過HPLC分析以確定釋放的乳酸的量。為此，將 Aminex HPX-87H柱，恒溫在50°C并且用5mM硫酸溶液以0. 5mL/min洗脫，用于定量。
[0078] 此分析可以證實，來自批次MG1363-pNZ-pld-2的上清中的乳酸的量高于3種其他 條件（MG1363-pNZ-pld-l，MG1363-pNZ8048-l 和 MG1363-pNZ8048-2)的乳酸的量。類似地， 僅在來自批次MG1363-pNZ-pld-2的培養(yǎng)物上清中觀察到乳酸二聚體的存在。
[0079] 在C18柱上的互補(bǔ)分析使用過由Vu等2005描述的方法進(jìn)行（"Oligomer distribution in concentrated lactic acid solutions，'，F(xiàn)luid Phase Equilibria, 236, 125-135)。來自批次MG1363-pNZ-pld-2的培養(yǎng)物上清的分析確認(rèn)高達(dá)6 的聚合度的乳酸低聚物的存在。
[0080] 實施例3 :在蛋白_ K存在下培養(yǎng)乳酸乳球菌IL 1403。
[0081] 以下實施例處理乳酸乳球菌IL 1403株和蛋白酶K的組合用于生產(chǎn)乳酸。該蛋白 酶K是來自白色念球菌的蛋白酶K，可以標(biāo)號EU0090獲自EUR0MEDEX。
[0082] 3. 1.菌株和培養(yǎng)基的選擇
[0083] 使用的菌株是乳酸乳球菌IL 1403株。此株在補(bǔ)充有5g/L的葡萄糖并緩沖至pH 為8的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基（CDM培養(yǎng)基）上培養(yǎng)。不使用豐富培養(yǎng)基（含有蛋白胨、蛋 白質(zhì)或寡肽的來源）以便不包括在將對蛋白酶K優(yōu)選的培養(yǎng)基基質(zhì)中，其可能與要降解的 PLA競爭。
[0084] 表I :pH 8的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基（CDM)的組成
[0085]
[0086] 3· 2.培養(yǎng)條仵的選擇

【權(quán)利要求】
1. 微生物，其被遺傳修飾以 i) 通過發(fā)酵碳源來合成烴單體，和 ii) 使至少由其能夠合成的烴單體構(gòu)成的聚合物解聚。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述單體包含至少一個選自氧和氮的雜原子， 優(yōu)選為酸、醇和胺官能的形式。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物，其被遺傳改性以iii)減弱其能夠合成的烴單體 的降解途徑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的微生物，其被遺傳改性以 iv)合成至少由其能夠合成的經(jīng)單體構(gòu)成的聚合物。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的微生物，其被遺傳改性以使聚酯解聚和合成所述 聚酯的酯化的中間體酸和/或醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物，其被遺傳改性以使聚乳酸（PLA)解聚并合成乳酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其表達(dá)用于使PLA解聚的至少一種選自蛋白激酶K、 脂肪酶和PLA解聚酶的酶，和/或乳酸脫氫酶以合成乳酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微生物，其中所述微生物是乳酸微生物，優(yōu)選乳酸菌。
9. 用于生產(chǎn)烴單體的方法，包括以下步驟 -使根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的微生物與碳源并且與能夠被所述微生物解聚 的聚合物接觸，和任選地 -回收所產(chǎn)生的烴單體。
10. 微生物的共培養(yǎng)物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的至少第一微生物和 至少第二微生物，任選地被遺傳修飾，其能夠合成至少由通過所述第一微生物產(chǎn)生的單體 構(gòu)成的聚合物。
11. 用于合成聚合物的方法，其使用根據(jù)權(quán)利要求10所述的微生物的共培養(yǎng)物，所述 方法包括以下步驟 -使所述微生物的共培養(yǎng)物與碳源并且與能夠被所述第一微生物降解的聚合物接觸， 和任選地 -回收由所述第二微生物產(chǎn)生的聚合物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的合成方法，用于生產(chǎn)PLA，其中所述第一微生物是根據(jù)權(quán)利 要求6至8中任一項所述的微生物并且所述第二微生物被遺傳修飾以從乳酸單體合成PLA。
【文檔編號】C07C2/00GK104364372SQ201380027534
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月27日
【發(fā)明者】塞德瑞克·布瓦薩爾 申請人:卡拜耳公司