用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了以下內(nèi)容：用于有效生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，所述試劑特異的結合存在于液體樣品中的不溶性抗原蛋白質(zhì)；由所述生產(chǎn)方法生產(chǎn)的抗體檢測試劑；和所述抗體的用途。在用于溶解抗原蛋白質(zhì)的步驟中，通過利用陽離子化劑可以有效的溶解和回收抗原蛋白質(zhì)；因此，當與常規(guī)方法相比時，可以有效的生產(chǎn)與載體中的多種抗原蛋白質(zhì)分子結合的抗體檢測試劑。
【專利說明】用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法及其用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法。本發(fā)明還涉及由所述方法生產(chǎn)的抗體 檢測試劑及其用途。

【背景技術】
[0002] 存在大量用于檢測包含在液體樣品中的抗體的方法，例如放射性免疫測定和酶聯(lián) 免疫吸附測定（ELISA)。ELISA是這樣的方法，涉及：在微平板上固定特定的抗原；在連續(xù)稀 釋含有抗體的樣品后，在微平板上實施抗原-抗體反應；使用酶標記的第二抗體檢測結合 的抗體。該方法需要使用獨立的測定平板評估針對單個抗原的抗體測試。
[0003] 作為用于解決該問題的方法，已關注了一種多元技術，該技術可以利用攜帶報告 子熒光的微珠作為固定的載體，同時分析針對多種抗原的抗體。
[0004] 在任何上述技術的應用中，必須以水溶性的形式制備這些多種抗原。在絕大部分 情況下，通常使用可以以水溶性形式制備的天然結構的蛋白質(zhì)或化學合成的多肽片段。
[0005] 例如，專利文獻1或2中描述了用于檢測包含在癌癥患者的血液中的抗體的方法。 該方法涉及將抗原表位肽（包含若干個氨基酸的抗原肽）固定在珠子上；將珠子與對象的 血液組分接觸；并檢測包含在對象的血液中的抗原表位肽-特異性抗體。然而，抗體所結合 的表位部分根據(jù)HLA的類型而不同。因此，專利文獻1或2中描述的方法的應用需要明確 多種條件，如檢驗對象的HLA類型和鑒別適合對象的HLA類型的表位肽。
[0006] 為了制備針對特定抗原蛋白質(zhì)的抗體的檢測試劑，待制備的試劑包含源自位于一 類珠子表面上的一類抗原蛋白質(zhì)的所有表位部分，并實施高度靈敏和穩(wěn)定的檢測。出于該 目的，優(yōu)選是獲得具有水溶性和柔性結構的抗原。但是，絕大部分的變性蛋白質(zhì)、溶解性差 的蛋白質(zhì)（例如，膜蛋白）或具有不穩(wěn)定的物理特性的蛋白質(zhì)都趨向于聚集。就此而言，在 絕大部分情況下，通常使用能夠表現(xiàn)出穩(wěn)定的物理特性的部分肽。
[0007] 利用這類部分肽需要合成多種重疊的肽用于覆蓋所有的表位，并且還需要制備許 多類型的珠子。此外，實踐上難以提供無縫的表位肽。即使可以幸運的獲得具有天然結構 的全長抗原，具有內(nèi)部包埋了疏水部分的高級結構的常規(guī)蛋白質(zhì)并不總是暴露其表位而與 抗體反應。
[0008] 即使在使用溶解的蛋白質(zhì)制備的抗體檢測試劑中，包含在蛋白質(zhì)中的巰基可以隨 時間形成二硫鍵，從而影響抗體檢測。
[0009] 例如，專利文獻3描述了利用人丙肝病毒（HCV)的長鏈多肽，檢測包含在對象的血 清中的抗HCV抗體的方法。專利文獻3陳述了隨時間生成的蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間的二硫鍵 降低了抗體檢測的靈敏度。其中描述的解決該問題的方案是在檢測前或檢測的過程中使用 還原劑解離蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間的二硫鍵，從而改善抗體檢測的靈敏度。由于即使是溶解 的蛋白質(zhì)也可能隨時間沉淀，用于解決該問題的方法是必需的。
[0010]已知TAPS-磺酸酯（甲烷硫代磺酸三甲基銨基丙基酯；在下文中稱為TAPS)是使 蛋白質(zhì)溶解的化合物。TAPS可以結合蛋白質(zhì)中的巰基，使蛋白質(zhì)可逆的陽離子化（參見例 如，非專利文獻1和2)。
[0011] 陽離子化蛋白表現(xiàn)出改善的水溶性。因為TAPS與蛋白質(zhì)的結合是可逆的反應，已 知在細胞攝入后，TAPS與蛋白質(zhì)解尚，從而由于重折置的結果，使蛋白質(zhì)能夠執(zhí)行其最初的 功能。然而，迄今為止尚無嘗試利用TAPS溶解來制備抗體檢測試劑的方法。此外，一般已 知抗體結合糖基化蛋白質(zhì)。但是，之前沒有報道顯示抗體是否能夠結合與人工合成的化合 物，如TAPS結合的蛋白質(zhì)。
[0012] 引用列表
[0013] 專利文獻
[0014] 專利文獻 1 :日本專利號 3960614(ImmunodiaCo.，Ltd.)
[0015] 專利文獻 2 :JP2005-098877A(HitachiSoftwareEngineeringCo.，Ltd.)
[0016] 專利文獻 3 :日本專利號 3225468(DainabotCo.，Ltd.)
[0017] 非專利文獻
[0018] 非專利文獻I:M.Seno等人，GrowthFactors, 15, 215-229 (1998)
[0019] 非專利文獻 2 :Μ·Inoue等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，28, 207-213 (1998)
[0020] 發(fā)明概述
[0021] 技術問題
[0022] 本發(fā)明是在上述背景下產(chǎn)生的。本發(fā)明提供了用于有效生產(chǎn)檢測存在于液體樣品 中的抗體的試劑的方法，所述抗體特異的結合溶解性差的抗原蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了由 所述生產(chǎn)方法生產(chǎn)的抗體檢測試劑及其用途。
[0023] 要解決的問題
[0024] 具體而言，本發(fā)明的目標是提供以下方面：
[0025] (1)用于生產(chǎn)包含抗原蛋白質(zhì)和載體的抗體檢測試劑的方法，方法包括以下步驟： 通過陽離子化溶解抗原蛋白質(zhì)；以及使得陽離子化的抗原蛋白質(zhì)與載體結合。
[0026] (2)根據(jù)（1)的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)是全長蛋白 質(zhì)。
[0027] (3)根據(jù)（1)或（2)的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)是膜蛋 白。
[0028] (4)根據(jù)⑴至⑶的任一項的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述抗原蛋白 質(zhì)是癌癥抗原蛋白質(zhì)。
[0029](5)根據(jù)⑴至⑷的任一項的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中通過結合陽離 子化劑與抗原蛋白質(zhì)的巰基實施所述陽離子化。
[0030] (6)根據(jù)（5)的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述陽離子化劑選自任一種 的硫代磺酸酯化合物、混合的二硫化物化合物、吡啶基硫化物陽離子化劑和烷基鹵化物陽 離子化劑，及其混合物。
[0031] (7)根據(jù)￠)的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述硫代磺酸酯化合物是由 下列式所示的化合物：
[0032] [式 1]
[0033]

【權利要求】
1. 用于生產(chǎn)包含抗原蛋白質(zhì)和載體的抗體檢測試劑的方法，方法包括以下步驟：通過 陽離子化溶解抗原蛋白質(zhì)；以及使得陽離子化的抗原蛋白質(zhì)與載體結合。
2. 根據(jù)權利要求1的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)是全長蛋白 質(zhì)。
3. 根據(jù)權利要求1或2的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)是膜蛋 白。
4. 根據(jù)權利要求1至3的任一項的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述抗原蛋白 質(zhì)是癌癥抗原蛋白質(zhì)。
5. 根據(jù)權利要求1至4的任一項的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中通過結合陽離 子化劑與抗原蛋白質(zhì)的巰基實施所述陽離子化。
6. 根據(jù)權利要求5的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述陽離子化劑選自任一種 的硫代磺酸酯化合物、混合的二硫化物化合物、吡啶基硫化物陽離子化劑和烷基鹵化物陽 離子化劑，及其混合物。
7. 根據(jù)權利要求6的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述硫代磺酸酯化合物是由 下列式所示的化合物： [式1]
其中R1代表具有2至20個碳原子的線性亞烷基；R2代表具有1至3個碳原子的烷基； 并且η代表1至3的任意整數(shù)。
8. 根據(jù)權利要求7的方法，其中所述化合物是TAPS-磺酸酯，其中R1是-(CH2) 3- ;R2是 CH3-;且 η 是 1。
9. 根據(jù)權利要求7的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述化合物是TAP3S-磺酸 酯，其中 R1 是 _ (CH2) 3- ;R2 是 CH3-;且 η 是 3。
10. 根據(jù)權利要求6的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述烷基鹵化物陽離子化 劑是 TAP-Br。
11. 根據(jù)權利要求1至10的任一項的用于生產(chǎn)抗體檢測試劑的方法，其中所述載體是 磁珠。
12. 根據(jù)權利要求1至11的任一項的方法生產(chǎn)的抗體檢測試劑。
13. 用于檢測包含在樣品中的抗原特異性抗體的方法，方法包括以下步驟：將根據(jù)權 利要求12的抗體檢測試劑與樣品接觸；向其加入與抗體結合的被標記的第二抗體以允許 第二抗體與抗體結合；回收抗體檢測試劑；以及檢測與抗體結合的抗體檢測試劑。
14. 根據(jù)權利要求13的方法，其中所述樣品是分離的體液。
【文檔編號】C07K14/705GK104380106SQ201380028339
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權日:2012年3月30日
【發(fā)明者】二見淳一郎, 垣見和宏, 前川隆司, 白木正人 申請人:二見淳一郎, 邁世耐特股份公司