用于治療t細(xì)胞介導(dǎo)的病理的來(lái)源于hiv gp41 的肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含來(lái)源于HIV gp41蛋白胞外域的氨基酸序列HTTWMEWD(SEQ ID NO:1)的肽、衍生物和類似物，包含其的藥物組合物，以及它們用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和紊亂的用途。
【專利說(shuō)明】用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的病理的來(lái)源于HIV GP41的肽 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及包含來(lái)源于Hiv gp41的氨基酸序列的肽、衍生物和類似物，包含它們 的藥物組合物，及其用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和紊亂的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫突觸（immunological synapse, IS)是在T細(xì)胞和表達(dá)適當(dāng)?shù)碾?主要組織 相容性復(fù)合物（MHC)復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞（APC)的接觸面形成的一種復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 由于其參與免疫反應(yīng)過(guò)程中T細(xì)胞活化的必要步驟，其極具重要性并令人感興趣。存在于 IS中的T細(xì)胞受體（TCR)復(fù)合物，在免疫系統(tǒng)中具有重要功能并用于保護(hù)生物體免受傳染 性物質(zhì)的危害。該受體由負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的TCR-a和P鏈的異二聚體組成。這些鏈與APC 的MHC分子以及與TCR共受體⑶3的恒定鏈相互作用。
[0003] 干擾TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被證明抑制T細(xì)胞增殖和活化，引起受損的免疫監(jiān)視（immune surveillance)。利用該信息對(duì)自身免疫性疾病和由免疫反應(yīng)過(guò)度活化引起的其他疾病的 治療是至關(guān)重要的。已經(jīng)證明干擾TCR組裝的肽和脂肽例如TCR-a的跨膜結(jié)構(gòu)域，在T細(xì) 胞介導(dǎo)的（自身免疫性）疾病的幾種動(dòng)物模型中減少臨床征象。
[0004] 本申請(qǐng)的一位發(fā)明人和合作者的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 2007/034490提供了來(lái)源于 T細(xì)胞受體a (TCRa )跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD)的非對(duì)映的肽和脂肽、包含它們的藥物組合物及其 用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病的用途。
[0005] 本申請(qǐng)的發(fā)明人之一和合作者的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 2007/034489提供了包含T 細(xì)胞受體恒定區(qū)和來(lái)源于其的肽的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物有效預(yù)防或治療 T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病。WO 2007/034489的免疫原性組合物包含選自由以下組成的組的 至少一種免疫原：（i)人TCR鏈的分離的恒定區(qū)；和（ii)包含TCR鏈的恒定區(qū)的免疫原性 片段的肽。
[0006] HIV-I 的包膜蛋白（ENV)
[0007] 人類免疫缺陷病毒-I(HIV-I)與其靶細(xì)胞的融合事件由其包膜糖蛋白（ENV)介 導(dǎo)。ENV被合成作為前體蛋白gpl60,并經(jīng)受被細(xì)胞蛋白酶裂解為兩個(gè)非共價(jià)締合的亞基 gpl20和gp41。gpl20是使宿主趨向性成為可能的表面亞基，而gp41是負(fù)責(zé)實(shí)際膜融合 (membrane merger)的跨膜亞基。
[0008] gp41的胞外域包含若干區(qū)域（圖1A) :N末端融合肽（FP)、融合肽近端區(qū)域 (FPPR)、N末端七肽重復(fù)區(qū)（NHR)、二硫鍵鍵合的環(huán)、C末端七肽重復(fù)區(qū)（CHR)、膜近端外部區(qū) 域（MPER)和跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD)。主流模型假定gp41胞外域中至少三個(gè)構(gòu)象變化參與促進(jìn) 對(duì)應(yīng)的病毒和細(xì)胞膜之間的融合（圖1C) :(i)天然非促融合狀態(tài)，其中g(shù)pl20亞基遮蔽疏 水性gp41胞外域；（ii) gpl20結(jié)合至受體⑶4和共受體諸如CCR5或CXCR4,引起驅(qū)動(dòng)天然 狀態(tài)轉(zhuǎn)換為前發(fā)夾結(jié)構(gòu)中間態(tài)的主要構(gòu)象變化，gp41在拉伸的構(gòu)象中被釋放，且FP插入細(xì) 胞膜中；（iii) gp41折疊為包含核心結(jié)構(gòu)的低能三聚發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
[0009] 來(lái)源于若干逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的保守序列（稱為CSK-17)顯示抑制T細(xì)胞增 殖（Cianciolo，G. J?等，Science, 1985. 230(4724):第 453-5 頁(yè)）。在 HIV-1ENV 的 gp41亞基中鑒定的同源序列是被稱為免疫抑制單元（ISU)的17肽（Ruegg，C.L等，J Virol, 1989.63(8):第3257-60頁(yè)）。ISU肽來(lái)源于gp41的NHR和環(huán)區(qū)域之間的交界處（圖 1B)，并能夠抑制T細(xì)胞增殖。ISU是從HIV-IENV設(shè)計(jì)的第一個(gè)免疫抑制肽。
[0010] 本申請(qǐng)的一位發(fā)明人和合作者的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 2006/077601涉及來(lái)源于 HIV gp41融合肽（FP)結(jié)構(gòu)域的肽，其可用于預(yù)防或治療自身免疫性或其他T細(xì)胞介導(dǎo)的病 理（T cell mediated pathologies)〇
[0011] 本申請(qǐng)的一位發(fā)明人和合作者的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 2011/064770涉及來(lái)源于 HIV gp41跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD)的肽，其可用于治療炎性疾病或紊亂。
[0012] 來(lái)源于gp41FP結(jié)構(gòu)域和TMD的肽以及來(lái)源于TCR-a跨膜結(jié)構(gòu)域的肽為膜插入 肽，且其靶為展示在細(xì)胞膜表面的TCR或CD3。相反地，ISU肽則通過(guò)干擾鈣內(nèi)流和蛋白激 酶C(PKC)的功能以不同的方式起作用并抑制TCR信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的下游。
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人之一的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 2005/060350公開(kāi)了膜結(jié)合的非對(duì)映 的肽，包含對(duì)應(yīng)于跨膜蛋白的片段的氨基酸序列，其中該非對(duì)映的肽的至少兩個(gè)氨基酸殘 基為D-異構(gòu)體構(gòu)型，可用于抑制融合膜蛋白事件，具體包括病毒復(fù)制和傳播。尤其地，WO 2005/060350公開(kāi)了對(duì)應(yīng)于HIV-lgp41的氨基酸512至544和HIV-Iuv gp41的氨基酸638 至673的非對(duì)映的肽在抑制膜融合過(guò)程中的用途。
[0014] T細(xì)胞介導(dǎo)的病理
[0015] 很多疾病被認(rèn)為起因于自身免疫機(jī)制。其中突出的是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅 斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、重癥肌無(wú)力、尋常型天皰瘡。自身免疫性疾病影響全世 界數(shù)百萬(wàn)人，且依據(jù)實(shí)際治療支出和損失的生產(chǎn)力計(jì)算，這些疾病的費(fèi)用每年為數(shù)十億美 J Li 〇
[0016] T細(xì)胞在器官移植的排斥或經(jīng)由骨髓（造血干細(xì)胞）移植的移植物抗宿主病中也 起主要作用。因此，此類免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)是治療上所期望的。
[0017] US 5, 230, 887公開(kāi)了通過(guò)施用亞免疫原性（sub immunogenic)量的抗原治療或 抑制自身免疫性疾病癥狀的方法，所述抗原與同種免疫-免疫原-吸收的（AIA)血清比與 同物種非免疫血清更具免疫反應(yīng)性。一種推定抗原，基于其與MHC II類抗原的聲稱的血清 學(xué)交叉反應(yīng)性，被認(rèn)為是HIV的完整gp41。聲稱的交叉反應(yīng)性存在于C末端肽。
[0018] 已經(jīng)描述了來(lái)源于gp41胞外域的肽。例如，美國(guó)專利號(hào)4, 629783涉及用于檢測(cè) AIDS相關(guān)疾病的肽，且特別地涉及作為確定人類宿主暴露于AIDS相關(guān)病毒的試劑的肽。
[0019] 美國(guó)專利號(hào)5, 981，706涉及用于合成熱休克蛋白（HSP)-肽復(fù)合物的方法，包括將 休克蛋白加入變性的蛋白基質(zhì)以使HSP與變性的蛋白基質(zhì)結(jié)合；和加入含有肽的絡(luò)合溶液 以洗脫HSP-肽復(fù)合物的步驟。'706公布還提供了 HSP-肽復(fù)合物和用于合成所述復(fù)合物 的設(shè)備。根據(jù)' 706公布，適于用作絡(luò)合劑的肽中有來(lái)源于gp41的肽。
[0020] 美國(guó)專利號(hào)7, 297, 784涉及最初來(lái)源于各種逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜（gp41)蛋白序列的 增強(qiáng)子肽序列，所述增強(qiáng)子肽序列增強(qiáng)其連接的任何核心多肽的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
[0021] 用于調(diào)節(jié)患者中免疫反應(yīng)的傳統(tǒng)試劑和方法產(chǎn)生不希望的副作用和有限的療效。 例如，用于治療自身免疫性疾病患者的免疫抑制試劑（如，環(huán)孢菌素 A、硫唑嘌呤和潑尼松） 還抑制患者的整體免疫反應(yīng)，從而增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，并可引起針對(duì)非淋巴組織的毒副作用。 由于免疫調(diào)節(jié)的醫(yī)學(xué)重要性和現(xiàn)有免疫藥物試劑的不足，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)特定部分的試劑和 方法是持續(xù)多年來(lái)的研究主題。
[0022] 然而，任何【背景技術(shù)】都沒(méi)有公開(kāi)或提示來(lái)源于HIV_lgp41胞外域的C末端七肽重 復(fù)區(qū)（CHR)和CHR近端區(qū)域的肽調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化且特別地可用于治療或預(yù)防疾病和紊亂諸 如自身免疫性疾病、炎性疾病和移植排斥。
[0023] 對(duì)治療或改善T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病以及改善T細(xì)胞介導(dǎo)的病理更 有效的方法存在長(zhǎng)期的需求。因此，開(kāi)發(fā)能夠選擇性抑制T淋巴細(xì)胞的活化并具有最小的 副作用的新的免疫抑制劑是期望的。
[0024] 發(fā)明概述
[0025] 本發(fā)明提供了包含來(lái)源于HIV gp41胞外域特別地來(lái)源于C末端七肽重復(fù)區(qū)（CHR) 和CHR近端區(qū)域的氨基酸序列的肽，以及包含其的藥物組合物，所述肽和藥物組合物有效 預(yù)防或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和紊亂包括但不限于炎性疾病、自身免疫性疾病和移植排 斥。
[0026] 本發(fā)明部分基于以下意想不到的發(fā)現(xiàn)：來(lái)源于gp41胞外域的CHR和CHR近端區(qū)域 的肽抑制T細(xì)胞活化。與其他源自HIV的免疫抑制肽（例如，ISU元件）相比，本發(fā)明的肽作 為免疫抑制肽具有20倍更高的效力。特別地，該肽抑制對(duì)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG) 抗原特異性的T細(xì)胞的活化，從而在自身免疫性疾病包括但不限于多發(fā)性硬化癥中用作免 疫抑制化合物。此外，所述肽比其他源自HIV的免疫抑制肽具有顯著更低的疏水性。
[0027] 此外，本發(fā)明的肽顯示顯著減輕C57BL/6J雌性小鼠中誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性 腦脊髓炎（EAE)，而在體內(nèi)和體外研究中均顯示出最小的毒性作用。
[0028] 根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 8-30個(gè)氨基酸的分離的肽，所述分離的肽包含如 SEQ ID NO: 1所列的氨基酸序列HTTWMEWD，或其類似物或鹽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述類 似物包含至少一個(gè)Trp (W)殘基被選自lie (I)、Leu (L)和Gly (G)的氨基酸的取代。
[0029] 根據(jù)具體實(shí)施方案，分離的肽包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：
[0030] 如 SEQ ID N0:2 所列的 WNHTTWMEWD、
[0031] 如 SEQ ID N0:3 所列的 SNKSLEQIWNHTTWMEWD、和
[0032] 如 SEQ ID N0:4 所列的 EQIWNHTTWMEWDREINN ;
[0033] 或其類似物、衍生物或鹽。
[0034] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述肽由氨基酸序列WNHTTWMEWD(SEQ ID N0:2)組成。根 據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述肽由氨基酸序列SNKSLEQIWNHTTWMEWD(SEQ ID N0:3)組成。根據(jù) 另一個(gè)實(shí)施方案，所述肽由氨基酸序列EQIWNHTTWMEWDREINN(SEQ ID N0:4)組成。
[0035] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，至少一個(gè)D氨基酸位于選自肽的N末端、C末端或兩 者的位置處。根據(jù)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的肽由如SEQ ID N0:5所列的氨基酸序列 SNKSLEQIWNHTTWMEWjQ組成，其中S是D-Ser且2是D-Asp。根據(jù)特定實(shí)施方案，肽包含如 SEQ ID NO: 11所列的氨基酸序列（WNHTTWMEWD)或由其組成，其中所有氨基酸都為D-氨基 酸。
[0036] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 10-30個(gè)氨基酸的分離的肽，所述分離的肽包含 如SEQ ID NO: 2所列的氨基酸序列WNHTTWMEWD，或其包含至少一個(gè)D氨基酸的類似物。
[0037] 根據(jù)示例性的實(shí)施方案，分離的肽包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：
[0038] SNKSLEQIffNHTTWMEffD(SEQ ID NO :3),
[0039] EQIWNHTTWMEWDREINN(SEQ ID N0:4)、和
[0040] SNKSLEQIWNHTTWMETO，其中 S 為 D-Ser 且 2 為 D-Asp (SEQ ID NO: 5)。
[0041] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的分離的肽作 為活性成分，和藥學(xué)上可接受的載體。
[0042] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，藥物組合物還包含免疫抑制劑。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，免疫 抑制劑為免疫抑制肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，免疫抑制肽包含如SEQ ID N0:6所列的氨基 酸序列LQARILAVERYLKDQQL，或其類似物、衍生物或鹽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，免疫抑制肽由 如SEQ ID N0:6所列的氨基酸序列LQARILAVERYLKDQQL組成。
[0043] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種治療有相應(yīng)需要的受試者的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病 或紊亂的方法，包括向受試者施用治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物。
[0044] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療有相應(yīng)需要的 受試者的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂的藥物中的用途。
[0045] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了本發(fā)明的藥物組合物用于在治療有相應(yīng)需要的受試 者的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂中使用。
[0046] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂為T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾 病。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病選自由以下組成的組：多發(fā)性硬 化癥、自身免疫性神經(jīng)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、銀屑病、I型糖尿?。↖DDM)、干燥綜合征 (Sjogren' s disease)、甲狀腺疾病、重癥肌無(wú)力、肉樣瘤病、自身免疫性葡萄膜炎、炎性腸 病（克羅恩氏結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎）、自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板 減少癥、硬皮病、斑禿、腎小球腎炎、皮炎和天皰瘡。每種可能性均代表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方 案。根據(jù)示例性的實(shí)施方案，自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
[0047] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂是T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病。
[0048] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂選自由以下組成的組：同種異體 移植排斥和移植物抗宿主病。
[0049] 本發(fā)明另外的實(shí)施方案和適用的全部范圍從下文給出的詳細(xì)描述將變得明顯。然 而，應(yīng)當(dāng)理解，盡管顯示了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例僅為了闡述被給 出，因?yàn)橥ㄟ^(guò)該詳細(xì)描述，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變或修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而 言將變得明顯。
[0050] 附圖簡(jiǎn)述
[0051] 圖IA是gp41的胞外域內(nèi)的區(qū)域的示意圖。從N末端起為融合肽（FP)、融合肽近 端區(qū)域（--?1〇、1^末端七肽重復(fù)區(qū)〇^-七61'111；[仙1116口七3(1代口631：，順1?)、二硫鍵鍵合的環(huán)、0 末端七肽重復(fù)區(qū)（C-terminal heptad repeat，CHR)和膜近端外部區(qū)域（MPER)。序列（SEQ ID NO: 12)來(lái)自HIV-Ihxb2且殘基編號(hào)對(duì)應(yīng)于其gpl60 (每個(gè)區(qū)域的邊界是估計(jì)的）。新基 序（SEQ ID N0:2)的位置以灰色展示，且箭頭指示來(lái)源于該區(qū)域的肽（SEQ ID N0:7、8、3和 4)。
[0052] 圖IB顯示HIV_lHXB2gpl60的殘基512-683的氨基酸序列和在圖IA中標(biāo)出的區(qū)域。 還標(biāo)出了免疫抑制單元（ISU)肽和免疫抑制肽p印6(SEQ ID N0:3)的序列。
[0053] 圖IC顯示gp41誘導(dǎo)的融合和抑制的機(jī)制。在天然非促融合狀態(tài)下，gpl20亞基 遮蔽跨膜gp41。gpl20與受體CD4以及共受體的結(jié)合引起構(gòu)象變化，釋放gp41以形成拉伸 的前發(fā)夾結(jié)構(gòu)中間態(tài)，其特征在于暴露NHR和CHR，F(xiàn)P插入靶膜中。該中間態(tài)對(duì)融合抑制劑 的作用敏感。在缺少抑制劑的情況下，gp41折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)象，接下來(lái)是半融合和融合 孔的形成（融合后）。
[0054] 圖2A描繪了 ISU的可能的C末端對(duì)應(yīng)物。⑴是HIV_lgp41 (來(lái)自TOB 1QCE)的 發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)象包含環(huán)區(qū)域的計(jì)算機(jī)模型。（2-4)分別是相對(duì)于ISU的pep 1(SEQ ID N0:7)、 p印 8 (SEQ ID NO :8)和 p印 6 (SEQ ID NO :3)的位置。
[0055] 圖2B顯示對(duì)于若干逆轉(zhuǎn)錄病毒株的包膜蛋白中的p印6(SEQ ID N0:3)的保守 性的生物信息學(xué)分析。HIV-1、HIV-2、SIV和貓免疫缺陷病毒（FIV)導(dǎo)致免疫缺陷表型。 HTLV-UHTLV-2、莫洛尼鼠白血病病毒（MoLV)和貓白血病病毒（FLV)導(dǎo)致白血病。（*)表 示若干或全部病毒株之間的氨基酸保守性。
[0056] 圖2C顯示基序的保守性。'Y'軸以比特（bits)為單位，其等于基序相對(duì)于統(tǒng)一的 背景頻率模型的相對(duì)熵。
[0057] 圖3A是顯示由2. 5 ii M、5 ii M和10 ii M (分別以灰色、黑色和白色表示）的遞增濃度 的源自gp41的肽（從左到右：SEQ ID NO: 7、8、3和4)抑制增殖的柱形圖。所示的結(jié)果為來(lái) 自（四次實(shí)驗(yàn)中的）代表性實(shí)驗(yàn)的M0G35-55肽（SEQ ID N0:15)相對(duì)于對(duì)照（不存在肽） 的增殖反應(yīng)的平均抑制％ ±標(biāo)準(zhǔn)差（SE)。未被抑制的T細(xì)胞增殖反應(yīng)為7866±563cpm。 不存在抗原情況下的背景增殖為132±35cpm。
[0058] 圖3B是描繪T細(xì)胞增殖受ISU肽和其可能的對(duì)應(yīng)物（SEQ ID NO: 1、3和8)的劑 量依賴性（0、2. 5、5、10和20 iiM)抑制的線形圖。
[0059] 圖3C描繪了從納摩爾濃度范圍起的源自gp41的肽（SEQ ID N0:3)的M0G35-55 特異性T細(xì)胞增殖的劑量依賴性抑制。
[0060] 圖3D描繪了使用輻照的同系脾細(xì)胞作為APC與M0G35-55培養(yǎng)的M0G35-55特異 性T細(xì)胞系，在存在或不存在遞增濃度的SEQ ID N0:3的肽（)或IUS( □)時(shí)的T細(xì)胞 增殖的抑制。
[0061] 圖3E是顯示源自gp41的肽（SEQ ID NO: 3)對(duì)IFN Y由M0G35-55刺激的T細(xì)胞 的分泌的影響的柱形圖（結(jié)果為平均值土SE, n = 3. *p〈0. 05)。
[0062] 圖3F是顯示源自gp41的肽（SEQ ID NO: 3)對(duì)TNF a由LPS刺激的巨噬細(xì)胞的分 泌的影響的柱形圖（結(jié)果為平均值土SE, n = 3)。
[0063] 圖3G是描繪與20 ii M的源自gp41的肽（SEQ ID NO: 3)孵育4小時(shí)的Jurkat T細(xì) 胞（柱1)和M0G35-55-特異性T細(xì)胞（柱2)的活力的柱形圖。（結(jié)果為相對(duì)于對(duì)照（不 加入肽的細(xì)胞）的平均活力％ 土標(biāo)準(zhǔn)差（SD)，n = 3)。
[0064] 圖3H為描繪源自gp41的肽（SEQ ID NO: 3)的溶血活性的柱形圖。紅細(xì)胞與IOOii M 的肽（SEQ ID N0:3) -起孵育1小時(shí)。（結(jié)果是平均值土SD，n = 8?林p〈0. 01)。
[0065] 圖31描繪了 SEQ ID NO: 3的肽以及具有基序相關(guān)的突變SEQ ID NO:9和10的肽 的氨基酸序列。保守的Trp殘基和保守的酸性殘基（Glu和Asp)被突變?yōu)镚ly。
[0066] 圖3J是描繪通過(guò)5 ii M和10 ii M的遞增濃度（分別以灰色和黑色表示）的本發(fā) 明的肽（從左到右為SEQ ID N0:3、9和10)抑制M0G35-55特異性T細(xì)胞增殖的柱形圖。 **p〈0.01。
[0067] 圖4A-B顯示利用共聚焦顯微術(shù)觀察到的源自gp41的p印6肽（SEQ ID NO: 3)與 mM0G35-55T細(xì)胞（A)和Jurkat T細(xì)胞（B)的T細(xì)胞膜的共定位；左欄是單獨(dú)的NBD-p印6 的熒光。中間欄為細(xì)胞質(zhì)或膜染料的熒光。右欄為它們之間合并的圖像。比例尺等于2 y M。
[0068] 圖4C是描繪p印6 (SEQ ID NO: 3)與T細(xì)胞的細(xì)胞膜（黑色）或與細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) (灰色）之間的共定位的百分比土SD的柱形圖。**p〈0. 01。
[0069] 圖4D是描繪p印6-膜相互作用的熒光測(cè)量的線形圖。
[0070] 圖4E描繪了突光標(biāo)記的肽（對(duì)照-抗微生物的非相關(guān)肽（antimicrobial not-realted p印tide);全部的 L 肽-SEQ ID NO: 2;全部的 D 肽-SEQ ID NO: 11)與來(lái)源于 小鼠脾細(xì)胞的T細(xì)胞淋巴細(xì)胞的結(jié)合。
[0071] 圖5A是描繪了通過(guò)以下劑抑制在源自gp41的肽（SEQ ID N0:3 ;liiM)存在下活 化的M0G35-55特異性T細(xì)胞增殖的柱形圖：（l)M0G35-55抗原和APC ; (2)⑶3和⑶28抗體 (2iig/ml)以及（3)PMA(50ng/ml)和離子霉素（liiM)。
[0072] 圖5B是Iii M熒光標(biāo)記的Rho-p印6 (SEQ ID NO: 3 ;柱2)、Rho標(biāo)記的突變體肽（SEQ ID N0:9;柱3)和不含肽（柱1)與T細(xì)胞蛋白的相互作用的生化分析。肌動(dòng)蛋白水平作為 對(duì)照示出。
[0073] 圖5C是顯示基于Rho-p印6與TCR a或GFP的抗體的免疫沉淀的Rho強(qiáng)度的柱形 圖。
[0074] 圖OT-E描繪了利用共聚焦顯微術(shù)，（D) Rho標(biāo)記的p印6 (SEQ ID NO: 3)或（E)Rho 標(biāo)記的對(duì)照肽AMP (SEQ ID NO: 13)與細(xì)胞TCR a的共定位。比例尺等于2 iiM。
[0075] 圖5F是顯示TCRa與肽（p印6或AMP)之間的共定位百分比土SD的柱形圖。 **p〈0.Ol0
[0076] 圖5G是顯示p印6(SEQ ID N0:3)在脂質(zhì)環(huán)境中形成a-螺旋結(jié)構(gòu)的線形圖。肽 和其突變體（W/G) (SEQ ID NO:9)在含1 %溶血磷脂酰膽堿的HEPES中的圓二色譜。
[0077] 圖5H描繪了顯示加入若干連續(xù)劑量的p印6(SEQ ID N0:3)和對(duì)照突變體肽 (SNKSLEQIWNHTTWMGWG;SEQ ID N0:10)和（SNKSLEQIGNHTTGME⑶；SEQ ID N0:9)后，NBD 標(biāo) 記的1'〇?^1?的核心肽饑1?11^1^深0 10勵(lì):14)的膜結(jié)合狀態(tài)的變化的熒光實(shí)驗(yàn)。熒 光光譜在40:1至5:1范圍（分別對(duì)應(yīng)藍(lán)線直至黑線）的不同NBD標(biāo)記的CP/HIV肽的比的 情況下獲得。
[0078] 圖6A是顯示向C57B1小鼠施用本發(fā)明的肽（SEQ ID N0:3)之后離體（ex vivo) 下調(diào)致腦炎M0G35-55反應(yīng)性T細(xì)胞的柱形圖。
[0079] 圖6B-D是顯示IFN Y (B)、TNFa (C)和IL-12 (D)促炎性細(xì)胞因子從來(lái)源于施用 PBS或p印6 (SEQ ID NO: 3)的EAE小鼠的培養(yǎng)的LNC分泌的柱形圖。
[0080] 圖6E是顯示了在施用PBS( ?)或0? 5mg/kg p印6(SEQ ID NO:3) ( )的小鼠中 誘導(dǎo)臨床EAE的線形圖，n = 10只小鼠/組。每日額定臨床評(píng)分（daily rated clinical score)是平均值土SE。結(jié)果來(lái)自（兩次實(shí)驗(yàn)中的）代表性實(shí)驗(yàn)。
[0081] 圖 6F 是顯示肽（全部的 L-SEQ ID NO:2 ;全部的 D-SEQ ID NO: 11)施用（0? 5mg/ kg)后離體下調(diào)致腦炎反應(yīng)性T細(xì)胞的柱形圖。結(jié)果是平均值土SD。使用非相關(guān)肽作為對(duì) 照。
[0082] 發(fā)明詳述
[0083] 本發(fā)明提供了包含來(lái)源于HIV gp41胞外域的氨基酸序列的肽，特別是來(lái)源于CHR 和CHR近端區(qū)域的肽，以及包含其的藥物組合物，該藥物組合物有效預(yù)防或治療T細(xì)胞介導(dǎo) 的疾病和紊亂包括但不限于炎性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥。
[0084] CHR 區(qū)域大致位于 gpl60HIV-lHXB2 株（Genbank 登錄號(hào) K03455)的氨基酸 629-661 之間。如本文使用的"CHR近端區(qū)域"是指與CHR的氨基末端鄰接，即在環(huán)區(qū)域內(nèi)的至少3 個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，來(lái)源于CHR和CHR近端區(qū)域的肽包含對(duì)應(yīng)于gpl60的氨基 酸615-637的氨基酸序列或其類似物或片段。
[0085] 如下文例證的，來(lái)源于HIV ENV的gp41亞基、特別地來(lái)源于CHR和CHR近端區(qū)域 的新的保守元件（SEQ ID NO: 2,本文也稱為基序），能夠抑制T細(xì)胞活化。本文實(shí)施例2支 持并公開(kāi)了由本發(fā)明的肽發(fā)揮的免疫抑制作用。如本文例證的，肽抑制M0G(髓鞘少突膠質(zhì) 細(xì)胞糖蛋白）抗原特異性的T細(xì)胞活化和增殖（圖3A和圖4)以及促炎性細(xì)胞因子的釋 放。本文公開(kāi)的結(jié)果表明這些肽在自身免疫性疾病諸如多發(fā)性硬化癥中作為免疫抑制化合 物的作用，在自身免疫性疾病中，T細(xì)胞將髓鞘識(shí)別為外來(lái)物并攻擊它。此外，用本發(fā)明的 肽處理的EAE誘導(dǎo)的小鼠顯示疾病的顯著減輕（實(shí)施例5)。
[0086] 盡管以前報(bào)道過(guò)來(lái)自HIV_lgp41的不同的肽能夠抑制T細(xì)胞活化，但是本發(fā)明的 肽表現(xiàn)出獨(dú)特的和有益的性質(zhì)。這些肽比報(bào)道的來(lái)自HIV-IENV的最強(qiáng)的肽效力高約20倍 (表1)。此外，這些肽表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的最小毒性。如實(shí)施例2中例證的，在測(cè)試的最高濃度 下（其IC5tl的50倍），這些肽依然沒(méi)有毒性（圖3G)。此外，本發(fā)明的肽比其他源自gp41 的免疫抑制肽（例如，gp41的FP和TMD)更不疏水，并因此更易溶于水溶液。此外，所述肽 與另一種免疫抑制元件ISU相互作用，顯示協(xié)同抑制作用。
[0087] 在一些實(shí)施方案中，提供了包含氨基酸序列HTTWMEWD(SEQ ID N0:1)的8-30 個(gè)氨基酸的分離的肽，或其類似物、衍生物或鹽。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽選自 由以下組成的組：WNHTTWMEWD(SEQ ID N0:2)、SNKSLEQIWNHTTWMEWD(SEQ ID N0:3)、 EQIWNHTTWMEWDREINN(SEQ ID N0:4)，或其類似物、衍生物或鹽。
[0088] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"肽"包括天然肽（降解產(chǎn)物、合成肽或重組肽）、肽模擬物 (peptidomimetics)(典型地包括非肽鍵或其他合成修飾）以及肽類似物類肽和半類肽，以 及還可具有例如使得肽在體內(nèi)時(shí)更穩(wěn)定或更容易滲透進(jìn)入細(xì)胞的修飾。這些肽典型地由約 3到約50個(gè)氨基酸組成。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，本發(fā)明的肽由6-50個(gè)氨基酸、7-45個(gè) 氨基酸、8-40個(gè)氨基酸、8-35個(gè)氨基酸、8-30個(gè)氨基酸、10-30個(gè)氨基酸、10-28個(gè)氨基酸、 10-26個(gè)氨基酸、10-24個(gè)氨基酸、10-22個(gè)氨基酸、10-20個(gè)氨基酸或10-18個(gè)氨基酸組成， 其中每種可能性都代表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0089] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的肽由至少8個(gè)氨基酸、至少9個(gè)氨基酸或至少10 個(gè)氨基酸組成，其中每種可能性都代表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0090] 根據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的肽由至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、 至多28個(gè)氨基酸、至多26個(gè)氨基酸、至多25個(gè)氨基酸、至多24個(gè)氨基酸、至多23個(gè)氨基 酸、至多22個(gè)氨基酸、至多21個(gè)氨基酸、至多20個(gè)氨基酸、至多19個(gè)氨基酸、至多18個(gè)氨 基酸組成，其中每種可能性都代表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0091] 術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白"在本文可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適 用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué) 類似物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0092] 術(shù)語(yǔ)"分離的"肽是指基本上不含污染的細(xì)胞組分諸如碳水化合物、脂質(zhì)或其他與 天然肽絡(luò)合的蛋白雜質(zhì)的肽。典型地，分離的肽制品含有呈高度純化形式的肽，即，至少約 80 %的純度、至少約90 %的純度、至少約95 %的純度、大于95 %的純度、或大于99 %的純 度。
[0093] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的肽的片段、類似物和化學(xué)修飾形式，只要它們能夠調(diào)節(jié) (例如降低或抑制）T細(xì)胞活性。
[0094] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述類似物包括至少一個(gè)Trp(W)殘基被選自Ile(I)、 Leu(L)和Gly(G)的氨基酸的取代。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述類似物包括至少一個(gè) Trp(W)殘基被選自Ile(I)和Leu (L)的氨基酸的取代。
[0095] 根據(jù)具體實(shí)施方案，所述取代在選自由SEQ ID NO: 1的位置3-8處的殘基組成的 組的殘基處。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方案，所述取代在選自由SEQ ID NO:2的位置1、2、5-10 處的殘基組成的組的殘基處。
[0096] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的肽的類似物相對(duì)于SEQ ID NO: 1包括1-3個(gè)氨基酸 修飾，其中每個(gè)氨基酸修飾獨(dú)立地選自由取代、插入和缺失組成的組。根據(jù)一些實(shí)施方案， 本發(fā)明的肽的類似物相對(duì)于SEQ ID NO:2包括1-3個(gè)氨基酸修飾，其中每個(gè)氨基酸修飾獨(dú) 立地選自由取代、插入和缺失組成的組。
[0097] 根據(jù)具體實(shí)施方案，插入的是帶電荷的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方案，取代是 針對(duì)帶電荷的氨基酸。帶有正電荷側(cè)鏈的氨基酸（堿性氨基酸）包括精氨酸（R)、賴氨酸 (K)和組氨酸（H)。帶有負(fù)電荷側(cè)鏈的氨基酸包括天冬氨酸（D)和谷氨酸（E)。
[0098] 根據(jù)特定實(shí)施方案，所述取代是保守取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉對(duì)肽或蛋白序 列的個(gè)別（individual)取代、缺失或添加是保守修飾的變體，所述個(gè)別取代、缺失或添加 改變、添加或缺失編碼序列中的單個(gè)氨基酸或小部分氨基酸，其中這種改變導(dǎo)致具有相似 的電荷、大小、和/或疏水性特征的氨基酸的取代，例如，谷氨酸（E)至天冬氨酸（D)的取 代。本領(lǐng)域公知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。
[0099] 以下6組各含有對(duì)彼此是保守取代的氨基酸：
[0100] 1)丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T);
[0101] 2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E);
[0102] 3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q);
[0103] 4)精氨酸（R)、賴氨酸⑷；
[0104] 5)異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、繳氨酸（V);和
[0105] 6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)(參見(jiàn)例如，Creighton, Proteins, 1984)。
[0106] 術(shù)語(yǔ)"類似物"包括具有與本文所具體顯示的序列之一基本相同的氨基酸序列的 任何肽，其中一個(gè)或更多個(gè)殘基被功能相似的殘基保守取代，且所述肽表現(xiàn)出如本文所述 的能力。保守取代的實(shí)例包括一個(gè)非極性（疏水）殘基諸如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲 硫氨酸被另一個(gè)非極性（輸水）殘基的取代；一個(gè)極性（親水）殘基被另一個(gè)極性（親水） 殘基的取代，諸如精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、甘氨酸和絲氨酸之間的 取代；一個(gè)堿性殘基諸如賴氨酸、精氨酸或組氨酸被另一個(gè)堿性殘基的取代；或一個(gè)酸性 殘基諸如天冬氨酸或谷氨酸被另一個(gè)酸性殘基的取代。每種可能性都代表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí) 施方案。
[0107] 短語(yǔ)"保守取代"還包括使用化學(xué)衍生化的殘基取代非衍生化的殘基，只要此肽表 現(xiàn)出如本文具體描述的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的先天反應(yīng)的必要功能。
[0108] 術(shù)語(yǔ)"來(lái)源于"或"對(duì)應(yīng)于"是指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法例如按 照本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方案的化學(xué)合成，基于序列知識(shí)構(gòu)建肽。來(lái)源于或?qū)?yīng)于HIV gpl60(gp41CHR 和CHR近端區(qū)域）的氨基酸615-637的肽，可以是gpl60的天然氨基酸615-637的類似物、 片段、共軛物或衍生物，和其鹽，只要所述肽保留其抑制T細(xì)胞活化的能力。
[0109] 根據(jù)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的肽不包含Asn殘基作為SEQ ID NO: 2的位置3處的 His殘基的取代物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，類似物不包含Met殘基作為SEQ ID NO: 2的位置 4處的Thr殘基的取代物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述類似物不包含Asn-Met作為SEQ ID NO:2的位置3-4處的His-Thr的取代物。
[0110] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述類似物與SEQ ID NO: 1具有至少75%序列同一性。根 據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述類似物與SEQ ID NO: 1具有至少85%序列同一性。
[0111] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述類似物與SEQ ID NO:2具有至少70%序列同一性。根 據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述類似物與SEQ ID N0:2具有至少80%序列同一性。根據(jù)另一個(gè)實(shí) 施方案，所述類似物與SEQ ID N0:3具有至少90%序列同一性。
[0112] 百分比序列同一性可在比對(duì)序列后通過(guò)例如Needleman等（Needleman等，工1\1〇1. Biol. 48:443-453 (1970))描述的 Fitch 等版本的算法（Fitch 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1382-1386(1983))來(lái)確定，以提供最大同源性。任選地，兩條序列之間的百分比 同一性的確定可使用 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 的數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。這樣的算法被合并到Altschul等?（1990) J. MoL Biol. 215, 403-410的 BLASTP程序中。用BLASTP程序進(jìn)行BLAST蛋白檢索以獲得與SEQ ID N0:4同源的氨基酸 序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對(duì)（gapped alignments),使用如在Altschul 等（1997)Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 中描述的 Gapped BLAST。當(dāng)使用 BLAST 和 Gapped BLAST程序時(shí)，使用各程序（例如，XBLAST)的缺省參數(shù)。
[0113] 典型地，本發(fā)明包括肽的衍生物。術(shù)語(yǔ)"衍生物"或"化學(xué)衍生物"包括具有通過(guò) 側(cè)鏈或官能團(tuán)的反應(yīng)化學(xué)衍生化的一個(gè)或更多個(gè)殘基的肽的任何化學(xué)衍生物。這種衍生 化的分子包括例如其中游離氨基已被衍生化的那些分子。胺衍生物的實(shí)例包括胺鹽酸鹽、 對(duì)-甲苯磺?；鶊F(tuán)、芐氧羰基基團(tuán)、叔-丁氧羰基基團(tuán)、氯乙酰基基團(tuán)或甲?；鶊F(tuán)。游 離的羧基基團(tuán)可被衍生化以形成鹽、甲酯和乙酯或其他類型的酯、胺或酰肼類。游離的羥 基可被衍生化以形成〇-?；颟?烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可被衍生化以形成N-咪 唑-節(jié)基組氨酸（N-im-benzylhistidine)。包含20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸殘基中的一個(gè)或更多個(gè) 天然存在氨基酸衍生物的那些肽也被包括作為化學(xué)衍生物。例如：4_羥基脯氨酸可取代為 脯氨酸；5-羥基賴氨酸可取代為賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代為組氨酸；高絲氨酸可取代 為絲氨酸；且鳥(niǎo)氨酸可取代為賴氨酸。
[0114] 另外，肽衍生物可通過(guò)化學(xué)修飾修飾包括但不限于末端-NH2?；⒁阴；驇€基 乙酸酰胺化和通過(guò)例如使用氨、甲胺等的末端羧基酰胺化，而與本發(fā)明肽的天然序列不同。 這些肽可以呈線性、環(huán)狀或支鏈等，這些構(gòu)象可使用本領(lǐng)域公知的方法獲得。
[0115] 根據(jù)本發(fā)明原理的肽衍生物和類似物還可包括側(cè)鏈鍵修飾，包括但不限 于-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S = 0、0 = C-NH-、-CH2-〇-、-CH2-CH2-、S = C-NH-、和-CH = CH-，以及骨架修飾諸如修飾的肽鍵。肽中的肽鍵（-C0-NH-)可被以下取代：例如N-甲 基化的鍵（-N (CH3)-CO-)、酯鍵（-C(R)H-C-O-O-C(R)H-N)、酮亞甲基鍵（-CO-CH2-)、 a -氮雜鍵（-NH-N (R) -CO-)，其中R是任何烷基，例如甲基；carba鍵（-CH2-NH-)、羥基 亞乙基鍵（-CH (OH) -CH2-)、硫代酰胺鍵（-CS-NH)、烯雙鍵（-CH = CH-)以及肽衍生物 (-N(R)-CH2-CO-),其中R是天然存在于碳原子上的"正常"側(cè)鏈。這些修飾可發(fā)生在沿肽鏈 的一個(gè)或更多個(gè)鍵處并甚至同時(shí)在若干（例如2-3個(gè)）鍵處。
[0116] 本發(fā)明還包括其中游離氨基被衍生化以形成胺鹽酸鹽、對(duì)-甲苯磺酰氨基基團(tuán)、 芐氧羰基氨基基團(tuán)、叔-丁氧羰基氨基基團(tuán)、氯乙酰氨基基團(tuán)或甲酰氨基基團(tuán)的肽衍生物 和類似物。游離的羧基基團(tuán)可被衍生化以形成例如鹽、甲酯和乙酯或其他類型的酯、胺或酰 肼類。組氨酸的咪唑氮可被衍生化以形成N-咪唑-芐基組氨酸。
[0117] 肽類似物還可包含非天然氨基酸。非天然氨基酸的實(shí)例包括但不限于肌氨酸 (Sar)、正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高絲氨酸、異丙基Lys、3_(2' -萘基）_Ala、 煙基Lys、氨基異丁酸和3-(3' -吡啶基-Ala)。
[0118] 此外，肽類似物可包含其他衍生化的氨基酸殘基，包括但不限于甲基化的氨基酸、 N-芐基化的氨基酸、0-芐基化的氨基酸、N-乙?；陌被?、0-乙酰化的氨基酸、芐氧羰 基取代的氨基酸等等。具體實(shí)例包括但不限于甲基-Ala(MeAla)、MeTyr、MeArg、MeGlu、 MeVal、MeHi s、N-乙?；?Lys、0-乙酰基-Lys、芐氧羰基-Lys、Tyr-O-芐基、Glu-O-芐基、 芐基-His、Arg-甲苯磺酰基、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸等 等。
[0119] 術(shù)語(yǔ)"衍生物"還可包括具有疏水（例如，脂肪酸）部分的化學(xué)衍生物。
[0120] 本發(fā)明還包括肽類似物，其可含有一個(gè)或更多個(gè)D-異構(gòu)體形式的氨基酸。其中至 少一個(gè)氨基酸或可能所有氨基酸為D-氨基酸的反向-倒轉(zhuǎn)（retro-inverso)D-氨基酸肽 的制備是本領(lǐng)域公知的。當(dāng)肽中所有氨基酸都是D-氨基酸且該分子的N末端和C末端是 倒轉(zhuǎn)的，則產(chǎn)生與該分子的L-氨基酸形式在相同位置處具有相同結(jié)構(gòu)基團(tuán)的分子。然而， 該分子在蛋白降解中更為穩(wěn)定，并因此可用于本文記載的許多應(yīng)用。在特定實(shí)施方案中，本 發(fā)明的肽的所有氨基酸都為D-氨基酸。
[0121] 根據(jù)特定實(shí)施方案，本發(fā)明的肽是非對(duì)映的肽。非對(duì)映的肽由于其更高的水溶性、 更低的免疫原性（參見(jiàn)，例如 Benkirane, N?等，1993, J. Biol. Chem. 268:26279-26285)、以 及對(duì)蛋白降解的更低的敏感性，高度優(yōu)于具有相同氨基酸序列的全部L-或全部D-氨基酸 肽。此類特性賦予非對(duì)映的肽具有比那些包含相同氨基酸序列的全部L-或全部D-氨基酸 肽更高的功效和更高的生物利用度。
[0122] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"非對(duì)映的肽"是指包含L-氨基酸殘基和D-氨基酸殘基兩者的 肽。本發(fā)明的非對(duì)映的肽中的D-氨基酸殘基的數(shù)目和位置可以是可變的，只要肽能夠調(diào)節(jié) 免疫系統(tǒng)的先天反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，肽包含至少2個(gè)D-氨基酸殘基、至少3個(gè)D-氨 基酸殘基、至少4個(gè)D-氨基酸殘基、至少5個(gè)D-氨基酸殘基、至少6個(gè)D-氨基酸殘基、至 少7個(gè)D-氨基酸殘基、至少8個(gè)D-氨基酸殘基、至少9個(gè)D-氨基酸殘基，其中每種可能性 都代表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0123] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，至少一個(gè)D氨基酸位于選自肽的N末端、C末端或兩者 的位置處。根據(jù)具體實(shí)施方案，非對(duì)映的肽的肽由如SEQ ID N0:5所列的氨基酸序列 SNKSLEQIWNHTTWMEWI1 組成，其中 $ 為 D-Ser 且 2 為 D-Asp。
[0124] 可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)合成或制備本發(fā)明的肽?？赏ㄟ^(guò)Merrifield的 固相肽合成方法合成肽（參見(jiàn)J. Am. Chem. Soc.，85:2149, 1964)?？蛇x地，可使用 本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)溶液方法（參見(jiàn)，例如，Bodanszky, M，Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984)或通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于肽合成的任何其他方法合成 本發(fā)明的肽。
[0125] 一般而言，這些方法包括向結(jié)合至合適的樹(shù)脂上的生長(zhǎng)的肽鏈順序添加一個(gè)或更 多個(gè)氨基酸或合適的受保護(hù)的氨基酸。
[0126] 通常，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基基團(tuán)被合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。然后，可將受保 護(hù)的或衍生化的氨基酸附著于惰性固相支持物（樹(shù)脂）或在有利于形成酰胺鍵的條件下通 過(guò)添加具有被合適保護(hù)的互補(bǔ)（氨基或羧基）基團(tuán)的序列中的下一個(gè)氨基酸在溶液中利 用。然后，將保護(hù)基團(tuán)從新添加的氨基酸殘基上去除并添加（被合適保護(hù)的）下一個(gè)氨基 酸等等。所有期望的氨基酸以合適的順序被連接后，順序或同時(shí)去除任何剩余的保護(hù)基團(tuán)， 且如果通過(guò)固相方法合成，則將肽鏈從固相支持物上裂解以提供最后的肽。
[0127] 在固相肽合成方法中，氨基酸的a-氨基基團(tuán)被酸或堿敏感性基團(tuán)保護(hù)。此類保 護(hù)基團(tuán)應(yīng)具有在肽鍵形成的條件下是穩(wěn)定的而在不損害生長(zhǎng)的肽鏈的情況下容易可去除 的特性。適合的保護(hù)基團(tuán)是叔-丁氧羰基（BOC)、芐氧羰基（Cbz)、聯(lián)苯基異丙基氧羰基、 叔-戊氧撰基、異冰片基氧撰基、（a, a)_二甲基_3, 5-二甲基氧節(jié)基氧撰基、鄰硝基苯基 亞磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基、9-芴基甲基氧羰基（FMOC)等等。BOC或FMOC保護(hù)基團(tuán)是 優(yōu)選的。
[0128] 在固相肽合成方法中，將C末端氨基酸附著于合適的固相支持物?？捎糜谝陨虾?成的合適的固體支持物是對(duì)在逐步的縮合_去保護(hù)反應(yīng)的試劑和反應(yīng)條件下為惰性的、以 及在所用的溶劑介質(zhì)中是不溶的那些材料。合適的固體支持物為氯甲基聚苯乙烯-二乙烯 基苯聚合物、羥甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等等。偶聯(lián)反應(yīng)是在溶劑諸如乙醇、乙 腈、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)等等中完成。如本領(lǐng)域公知的，連續(xù)的受保護(hù)的氨基酸的偶 聯(lián)可在自動(dòng)多肽合成儀中進(jìn)行。
[0129] 可選擇地，本發(fā)明的肽可被合成使得連接肽的氨基酸殘基的一個(gè)或更多個(gè)鍵為非 肽鍵。這些可選擇的非肽鍵包括但不限于亞氨基、酯、酰肼、氨基脲、以及偶氮鍵，其可通過(guò) 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的反應(yīng)形成。
[0130] 通過(guò)重組技術(shù)制備的本發(fā)明的肽、其類似物或衍生物可被純化使得當(dāng)向受試者施 用時(shí)，所述肽將是基本上純的。術(shù)語(yǔ)"基本上純的"是指已從天然與其一起存在的成分中被 分離出來(lái)的化合物例如肽。典型地，當(dāng)樣品中所有物質(zhì)的至少50%、優(yōu)選地至少75%、更優(yōu) 選地至少90%、且最優(yōu)選地至少99% (以體積、以濕重或干重、或以摩爾百分比或摩爾分?jǐn)?shù) 計(jì)）是目的肽時(shí)，那么肽是基本上純的。純度可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量，例如，在肽的情 況下，可通過(guò)HPLC分析測(cè)量純度。
[0131] 肽共軛物被包括在本發(fā)明的范圍中，所述肽共軛物包括在其氨基或羰基末端或在 一條側(cè)鏈上經(jīng)由肽鍵與不同蛋白的氨基酸序列連接的本發(fā)明的肽、其衍生物或類似物。另 外地或可選擇地，本發(fā)明的肽、其衍生物或類似物可與另一個(gè)部分諸如例如脂肪酸、糖部 分、精氨酸殘基、疏水部分和促進(jìn)膜或細(xì)胞滲透的任何已知部分連接。包含本發(fā)明的肽和蛋 白的共軛物可通過(guò)蛋白合成制備，例如通過(guò)使用肽合成儀、或通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法將編 碼期望的氨基酸序列的適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄斜舜诉B接符合正確的編碼框并通過(guò)本領(lǐng)域普遍 已知的方法表達(dá)該共軛物。
[0132] 為了提供本發(fā)明肽通過(guò)其可方便地與載體結(jié)合的"接頭"的目的，可在本發(fā)明肽的 任一末端添加氨基酸殘基。此類接頭通常具有至少1個(gè)氨基酸殘基并可具有40個(gè)或更多 的殘基，通常為具有1到10個(gè)殘基。用于連接的典型氨基酸殘基是酪氨酸、半胱氨酸、賴氨 酸、谷氨酸和天冬氨酸等等。
[0133] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的肽、或其類似物或共軛物的分離的 多核苷酸序列，本發(fā)明的肽、或其類似物或共軛物抑制T細(xì)胞活性，從而可用于治療T細(xì)胞 介導(dǎo)的疾病和紊亂。
[0134] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是指脫氧核糖核酸（DNA)、核糖核酸（RNA)或其組合的聚合物，其 可來(lái)源于任何來(lái)源，可以呈單鏈或雙鏈，且可任選地包括能夠摻入DNA或RNA聚合物中的合 成的、非天然的、或改變的核苷酸。
[0135] "分離的多核苷酸"是指已從天然存在狀態(tài)下在其側(cè)翼的序列中被分離出來(lái)的多 核苷酸區(qū)段或片段，例如，已從通常與該片段毗連的序列，例如在其天然存在的基因組中與 該片段毗連的序列中移出的DNA片段。該術(shù)語(yǔ)還適用于已從其他成分中被基本上純化的多 核苷酸，所述成分在細(xì)胞中天然地與多核苷酸一起存在，例如RNA、或DNA或蛋白。因此，該 術(shù)語(yǔ)包括諸如摻入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒、或原核生物或真核生物基因組DNA中的重 組DNA，或作為獨(dú)立于其他序列的單獨(dú)的分子（例如，作為由PCR或限制酶消化產(chǎn)生的cDNA 或基因組或cDNA片段）存在的重組DNA。其還包括編碼另外的多肽序列的雜合基因的部分 的重組DNA，以及RNA例如mRNA。
[0136] 術(shù)語(yǔ)"編碼"是指分離的多核苷酸中具體核苷酸序列例如基因、cDNA或mRNA用作 用于合成生物過(guò)程中的其他聚合物和大分子的模板的固有特性以及由此產(chǎn)生的生物學(xué)特 性，所述其他聚合物和大分子具有確定的核苷酸序列（即rRNA、tRNA和mRNA)或確定的氨 基酸序列。因此，在細(xì)胞或其他生物體系中，如果對(duì)應(yīng)于基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生肽 或蛋白，則該基因編碼該肽或蛋白。編碼鏈，與mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核 苷酸序列，和用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈，二者都可被稱為編碼肽或蛋白或該基 因的其他產(chǎn)物或cDNA。
[0137] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性和如由所謂的"Wobble規(guī)則"提供 的允許在密碼子第三個(gè)位置處的經(jīng)典堿基配對(duì)的例外，多于一種多核苷酸可編碼任何給定 的肽或蛋白。預(yù)期本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸及其任何類似物。
[0138] 本發(fā)明的多核苷酸還可表達(dá)為分泌的肽，其中本發(fā)明的肽或其類似物從其中包含 該多核苷酸的宿主細(xì)胞所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中分離出，或多核苷酸可通過(guò)缺失前導(dǎo)肽或其他肽 表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)的肽，在這種情況下可從宿主細(xì)胞中分離本發(fā)明的肽或其類似物。然后，通過(guò) 本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化方法純化本發(fā)明的肽或其類似物。
[0139] 還可通過(guò)將包含編碼本發(fā)明的肽、或其類似物的分離的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)移 至與目的組織相關(guān)的細(xì)胞，而向目的組織提供本發(fā)明的肽、其類似物或衍生物。細(xì)胞產(chǎn)生肽 使得其可合適地提供給組織內(nèi)的細(xì)胞以發(fā)揮生物活性，例如降低或抑制目的組織中的炎癥 過(guò)程。
[0140] 根據(jù)本發(fā)明原理的表達(dá)載體還包括啟動(dòng)子。在本發(fā)明的環(huán)境中，啟動(dòng)子必須能夠 驅(qū)動(dòng)肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。許多病毒啟動(dòng)子適于在此表達(dá)載體中使用（例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒ITR、 LTR、立即早期病毒啟動(dòng)子（IEp)(例如，孢疹病毒IEp(例如，ICP4-IEp和ICPO-IEp)和 巨細(xì)胞病毒（CMV) IEP)，和其他病毒啟動(dòng)子（例如，晚期病毒啟動(dòng)子、潛伏期活性的啟動(dòng)子 (latency-active promoter, LAP)、勞斯肉瘤病毒（RSV)啟動(dòng)子和鼠白血病病毒（MLV)啟動(dòng) 子）。其他適合的啟動(dòng)子為包含增強(qiáng)子序列（例如，兔￠-珠蛋白調(diào)節(jié)元件）的真核啟動(dòng) 子、組成型活性啟動(dòng)子（例如，￠-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等）、信號(hào)和/或組織特異性啟動(dòng)子（例 如，誘導(dǎo)型和/或抑制型啟動(dòng)子，例如響應(yīng)TNF或RU486的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子等）、 以及腫瘤特異性啟動(dòng)子。
[0141] 在表達(dá)載體中，編碼本發(fā)明的肽或其類似物的多核苷酸與啟動(dòng)子可操作地連接， 使得啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)多核苷酸的表達(dá)。只要保持該可操作的連接，表達(dá)載體可包括多于一 種基因，例如通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)隔開(kāi)的多個(gè)基因。此外，表達(dá)載體可任選地 包括其他元件，例如剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件（例如，增強(qiáng)子、沉默子等）、 或其他序列。
[0142] 將表達(dá)載體以使得其能夠表達(dá)編碼本發(fā)明的肽或本文包含的其類似物的分離的 多核苷酸的方式引入細(xì)胞。可使用任何合適的載體，其中很多為本領(lǐng)域已知的。此類載 體的實(shí)例包括裸DNA載體（諸如寡核苷酸或質(zhì)粒）、病毒載體諸如腺相關(guān)病毒載體（Berns 等，1995, Ann. N. Y. Acad. Sci. 772:95-104,在此通過(guò)引用將其全文并入）、腺病毒載體、 皰疫病毒載體（Fink 等，1996, Ann. Rev. Neurosci. 19:265-287)、包裝擴(kuò)增子（FederofT 等，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1636-1640,在此通過(guò)引用將其全文并入）、乳頭瘤 病毒載體、小核糖核酸病毒載體、多瘤病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、SV40病毒載體、牛痘病毒 載體和其他載體。此外，載體還可包括其他基因元件，諸如例如，編碼可選擇標(biāo)志物（例如， 3 -gal或賦予對(duì)毒素抗性的標(biāo)志物）、藥理活性蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、或其他生物活性物質(zhì)的基 因。
[0143] 用于操作包含分離的多核苷酸的載體的方法是本領(lǐng)域公知的（例如，Sambrook 等，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Press, 在此通過(guò)引用將其全文并入），并包括直接克隆、使用重組酶的位點(diǎn)特異性重組、同源重組、 和構(gòu)建重組載體的其他適合方法。以這種方式，可構(gòu)建表達(dá)載體使得其可在任何期望的細(xì) 胞中復(fù)制、在任何期望的細(xì)胞中表達(dá)、以及甚至可整合到任何期望的細(xì)胞的基因組中。
[0144] 通過(guò)適于將DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的任何方式將包括目的多核苷酸的表達(dá)載體引入細(xì)胞。 本領(lǐng)域公知很多此類方法（例如，Sambrook等，同上；還參見(jiàn)Watson等，1992, Recombinant DNA,第2版第12章 ，Scientific American Books,在此通過(guò)引用將其全文并入）。因此， 在原核細(xì)胞的情況下，可通過(guò)例如電穿孔、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、或遷移（mobilization)實(shí)現(xiàn) 載體引入。對(duì)于真核細(xì)胞而言，可通過(guò)使用例如電穿孔、轉(zhuǎn)染、感染、DNA包被的微粒、或原 生質(zhì)體融合將載體引入。表達(dá)載體可被引入其中的真核細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于卵細(xì)胞、 干細(xì)胞、胚細(xì)胞等等。
[0145] 如果必要的話，可使用在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的多核苷酸已被轉(zhuǎn)入其中的細(xì)胞作 為瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體。然后，可將此類細(xì)胞本身轉(zhuǎn)入受試者以在其中提供治療益處。。因 此，細(xì)胞可 被轉(zhuǎn)入受試者的部位，使得本發(fā)明的肽在其中表達(dá)并從其中分泌，并因此減少或抑制例如T 細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)程以改善受試者的臨床狀況?？蛇x地，特別是在載體已被體外加入其中的細(xì) 胞的情況下，該細(xì)胞可以首先經(jīng)受幾輪克隆選擇（通常通過(guò)使用載體內(nèi)的可選擇標(biāo)志物序 列而方便地進(jìn)行）以選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。此類穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體然后被轉(zhuǎn)入受試者優(yōu)選地人中以在 其中提供治療益處。
[0146] 編碼本發(fā)明的肽或其類似物的多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并任選地被分泌?？墒褂?標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)多核苷酸的成功表達(dá)（例如，Northern雜交、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉 淀、酶免疫測(cè)定等）。
[0147] 本發(fā)明包括包含編碼本發(fā)明肽的分離的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0148] 藥物纟目合物
[0149] 本發(fā)明提供了包含治療有效量的本發(fā)明的肽作為活性成分和藥學(xué)上可接受的載 體的藥物組合物。
[0150] 可配制本發(fā)明的藥物組合物呈本發(fā)明的肽、其類似物或衍生物的藥學(xué)上可接受的 鹽的形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與游離氨基形成的那些鹽例如來(lái)源于無(wú)毒的無(wú)機(jī)酸或 有機(jī)酸例如鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，和與游離羧基基團(tuán)形成的那些鹽例如來(lái) 源于無(wú)毒的無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙 胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的鹽。
[0151] 術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"是指適于向受試者例如人施用。例如，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接 受的"可指經(jīng)聯(lián)邦或州政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國(guó)藥典或用于在動(dòng)物且更特別地在人中 使用的其他普遍認(rèn)可的藥典中列出的。術(shù)語(yǔ)"載體"是指治療性化合物與其一起被施用的 稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥物載體可以為無(wú)菌液體例如水或油包括石油、動(dòng) 物、植物或合成來(lái)源的油例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等，聚乙二醇，甘油，丙二醇 或其他合成的溶劑。當(dāng)靜脈施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。還可使用鹽水溶液以及 右旋糖和甘油水溶液作為液體載體，特別地用于注射溶液。適合的藥物賦形劑包括淀粉、葡 萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯 化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要的話，組合物還可包含少量的潤(rùn)濕劑 或乳化劑、或PH緩沖劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。還可設(shè)想抗菌劑諸如芐醇或?qū)αu 基苯甲酸甲酯、抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉、以及用于調(diào)節(jié)張力（tonicity)的劑 諸如氯化鈉或右旋糖。
[0152] 組合物可呈溶液、混懸劑、乳化劑、片劑、丸劑、膠囊、粉末、凝膠、膏（cream)、軟膏 (〇intment)、泡沫、糊劑、緩釋制劑等的形式。可使用傳統(tǒng)的粘合劑和載體諸如甘油三酯、 微晶纖維素、黃蓍膠或明膠將組合物配制為栓劑?？诜苿┛砂?biāo)準(zhǔn)載體諸如藥用級(jí) 的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。適合的藥物載體的實(shí)例在 E.W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中描述，在此通過(guò)引用將其全文并 入本文。此類組合物將包含治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的源自gp41的肽（即包含SEQ ID NO: 1的基序），以及與適當(dāng)量的載體一起以提供用于向受試者適當(dāng)施用的形式，所述源自 gp41的肽優(yōu)選地呈基本上純化的形式。
[0153] 將有效治療特定紊亂或狀況的本發(fā)明的肽的量將取決于紊亂或狀況的性質(zhì)和特 定的肽，且可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。此外，可任選地使用體外測(cè)定 以輔助確定最佳的劑量范圍。制劑中待使用的精確劑量還將取決于施用途徑、以及疾病或 紊亂的性質(zhì)，并應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)務(wù)工作者的判斷和每個(gè)患者的情況來(lái)決定。有效劑量可從來(lái)源 于體外或體內(nèi)動(dòng)物模型測(cè)試生物測(cè)定或體系的劑量-反應(yīng)曲線推斷出來(lái)。
[0154] 將理解的是，本發(fā)明的藥物組合物可以包括本發(fā)明的肽、或其衍生物或類似物，或 兩種或更多種這些衍生物、類似物或其他來(lái)源的本發(fā)明的肽的所有可能組合。因此，根據(jù) 本發(fā)明的原則，藥物組合物可包含一種或更多種分離的多核苷酸、一種或更多種表達(dá)載體、 或一種或更多種宿主細(xì)胞、或其任意組合。
[0155] 確定肽的治療有效量充分在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的 詳細(xì)公開(kāi)內(nèi)容。
[0156] 本文描述的肽的毒性和治療功效可在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥物程 序來(lái)確定，例如通過(guò)確定經(jīng)受實(shí)驗(yàn)的化合物的IC5tl (提供50%抑制時(shí)的濃度）和LD5tl(引 起50%測(cè)試動(dòng)物死亡的致死劑量）。通過(guò)這些細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可 用于配制用于在人中使用的劑量范圍。劑量可根據(jù)采用的劑型和使用的施用途徑而不同。 個(gè)體醫(yī)師可以根據(jù)患者的狀況選擇確切的制劑、施用途徑和劑量（參見(jiàn)，例如Fingl等， 1975, Pharmacological Basis of Therapeutics中第1章第1頁(yè)，在此通過(guò)引用將其全文 并入）。
[0157] 根據(jù)待治療的狀況的嚴(yán)重度和反應(yīng)性，給藥還可以是單次施用緩釋組合物，持續(xù) 幾天到幾周或直至實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕的療程。
[0158] 還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的肽可以與治療患者狀況所需的其他活性成分一起配制或施 用。在具體實(shí)施方案中，藥物組合物還包含免疫抑制劑。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，免疫抑制劑 是免疫抑制肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，免疫抑制肽包含如SEQ ID N0:6所列的氨基酸序列 LQARILAVERYLKDQQL、或其類似物、衍生物、或鹽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，免疫抑制肽由如SEQ ID N0:6所列的氨基酸序列LQARILAVERYLKDQQL組成。
[0159] 根據(jù)目的組織的位置，可以以適于向目的組織內(nèi)的細(xì)胞提供肽的任何方式提供本 發(fā)明的肽。因此，例如，包含本發(fā)明的肽的組合物可被引入諸如體循環(huán)中，其將把肽分配至 目的組織?？蛇x地，組合物可局部應(yīng)用于目的組織（例如，注射、或泵送作為連續(xù)的輸注、或 作為組織內(nèi)的藥丸、應(yīng)用到全部或部分皮膚表面，等等）。
[0160] 藥物組合物的施用途徑將取決于待治療的疾病或狀況。合適的施用途徑包括但不 限于腸胃外注射例如皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、病灶內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、和本領(lǐng)域已知的其他注射方 式。盡管通過(guò)其他途徑施用的肽的生物利用度可能低于腸胃外注射施用，但是通過(guò)使用適 當(dāng)?shù)闹苿?，設(shè)想通過(guò)治療的經(jīng)皮、口服、直腸、陰道、局部、經(jīng)鼻、吸入和眼部模式施用本發(fā)明 的組合物是可能的。此外，通過(guò)任何合適的途徑包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射向中樞神經(jīng)系統(tǒng)引 入本發(fā)明的藥物組合物可以是期望的；腦室內(nèi)注射可通過(guò)例如連接到儲(chǔ)液囊的腦室內(nèi)導(dǎo)管 方便地進(jìn)行。也可以通過(guò)例如使用吸入器或噴霧器采用肺部施用。
[0161] 向需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的藥物組合物可以是期望的；這可以通過(guò)例如 但不限于局部輸注、局部應(yīng)用、通過(guò)注射、通過(guò)導(dǎo)管、通過(guò)栓劑、或通過(guò)植入物實(shí)現(xiàn)，所述的 植入物為多孔、非多孔或凝膠狀材料。根據(jù)一些優(yōu)選的實(shí)施方案，施用可以通過(guò)在受損組織 的部位例如通過(guò)注射器直接注射進(jìn)行。
[0162] 對(duì)于局部應(yīng)用，本發(fā)明的肽、其衍生物或類似物可基于期望的活性與藥學(xué)上可接 受的載體結(jié)合，使得有效劑量被遞送。載體可以呈例如但不限于軟膏、膏、凝膠、糊劑、泡沫、 氣霧劑、栓劑、藥棉塊（pad)或凝膠棒（gelled stick)的形式。
[0163] 對(duì)于口服應(yīng)用，藥物組合物可以呈片劑或膠囊的形式，其可包含任何下列成分或 具有相似性質(zhì)的化合物：粘合劑諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑諸如淀粉或乳糖； 崩解劑諸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑諸如硬脂酸鎂；或助流劑諸如膠體二氧 化硅。當(dāng)劑量單位形式為膠囊，其除上述類型的材料外還可含有液體載體諸如脂肪油。此 夕卜，劑量單位形式可以含有修飾劑量單位的物理形式的多種其他材料，例如糖衣、紫膠、或 其他腸溶劑。本發(fā)明的片劑還可以是薄膜包衣的。
[0164] 本發(fā)明的肽、其衍生物或類似物可在控釋系統(tǒng)中被遞送。因此，可以使用灌注泵施 用肽，例如用于例如將胰島素或化療劑遞送到特定器官或腫瘤的灌注泵。在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明的肽與可生物降解的、生物相容的聚合植入物結(jié)合施用，其可在所選部位釋放肽 超過(guò)控制的時(shí)間段。優(yōu)選的聚合材料的實(shí)例包括但不限于聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳 酸、聚乙烯醋酸乙烯酯、其共聚物和共混物（參見(jiàn)，Medical applications of controlled release, Langer 和 Wise (編著），1974, CRC Pres.，Boca Raton, Fla，在此通過(guò)引用將其全 文并入）。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，可將控釋系統(tǒng)放置于臨近治療靶處，因此僅需要全身劑 量的一部分。
[0165] 狀的用涂
[0166] 在一些方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的免疫抑制肽的藥物組合物有效預(yù)防或治 療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和紊亂的用途。
[0167] T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）是參與免疫反應(yīng)的多種不同的細(xì)胞類型之一。T細(xì)胞的活性 受由抗原呈遞細(xì)胞（APC)的主要組織相容性復(fù)合物（MHC)分子呈遞至T細(xì)胞的抗原調(diào)節(jié)。 然后，T細(xì)胞受體（TCR)與MHC-抗原復(fù)合物結(jié)合?？乖cMHC復(fù)合之后，MHC-抗原復(fù)合物 被T細(xì)胞上的特異性TCR結(jié)合，從而改變?cè)揟細(xì)胞的活性。
[0168] 抗原呈遞細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的適當(dāng)活化不僅需要TCR的刺激,而且需要其共受體 的組合和協(xié)同銜接。大多數(shù)TCR共受體結(jié)合細(xì)胞表面配體，并集中于細(xì)胞-細(xì)胞接觸區(qū)域， 形成所稱的免疫突觸。突觸形成與抗原特異性T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和裂解性顆粒釋 放相關(guān)，且確定其功能是完全的T細(xì)胞活化所必需的。
[0169] 因此，根據(jù)一些方面，本發(fā)明提供了一種用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂的方 法。術(shù)語(yǔ)"T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂"和"T細(xì)胞介導(dǎo)的病理"是指其中不適當(dāng)或有害的T 細(xì)胞反應(yīng)是疾病或紊亂的病因或病理因素的任何狀況。該術(shù)語(yǔ)預(yù)期不僅包括由T細(xì)胞直接 介導(dǎo)的疾病，且還包括其中不適當(dāng)或有害的T細(xì)胞反應(yīng)促進(jìn)異?？贵w的產(chǎn)生的疾病，以及 移植排斥。應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語(yǔ)不包括由HIV引起的疾病或狀況，例如獲得性免疫缺陷綜合征 (AIDS)。
[0170] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，肽和組合物可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾 病，包括但不限于：多發(fā)性硬化癥（MS)、自身免疫性神經(jīng)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、銀屑 病、I型糖尿?。↖DDM)、干燥綜合征、甲狀腺疾病、重癥肌無(wú)力、肉樣瘤病、自身免疫性葡萄 膜炎、炎性腸?。肆_恩氏結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎）或自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。 每種可能性都代表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0171] 在其他實(shí)施方案中，組合物可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病，包括但不限于： 炎性疾病或變應(yīng)性疾病諸如哮喘、過(guò)敏性肺病、過(guò)敏性肺炎、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、間質(zhì)性肺病 (ILD)(例如，特發(fā)性肺纖維化、或與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的ILD或其他炎性疾?。?；硬皮??； 銀屑病（包括T細(xì)胞介導(dǎo)的銀屑?。黄ぱ祝òㄌ貞?yīng)性皮炎和濕疹性皮炎）、虹膜炎、結(jié)膜 炎、角膜結(jié)膜炎、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥疹、變應(yīng)性腦脊髓炎、急性出血 性壞死性腦病、自發(fā)性兩側(cè)漸進(jìn)性感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力喪失、再生障礙性貧血、單純紅細(xì)胞性貧 血、自發(fā)性血小板減少癥、多軟骨炎、Graves眼病和原發(fā)性膽汁性肝硬化。每種可能性都代 表本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0172] 在其他實(shí)施方案中，組合物可用于治療移植排斥，包括同種異體移植排斥或移植 物抗宿主病。
[0173] 在另外的實(shí)施方案中，肽和組合物能夠抑制或減少促炎性細(xì)胞因子（例如， IFNy)釋放。
[0174] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的分離的肽在制備用于治療或預(yù)防T細(xì)胞介導(dǎo) 的疾病和紊亂的藥物組合物中的用途。
[0175] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的分離的肽用于在治療或預(yù)防T細(xì)胞介導(dǎo) 的疾病和紊亂中使用。
[0176] 根據(jù)本發(fā)明的治療疾病的方法可以包括施用本發(fā)明的藥物組合物作為單一活性 齊U，或與其他治療方法聯(lián)合施用。本發(fā)明的治療方法可以與其他治療方法并行、在其之前或 之后。
[0177] 為了更全面闡述本發(fā)明的一些實(shí)施方案，展示了以下實(shí)施例。然而，它們不應(yīng)以任 何方式被解釋為限制本發(fā)明的寬范圍。 實(shí)施例
[0178] 肽合成
[0179] 通過(guò)使用F-moc策略在Rink Amide MBHA樹(shù)脂上合成肽（氨基酸來(lái)自 Calibochem-Novabiochem AG，Switzerland)。通過(guò) TFA:DDW:TES(93.1:4.9:2(v/v))混合 物從樹(shù)脂上裂解肽，并通過(guò)反相高效液相色譜（RP-HPLC)純化至>95 %的同質(zhì)性。通過(guò)LCA 電噴霧質(zhì)譜平臺(tái)證實(shí)肽的分子量。在二甲基甲酰胺（DMF)中持續(xù)1小時(shí)進(jìn)行將4-氯-7-硝 基苯-2-氧雜-1，3-二唑氟化物（NBD-F) (Molecular Probes, USA)添加到選擇的肽的N末 端。在包含2% N，N-二異丙基乙胺（DIEA)的DMF中持續(xù)24小時(shí)進(jìn)行將羅丹明-N-羥基 琥拍酸亞胺（Rho) (Molecular Probes, USA)添加到選擇的肽的N末端。
[0180] 細(xì)胞系
[0181] 抗原特異性T細(xì)胞系體外選自來(lái)自于C57B1/6J小鼠的致敏淋巴結(jié)細(xì)胞， 所述C57B1/6J小鼠在9天之前已使用在含150 ii g結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mt)H37Ra(Difco Laboratories, Detroit, MI)的 CFA 中乳化的抗原（lOOug 髓鞘肽，M0G35-55)免疫。所有T細(xì)胞系都在含IL-2的培養(yǎng)基中體外維持，每隔10-14天 用抗原交替刺激。人 T 細(xì)胞系 Jurkat E6-1 通過(guò) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH 獲得。RAW264. 7 巨噬細(xì)胞從 ATCC(ATCC-TIB71)獲 得。
[0182] 體外T細(xì)胞增殖測(cè)定
[0183] 將含有1^]\〇-1640、補(bǔ)充有2.5%胎牛血清$03)、10(^/1111盤尼西林、1001^/1111鏈 霉素、50 ii MP -巰基乙醇、和2mM L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中的對(duì)M0G35-55特異性的原代⑶4T 細(xì)胞涂布在圓形96孔板上。96個(gè)孔的每個(gè)都具有200ul的終體積，并含有20xl03個(gè)T細(xì) 胞、5x10s個(gè)輻照的（25戈瑞）脾細(xì)胞（APC)、含有或不含1-5 ii g/ml的M0G35-55。此外，還 加入了相關(guān)的肽。使用最少5次重復(fù)進(jìn)行每次讀取。為了排除檢查的肽與M0G35-55抗原 之間的相互作用，我們首先將M0G35-55抗原添加至試管中的APC中，并且我們?cè)诘诙嚬?中將檢查的肽加入T細(xì)胞中。1小時(shí)后，我們將APC與T細(xì)胞混合，并將其在96孔圓底板中 孵育48h。使用具有5. OCi/mmol比放射性的I ii Ci (H3)胸苷持續(xù)24小時(shí)脈沖T細(xì)胞，并使 用96孔板P -計(jì)數(shù)器測(cè)量（H3)胸苷的摻入。以一式四份或更多來(lái)計(jì)算平均cpm土標(biāo)準(zhǔn)差 (SD)。T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示為不含任何肽的情況下由抗原觸發(fā)的T細(xì)胞增殖抑制 的百分比。用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在若干實(shí)驗(yàn)中，T細(xì)胞用預(yù)先包被的終濃度為2iig/ml 的CD3或CD28抗體（LEAF?純化的抗小鼠克隆145-2-C11和37. 51，分別來(lái)自Biolegend) 直接活化、或用50ng/ml的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA)與I ii M離子霉素 （Sigma Chemical Co. , Israel) 一起活化。
[0184] 小鼠
[0185] C57BL/6J小鼠保持在特定無(wú)病原體條件下。當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有小鼠為2-3月齡。 Weizmann Institute的IA⑶C批準(zhǔn)了本實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)按照其相關(guān)的指導(dǎo)和規(guī)則進(jìn)行。
[0186] XTT細(xì)胞毒性測(cè)定
[0187] 在各種肽濃度存在的情況下，將2. 5x IO4個(gè)細(xì)胞（來(lái)自Jurkat E6-1，T細(xì)胞系） 等份分配至96孔板（Falcon)上，并孵育24h。最后2列的孔分別用作空白（僅含培養(yǎng)基） 和100%存活對(duì)照（僅含細(xì)胞和培養(yǎng)基）。孵育后，持續(xù)2小時(shí)以上添加以50:1的比例混合 的XTT反應(yīng)溶液苯磺酸水合物與N-甲基酚嗪甲基硫酸鹽。在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定平板閱讀 器中讀取450-nm波長(zhǎng)下的光密度。相對(duì)于對(duì)照，培養(yǎng)基中2. 5x IO4個(gè)細(xì)胞，確定LC5(i(50% 細(xì)胞死亡時(shí)的濃度）。一式兩份進(jìn)行所有測(cè)定。
[0188] 使用圓二色（⑶）光譜法確定二級(jí)結(jié)構(gòu)
[0189] 使用AppliedPhoto physics公司的分光偏振計(jì)進(jìn)行圓二色（CD)光譜測(cè)量。使用 Imm路徑長(zhǎng)度的恒溫石英比色皿掃描光譜。在25°C進(jìn)行波長(zhǎng)掃描；平均記錄時(shí)間為15秒、 1-_步距、19〇-26〇11111的波長(zhǎng)范圍。在冊(cè)?￡3緩沖液（5福，？117.4)中掃描1〇11]\1濃度的 肽。
[0190] 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)的主動(dòng)誘導(dǎo)
[0191] 使用100 U L含有200 ii g在包含300 ii g結(jié)核分枝桿菌的CFA中乳化的抗原（M0G 肽；SEQ ID NO: 15)的接種物在側(cè)腹的一個(gè)部位皮下免疫C57BL/6J小鼠；免疫之后立即以 及48h i. V?注射百日咳毒素（300ng/500 ii L PBS)。用0至6的規(guī)模，按照EAE臨床表現(xiàn) 對(duì)小鼠評(píng)分。疾病發(fā)作通常發(fā)生在致腦炎攻擊后的11-12天。將源自gp41的肽p印6溶于 PBS中，加入接種物乳液中，并在免疫的第0天給小鼠施用。
[0192] 小鼠的離體研究
[0193] 在含有或不含0. 5mg/kg HIV肽的情況下，用150ii g在含150ii g Mt H37Ra的完全 弗氏佐劑（CFA)中乳化的M0G35-55皮下免疫小鼠。如前所述，免疫后10天移出引流淋巴 結(jié)并在存在或不存在抗原的情況下一式三份進(jìn)行培養(yǎng)。在37°C孵育培養(yǎng)物72h。加入[3H] 胸苷（ImCi/孔）持續(xù)孵育另外的16h，且然后收獲培養(yǎng)物并使用P計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。如前所 述，按照來(lái)自PharMingen (San Diego, CA)的標(biāo)準(zhǔn)方案，在細(xì)胞活化后24h通過(guò)ELISA確定 IFN Y、IL-12和TNF a的促炎性細(xì)胞因子分析。
[0194] 人紅細(xì)胞的溶血
[0195] 使用PBS沖洗新鮮的人紅細(xì)胞（RBCs)兩次，隨后以2000rpm離心7min并重懸在 PBS中。將不同濃度的肽溶解于PBS，并加入到50 ill PBS中人紅細(xì)胞（hRBC)溶血儲(chǔ)備溶液 (stock hemolysis of human red blood cell(hRBC) solution)中，終體積為100 ul(最終 紅細(xì)胞濃度，4% (v/v))。將所得重懸液在37°C攪拌孵育60min。然后，將樣品以2000rpm 離心7min。通過(guò)測(cè)量540nm下上清液的吸光度監(jiān)測(cè)血紅蛋白的釋放。零溶血（空白）和 100%溶血的對(duì)照分別由懸浮在PBS和含1% Triton的PBS中的hRBC組成。
[0196] 小鼠的離體研究
[0197] 在含有或不含0. 5mg/kg HIV肽的情況下，用150ii g在含150ii g Mt H37Ra的完全 弗氏佐劑（CFA)中乳化的M0G35-55皮下免疫小鼠。如前所述，免疫后10天移出引流淋巴 結(jié)并在存在或不存在抗原的情況下一式三份進(jìn)行培養(yǎng)。在37°C孵育培養(yǎng)物72h。加入[3H] 胸苷（ImCi/孔）持續(xù)孵育另外的16h，且然后收獲培養(yǎng)物并使用P計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。如前所 述，按照來(lái)自PharMingen (San Diego, CA)的標(biāo)準(zhǔn)方案，在細(xì)胞活化后24h通過(guò)ELISA確定 IFN Y、IL-12和TNF a的促炎性細(xì)胞因子分析。
[0198] 熒光標(biāo)記的肽與TCR的免疫沉淀
[0199] 在I U M羅丹明標(biāo)記的肽存在下，將Jurkat T細(xì)胞（4xl06)于37°C過(guò)夜孵育并裂 解。然后，將裂解物與TCRa或GFP抗體（2 ii g)過(guò)夜孵育，隨后與蛋白G-plus瓊脂糖珠 (Santa Cruz Biotechnology Inc.)孵育2小時(shí)。隨后，使用裂解緩沖液洗漆珠并煮沸10 分鐘；然后，將蛋白上清液在12% SDS-PAGE中運(yùn)行。通過(guò)Typhoon 9400可變模式成像儀 檢測(cè)免疫共沉淀的肽的存在。
[0200] T細(xì)胞中肽的細(xì)胞定位
[0201] 將未活化的mM〇G35-55T細(xì)胞（5xl04)負(fù)載親脂熒光染料1，1' -雙十八烷 基-3, 3, 3'，3'，-四甲基吲哚二碳菁、四氯苯磺酸鹽（DiD) (Biotium，USA)或細(xì)胞質(zhì)熒 光染料5-和6-{[4_氯甲基）苯甲?；鵠氨基}四甲基羅丹明（CMTMR) (Molecular Probes，USA)。也將Jurkat T細(xì)胞負(fù)載這些染料。然后，洗滌細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸并活化24 小時(shí)。將NBD標(biāo)記的熒光肽（終濃度為I ii M)加入細(xì)胞中持續(xù)孵育另外的1小時(shí)。洗滌細(xì) 胞以去除未結(jié)合的肽，并用4%多聚甲醛固定20min。然后，用PBS洗滌細(xì)胞，置于載玻片上， 并在熒光共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000)下觀察細(xì)胞樣品。NBD的激發(fā)設(shè)置在488nm處， 具有10%功率的激光設(shè)置，并從502-512nm記錄熒光。CMTMR的激發(fā)設(shè)置在559nm處，具有 2%功率的激光設(shè)置，并在580nm以上收集熒光數(shù)據(jù)。含DiD標(biāo)記的樣品在635nm處激發(fā)， 具有2 %功率的激光設(shè)置，并在655nm以上收集熒光數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)細(xì)胞成像以確定膜或細(xì)胞 質(zhì)染色（以紅色表示）和肽染色（以綠色表示）。使用ImageJ，將圖像（n = 20)設(shè)置為二 值顏色，并使用兩張修正的圖像以創(chuàng)建僅在它們之間合并的新圖像。合并的圖像被修正的 紅色圖像分割以提供共定位的百分比。
[0202] 肽與TCR分子共定位的共聚焦設(shè)置
[0203] ?1!^的激發(fā)設(shè)置于48811111處，具有5%功率的激光設(shè)置，并從502-52511111記錄熒 光。羅丹明的激發(fā)設(shè)置于559nm處，具有I %功率的激光設(shè)置，并在580nm以上收集熒光數(shù) 據(jù)。對(duì)每個(gè)細(xì)胞成像以確定TCRa染色（以紅色表示）和肽染色（以綠色表示）。使用 ImageJ，將圖像（n = 20)設(shè)置為二值顏色，并使用兩張修正的圖像以創(chuàng)建僅在它們之間合 并的新圖像。合并的圖像被修正的紅色圖像分割以提供共定位的百分比。
[0204] 生物信息學(xué)分析
[0205] 從所有通用蛋白資源（UniProt)條目創(chuàng)建HIV和SIV的包膜的跨膜蛋白的數(shù)據(jù) 庫(kù)。然后，這些蛋白序列在基于基序的序列分析工具（MEME)中進(jìn)行，所述基于基序的序列 分析工具分析序列之間的相似性，并產(chǎn)生關(guān)于其發(fā)現(xiàn)的每種模式的描述（基序）。尋找蛋 白中短的且獨(dú)特的基序，因此，將檢索限制為多達(dá)10個(gè)殘基長(zhǎng)且在跨膜蛋白中不會(huì)重復(fù)多 于1次的基序。發(fā)現(xiàn)的基序根據(jù)其E值被自動(dòng)排列，所述E值是指人們可在隨機(jī)序列的相 似大小的組中獲得的具有給定的對(duì)數(shù)似然比的基序的預(yù)期數(shù)目的估計(jì)值。對(duì)數(shù)似然比是在 給定基序模型對(duì)比其概率、和給定背景模型的情況下，基序出現(xiàn)的概率的比的對(duì)數(shù)。這里的 背景模型是使用背景字母頻率的〇階馬爾可夫模型。'Y'軸以比特為單位，其等于相對(duì)于統(tǒng) 一背景頻率模型的基序的相對(duì)熵。以比特計(jì)算且相對(duì)于背景字母頻率的基序的相對(duì)熵，等 于對(duì)數(shù)然似比（Ilr)除以基序的貢獻(xiàn)位點(diǎn)的數(shù)目乘以l/ln(2)。為了更好地查看序列，將 MEME結(jié)果加側(cè)翼區(qū)域通過(guò)WebLogo運(yùn)行，所述WebLogo被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生序列l(wèi)ogo,作為用于 氨基酸或核酸序列比對(duì)的圖形表示的方法。
[0206] 肽-膜相互作用的熒光測(cè)量
[0207] 在大單層囊泡（LUV)模型膜的存在下，用其固有的色氨酸殘基的熒光各向異性分 析和定量與膜相互作用的肽。如前所述，LUV由磷脂酰膽堿（PC)和膽固醇（Chol) (9 :1)組 成（Cohen等.Biochemistry. 2008 ;47 (16) :4826-4833)。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別被設(shè)置為 280/350nm，并用13. 3mM膜溶液連續(xù)滴定I ii M的肽（在400 ill PBS中）。由于已知Trp在 疏水環(huán)境中改變其發(fā)射，因此其發(fā)射的變化代表了結(jié)合到膜上的肽的量。系統(tǒng)以特定的脂 質(zhì)/肽比的情況下達(dá)到結(jié)合平衡（Fmax)，允許我們使用穩(wěn)態(tài)親和模型根據(jù)Trp發(fā)射的平衡 水平與脂質(zhì)濃度之間的關(guān)系計(jì)算親和常數(shù)。然后，根據(jù)非線性最小二乘法（NLLSQ)確定親 和常數(shù)。使用以下公式進(jìn)行NLLSQ擬合：

【權(quán)利要求】
1. 一種10-30個(gè)氨基酸的分離的肽，所述分離的肽包含SEQ ID N0:2所列的氨基酸序 列WNHTTWMEWD，或其包含至少一個(gè)D氨基酸的類似物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的肽，包含選自由以下組成的組的氨基酸序列： SNKSLEQIWNHTTWMEWD(SEQ ID NO:3), EQIWNHTTWMEWDREINN(SEQ ID N0:4)、和 SNKSLEQIWNHTTWMEW2,其中 S 為 D-Ser 且 2 為 D-Asp (SEQ ID NO: 5)。
3. -種8-30個(gè)氨基酸的分離的肽，所述分離的肽包含SEQ ID NO: 1所列的氨基酸序 列HTTWMEWD，或其類似物或鹽，其中所述類似物選自包含至少一個(gè)D氨基酸的類似物或包 含至少一個(gè)Trp(W)殘基被選自Ile(I)、Leu(L)和Gly(G)的氨基酸取代的類似物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的肽，包含選自由以下組成的組的氨基酸序列： WNHTTWMEWD(SEQ ID NO :2), SNKSLEQIWNHTTWMEWD(SEQ ID NO:3)、和 EQIWNHTTWMEWDREINN(SEQ ID N0:4)〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的肽，由氨基酸序列HTTWMEWD (SEQ ID NO:1)組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的肽，由氨基酸序列WNHTTWMEWD (SEQ ID NO: 2)組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的肽，由氨基酸序列SNKSLEQIWNHTTWMEWD (SEQ ID NO :3)組成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的肽，由氨基酸序列EQIWNHTTWMEWDREINN(SEQ ID NO :4)組成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的肽，其中所述至少一個(gè)D氨基酸位于選自以下的位置 處：所述的肽的N末端、C末端或二者。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的肽，由氨基酸序列SNKSLEQIWNHTTWMEW2(SEQ ID N0:5)組成，其中S為D-Ser且2為D-Asp。
11. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的肽，由氨基酸序列WNHTTWMEWD(SEQ ID N0:11)組成， 其中所有氨基酸都為D-氨基酸。
12. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的分離 的肽作為活性成分、和藥學(xué)上可接受的載體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，還包含免疫抑制劑。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中所述免疫抑制劑是免疫抑制肽。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述免疫抑制肽包含SEQ ID NO:6所列 的氨基酸序列LQARILAVERYLKDQQL、或其類似物、衍生物或鹽。
16. -種治療有相應(yīng)需要的受試者中T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂的方法，包含向所述受 試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂是T細(xì)胞介導(dǎo)的 自身免疫性疾病。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病選自由以下 組成的組：多發(fā)性硬化癥、自身免疫性神經(jīng)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、銀屑病、I型糖尿病 (IDDM)、干燥綜合征、甲狀腺疾病、重癥肌無(wú)力、肉樣瘤病、自身免疫性葡萄膜炎、炎性腸病 (克羅恩氏結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎）、自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減 少癥、硬皮病、斑禿、腎小球腎炎、皮炎和天皰瘡。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂是T細(xì)胞介導(dǎo)的 炎性疾病。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或紊亂選自由以下組成 的組：同種異體移植排斥和移植物抗宿主病。
【文檔編號(hào)】C07K14/005GK104427991SQ201380034175
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月27日
【發(fā)明者】耶切爾·沙伊, 亞夫拉罕·阿什肯納茲, 奧馬里·法因戈?duì)柕? 亞夫拉罕·本努恩, 納塔利·考杉斯基 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司