抗Nogo-A抗體在肌萎縮側(cè)索硬化治療中的最佳劑量方案的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療或預(yù)防神經(jīng)障礙特別是但并非排他地為肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）的方法，其包括抗Nogo-A抗體的施用。
【專利說(shuō)明】抗Nogo-A抗體在肌萎縮側(cè)索硬化治療中的最佳劑量方案 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及治療或預(yù)防神經(jīng)障礙特別是但并非排他地為肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的 方法，其包括抗Nogo-A抗體的施用。
[0002] 發(fā)明背景 肌萎縮側(cè)索硬化（ALS)也稱為盧伽雷氏?。↙ou Ge虹ig's Disease)或夏科氏病 (Maladie de化arcot)，是最常見(jiàn)的成人發(fā)病的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病。主要疾病標(biāo)志是皮質(zhì)脊髓 束中的上位和下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性退變。下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(在腦干和脊髓中）的功能障 礙觸發(fā)全身乏力，肌肉萎縮和痛疾。呼吸肌的失效一般是致命事件，在發(fā)病1-5年內(nèi)發(fā)生。
[0003] ALS是成人中最常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，每年影響美國(guó)大約30, 000人和英國(guó)5, 000 人（Lei曲和Swash, 1991)。典型發(fā)病年齡在50至70歲之間，盡管有時(shí)在更年輕時(shí)發(fā)生。 大多數(shù)病例（90-95%)分類為散發(fā)性ALS (sALS)，并且剩余部分是遺傳性的，并且被稱為家 族性ALS(fALS)。散發(fā)性和家族性形式是臨床和病理學(xué)相似的，提示共同發(fā)病機(jī)理（Bruijn 等人，2004)。然而，大多數(shù)病例的確切原因仍是未知的，并且不存在停止該疾病進(jìn)程的有效 治療法。
[0004] Nogo也稱為Reti州lon-4或神經(jīng)突增生抑制劑（Neurite outgrowth inh化itor)，是在人中由《7}似基因編碼的蛋白質(zhì)，所述《7}似基因已鑒定為對(duì)于中樞神經(jīng)系 統(tǒng)特異性的神經(jīng)突增生的抑制劑。
[0005] H種形式的人Nogo已得到鑒定；Nogo-A具有1192個(gè)氨基酸殘基（GenBank登錄號(hào) AJ251383);Nog〇-B，缺乏在假定細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的殘基186至1004的剪接變體（GenBank登 錄號(hào)AJ251384); W及更短的剪接變體，Nogo-C，其也缺乏殘基186至1004并且還具有更小 的替代氨基末端結(jié)構(gòu)域（GenBank登錄號(hào)AJ251385) (Prinjha R等人（2000)化Uire 403， 383-384)。CNS抑制蛋白質(zhì)例如Nogo的抑制可W提供改善神經(jīng)元損害且促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和 生長(zhǎng)的治療方法，由此潛在幫助從神經(jīng)元損傷例如持續(xù)于中風(fēng)中的神經(jīng)元損傷恢復(fù)。此類 Nogo抑制劑的實(shí)例可W包括小分子、膚和抗體。
[0006] 已報(bào)道針對(duì)NI-220/250產(chǎn)生的鼠單克隆抗體IN-1促進(jìn)軸突再生（Caroni，P 和 Schw油，ME (1988) Neuron 1 85-96 ;Schnell, L 和 Schwab, ME (1990) P^Jature ；343 269-272 ;Bregman，BS 等人（1995WaUire 378 498-501 和 IliallmairiM 等人（1998WaUire Neuroscience 1 124-131 )，所述NI-220/250是其為神經(jīng)突生長(zhǎng)的有效抑制劑的髓磯脂 蛋白（并且W后顯示為Nogo-A的片段)。還已報(bào)道Nogo-A是IN-1的抗原（化en等人（2000 ) 化化re 403 434-439)。IN-1 F油片段或人源化IN-1的施用增強(qiáng)在已經(jīng)歷脊髓橫切術(shù)的 大鼠中的恢復(fù)（Fiedler, M 等人（2002)Protein 化 g 15 931-941;化 osamle，C 等人（2000) J. Neuroscience 20 8061-8068)。
[0007] 與 Nogo 結(jié)合的單克隆抗體在 WO 2004/052932、W0 2005/028508、W0 2005/061544 和WO 2007/068750中描述。WO 2004/052932公開(kāi)了 w高親和力與某些形式的人Nogo結(jié)合 的鼠抗體11 口。W0 2005/061544還公開(kāi)了高親和力單克隆抗體，包括鼠單克隆抗體2A10， 并且一般公開(kāi)了其人源化變體，例如化L11(化和L11的序列分別在SEQ ID NO. 33和34 中提供(僅VH或化序列））。所公開(kāi)的抗體W高親和力與人Nogo-A結(jié)合。wo 2007/068750 公開(kāi)了許多高親和力人源化單克隆抗Nogo抗體，包括肥化16 (肥8和L16的序列分別在 SEQ ID NO. 49和14中提供(僅VH或化序列））。公開(kāi)的抗體指示可用于治療神經(jīng)性疾病。
[0008] 盡管本領(lǐng)域提供了用于治療神經(jīng)障礙的高親和力抗Nogo抗體，但優(yōu)化此類障礙 的治療方案仍是高度期望的目標(biāo)。
[000引發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的方法，所述方法包 括給所述患者施用抗Nogo-A抗體或其功能片段，其劑量實(shí)現(xiàn)且維持所述抗體與人Nogo-A 在所述患者的細(xì)胞膜上大于90%的共定位水平。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了用于治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的抗Nogo-A 抗體，所述治療或預(yù)防包括施用所述抗Nogo-A抗體或其功能片段，其劑量實(shí)現(xiàn)且維持所述 抗體與人Nogo-A在所述患者的細(xì)胞膜上大于90%的共定位水平。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第H個(gè)方面，提供了用于治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的藥物組合 物，所述藥物組合物包含抗Nogo-A抗體或其功能片段，所述治療或預(yù)防包括施用所述抗 Nogo-A抗體或其功能片段，其劑量實(shí)現(xiàn)且維持所述抗體與人Nogo-A在所述患者的細(xì)胞膜 上大于90%的共定位水平。
[0012] 附圖簡(jiǎn)述 圖1 :激光掃描細(xì)胞計(jì)量術(shù)（LSC)充分掃描，W鑒定組織切片（灰色圖像)，并且將四個(gè) 區(qū)域(藍(lán)綠色框)置于每個(gè)切片上。高分辨率場(chǎng)掃描產(chǎn)生H種染料的位置圖像。各種蛋白質(zhì) 染為藍(lán)色（Y肌聚糖)、紅色（Nogo A)和綠色（肥8L16)。
[0013] 圖2:事件群體口控(給藥前活檢樣品）。產(chǎn)生散布圖W基于英光強(qiáng)度就特征區(qū)分 染料像素。
[0014] 圖3 ;事件群體口控(給藥前活檢樣品)。該圖是顯示"背景口控（back gating)"過(guò) 程的場(chǎng)圖像，所述"背景口控"用于顯示在組織切片上的口控事件。
[00巧]圖4 ;事件群體口控(給藥后活檢樣品）。如圖2中產(chǎn)生散布圖，然而，在用15 mg/ kg肥化16給藥后。
[001引圖5 ;事件群體口控(給藥后活檢樣品)。背景口控如圖3中進(jìn)行，然而，在用15 mg/ kg肥化16給藥后。
[0017] 圖6 ;NogoA/肥化16表達(dá)（Y肌聚糖通道未示出）。顯示了各個(gè)英光通道。首行僅 顯示祀（Nogo A)，第二行僅顯示肥化16,并且第H行顯示Nogo A和肥化16。
[0018] 圖7 ;在膜上與肥化16共定位的Nogo A百分比。顯示了在肌纖維膜上與肥化16 共定位的Nogo A百分比。突出顯示"15mg/kg"的框顯示了在用15 mg/kg肥化16給藥后 實(shí)現(xiàn)共定位的最大量。每柱表示一個(gè)切片。
[0019] 圖8 ;與肥化16共定位的膜Nogo-A的中值百分比。數(shù)據(jù)來(lái)自2. 5 mg/kg重復(fù)劑 量(左圖)、15 mg/kg重復(fù)劑量（中間3個(gè)圖）和15 mg/kg單一劑量(右圖）。來(lái)自重復(fù)劑量 組的活檢樣品的一式H份切片，連同來(lái)自單一劑量組的活檢樣品的單一切片的中值。
[0020] 圖9 ;在血漿肥化16濃度和與肥化16共定位的膜Nogo-A百分比之間的模型估計(jì) 關(guān)系（Emax)。
[002。 圖10 ;關(guān)于每4周施用的15mg/kg肥化16的預(yù)測(cè)中值(第5百分位數(shù)和第95百 分位數(shù)）肥化16血漿濃度時(shí)間概況。
[002引圖11 ;關(guān)于每2周施用的15mg/kg肥化16的預(yù)測(cè)中值(第5百分位數(shù)和第95百 分位數(shù)）肥化16血漿濃度時(shí)間概況。
[002引 圖12 ;肥化16抗體的可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)。
[0024] 發(fā)明詳述 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的方法，所述方法包 括給所述患者施用抗Nogo-A抗體或其功能片段，其劑量實(shí)現(xiàn)且維持所述抗體與人Nogo-A 在所述患者的細(xì)胞膜上大于90%的共定位水平。
[00巧]應(yīng)當(dāng)理解本文提及"共定位"指與抗Nogo-A抗體定位、連接（associated with) 或結(jié)合化ound to)的膜結(jié)合的Nogo-A比例。例如，100%共定位的值等于所有膜Nogo-A與 抗Nogo-A抗體共定位。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解共定位不等于祀占據(jù)，然而，它的確提供非常有 用的可能藥效作用的量度，W便確定最佳劑量方案。
[0026] 本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證實(shí)在細(xì)胞膜上Nogo-A與抗Nogo-A抗體W大于90%的水平共定 位實(shí)現(xiàn)最大藥效作用。
[0027] 本文提及"抗Nogo-A抗體"指任何抗體或其變體形式，包括但不限于能夠與 Nogo-A結(jié)合的抗體片段、結(jié)構(gòu)域抗體或單鏈抗體。抗Nogo-A抗體可W是中和性抗Nogo-A 抗體?？筃ogo-A可W是鼠、嵌合、人源化或全人抗體或其片段。"中和"及其語(yǔ)法變化指任 何Nogo功能，并且更具體地，任何Nogo-A功能的全部或部分抑制。
[002引如本文使用的，提及"治療"指與肌萎縮側(cè)索硬化相關(guān)的疾病癥狀和/或肌萎縮側(cè) 索硬化的原因的降低或消除，包括皮質(zhì)脊髓束中的神經(jīng)元的進(jìn)行性變性、肌纖維去神經(jīng)和/ 或肌無(wú)力和/或痊李狀態(tài)的降低或消除。如本文使用的，提及"預(yù)防"指與肌萎縮側(cè)索硬化 相關(guān)的疾病癥狀的延緩、防止或降到最低，包括皮質(zhì)脊髓束中的神經(jīng)元的進(jìn)行性變性、肌纖 維去神經(jīng)和/或肌無(wú)力和/或痊李狀態(tài)的延緩、防止或降到最低。
[0029] 應(yīng)當(dāng)理解待施用的抗Nogo-A抗體的量和頻率將選擇W確保實(shí)現(xiàn)且維持在細(xì)胞膜 上與Nogo-A的共定位大于90%。
[0030] W0 2010/004031公開(kāi)了用于治療人中的ALS或其他神經(jīng)性疾病的抗Nogo-A抗體 的合適劑量將在0. 1 mg/kg至300 mg/kg的范圍內(nèi)，通常為約2 mg/kg至約40 mg/kg。因 此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體的劑量為0.1 mg/kg至300 mg/kg。在進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，抗Nogo-A抗體的劑量為2 mg/kg至40 mg/kg。
[0031] 此外，WO 2007/068750公開(kāi)了用于治療人中的中風(fēng)及其他神經(jīng)性疾病的抗 Nogo-A抗體的合適劑量將在700 mg至3500 mg/70 kg體重的范圍內(nèi)。因此，在一個(gè)實(shí)施方 案中，抗Nogo-A抗體的劑量為10 mg/kg至50 mg/kg。
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體的劑量為15 mg/kg。本文呈現(xiàn)的 數(shù)據(jù)令人驚訝地顯示了 15 mg/kg劑量的有利結(jié)果。特別地，該劑量特別順應(yīng)方便的劑量頻 率，W實(shí)現(xiàn)大于在細(xì)胞膜上與Nogo-A的90%共定位的本發(fā)明闊值。
[0033] 本文呈現(xiàn)了本發(fā)明特別有利的15 mg/kg劑量的數(shù)據(jù)，其顯示對(duì)于施用后8天的持 續(xù)時(shí)間，在細(xì)胞膜上與Nogo-A的共定位增加至大于90%，而在施用后22至27天之間，降至 大約70%。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)劑量為15 mg/kg時(shí)，維持大于90%共定位的合適劑 量間隔為8至22天。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，當(dāng)劑量為15 mg/kg時(shí)，維持大于90%共定位 的合適劑量間隔為10至18天。
[0034] 在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，當(dāng)劑量為15 mg/kg時(shí)，維持大于90%共定位的 合適劑量間隔為14天。應(yīng)當(dāng)理解14天劑量間隔的輕微變化將是可接受的，并且給藥將在 最佳的14天劑量間隔前或后14天+/-直到3天時(shí)發(fā)生。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)劑量 為15 mg/kg時(shí)，維持大于90%共定位的合適劑量間隔為11天至17天巧P在最佳的14天劑 量間隔前或后3天)。在可替代實(shí)施方案中，當(dāng)劑量為15 mg/kg時(shí)，維持大于90%共定位的 合適劑量間隔為12天至16天（即在最佳的14天劑量間隔前或后2天)。在可替代實(shí)施方 案中，當(dāng)劑量為15 mg/kg時(shí)，維持大于90%共定位的合適劑量間隔為13天至15天（即在最 佳的14天劑量間隔前或后1天)。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的方法，其包括 每14天（+/- 3天）給所述患者施用劑量為15 mg/kg的抗Nogo-A抗體。
[0036] 可W依照本發(fā)明使用的抗Nogo-A抗體的實(shí)例在W0 2004/052932、W0 2005/028508、W0 2005/061544 和 W0 2007/068750 中描述，所述專利的抗 Nogo-A 抗體通過(guò) 引用并入本文。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體是單克隆抗體。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體是人源化抗體。本文提及術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"指 該樣的一類工程抗體，其具有來(lái)源于非人供體免疫球蛋白的CDR，該分子的剩余免疫球蛋白 衍生部分來(lái)源于一種(或多種)人免疫球蛋白。另外，可W改變構(gòu)架支持殘基，W保存結(jié)合親 和力（參見(jiàn)例如如een 等人，Proc.化tl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)，Hodgson 等人，Bio/Technology，9:421(1991 ))。合適的人受體抗體可W是通過(guò)與供體抗體(在該種 情況下，鼠供體抗體2A10)的核巧酸和氨基酸序列的同源性，選自常規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)例如KABAT? 數(shù)據(jù)庫(kù)、Los Alamos數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Protein數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體。通過(guò)與供體抗體的構(gòu)架區(qū)的 同源性(在氨基酸基礎(chǔ)上)表征的人抗體可能適合提供重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變構(gòu)架區(qū)用 于插入供體CDR。能夠貢獻(xiàn)輕鏈恒定區(qū)或可變構(gòu)架區(qū)的合適受體抗體可相似方式加 W 選擇。應(yīng)當(dāng)指出受體抗體重和輕鏈無(wú)需源自相同受體抗體。EP-A-0239400和EP-A-054951 尤其描述了產(chǎn)生此類人源化抗體的幾種方法。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"供體抗體"指非人抗體，其對(duì)人源化抗體貢獻(xiàn)其可變區(qū)、CDR或者它的其他功 能片段或類似物的氨基酸序列，并且從而提供具有供體抗體的抗原特異性和中和活性特征 的人源化抗體。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"受體抗體"指與供體抗體異源的抗體，所述抗體對(duì)人源化抗體提供其重和/ 或輕鏈構(gòu)架區(qū)和/或其重和/或輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。受體抗體可W來(lái)源于任何哺乳 動(dòng)物，條件是它在人中是非免疫原性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，受體抗體是人抗體。
[0041] 或者，人源化可W通過(guò)"鑲面（veneering)"方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。獨(dú)特的人和鼠免疫球蛋 白重和輕鏈可變區(qū)的統(tǒng)計(jì)分析掲示：暴露殘基的精確模式在人和鼠抗體中是不同的，并且 大多數(shù)各個(gè)表面位置具有對(duì)于少量不同殘基的強(qiáng)優(yōu)選(參見(jiàn)化dlan E.A.等人；（1991 ) Mol.Immunol.28,489-498 和化 dersenJ.T.等人（1994) J. Mol. Biol. 235;959-973)。 因此，通過(guò)替換其構(gòu)架區(qū)中不同于在人抗體中通常發(fā)現(xiàn)的那些的暴露殘基，能夠降低非人 Fv的免疫原性。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)抗原性可W與表面可及性關(guān)聯(lián)，所W表面殘基的替換可能足W 致使小鼠可變區(qū)對(duì)人免疫系統(tǒng)"不可見(jiàn)"（還參見(jiàn)Mark G. E.等人（1994)于Han化ook of Experimental Pharmacology 第 113 卷：The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag，第105-134頁(yè))。該人源化程序被稱為"鑲面"，因?yàn)閮H改變抗體的表面， 支持殘基保持不受干擾。進(jìn)一步的可替代方法在W0 2004/006955中闡述。
[0042] "CDR"定義為抗體的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，其為免疫球蛋白重和輕鏈的高變區(qū)。 參見(jiàn)例如 K油at 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 4 版，U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。 在免疫球蛋白的可變部分中存在H個(gè)重鏈和H個(gè)輕鏈CDR (或CDR區(qū))。因此，如本文使用 的"CDR"指所有H個(gè)重鏈CDR，或所有H個(gè)輕鏈CDR (或適當(dāng)時(shí)，所有重鏈CDR和所有輕鏈 CDR兩者)?？贵w的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)折疊可W意指其他殘基視為抗原結(jié)合區(qū)的一部分，并且技 術(shù)人員將如此理解。參見(jiàn)例如 Qiothia 等人，（1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ；Nature 342,第 877-883 頁(yè)。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體是中和性抗Nogo-A抗體或其片段，例如鼠抗體 2A10、15C3和2C4巧日其內(nèi)容通過(guò)引用W其整體并入本文的W0 2005/016544中所述)。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體是W0 2004/052932 (所述專利的內(nèi)容通過(guò)引用 W其整體并入本文）中所述的任何抗體。W0 2004/052932中公開(kāi)的抗體的實(shí)例是11C7,包 括其人源化變體。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體是如W0 2005/028508和W0 2009/056509 (所 述專利的內(nèi)容通過(guò)引用W其整體并入本文)中所述的任何人抗Nogo-A抗體。在進(jìn)一步的實(shí) 施方案中，抗Nogo-A抗體是如W0 2009/056509中所述的人抗Nogo-A抗體6A3。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體包括W0 2007/068750中所述的抗Nogo-A 抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體包括人源化抗體例如2A10的人源化變 體，例如肥0L16、肥8L16、肥化13和肥化16 (如其內(nèi)容通過(guò)引用W其整體并入本文的W0 2007/068750中所述)，人抗體或其片段。
[0047] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體包括肥化16 (W0 2007/068750的SEQ ID NO: 48 和沈Q ID NO: 14)、H28L13(W0 2007/068750 的沈Q ID NO: 49 和沈Q ID NO: 13) 或肥化16 (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 49和SEQ ID NO: 14)。在再進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，抗 Nogo-A 抗體包括肥化 16 (WO 2007/068750 的 SEQ ID NO: 49 和 SEQ ID NO: 14， 分別為本文的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2)。
[0048] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體包括肥7FL L16FL (WO 2007/068750的 沈Q ID NO: 54 和沈Q ID NO: 18)、肥8FL L13FL (W0 2007/068750 的沈Q ID NO: 55 和 沈Q ID NO: 17)或肥8FL L16化（WO 2007/068750 的沈Q ID NO: 55 和沈Q ID NO: 18)。 在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體包括肥8FL L16FL (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 55 和沈Q ID NO: 18)。
[0049] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體包括肥化16 (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 49 和沈Q ID NO: 14)或肥8化 L16化（WO 2007/068750 的沈Q ID NO: 55 和沈Q ID NO: 18)。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體包括肥化16 (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 49 和沈Q ID NO: 14)。
[0050] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體或其片段包括2A10、肥8L16或6A3的CDR 中的一個(gè)或多個(gè)，任選六個(gè)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體或其片段是如H2化16 結(jié)合相同的人Nogo-A表位（人Nogo-A 610-621aa，其包括來(lái)自wo 2010/004031的SEQ ID NO:6)或與肥化16競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人Nogo-A的抗體。
[0051] 可W依照本發(fā)明的劑量方案治療的神經(jīng)障礙的實(shí)例選自：中風(fēng)(缺血性或出血 性)、外傷性腦損傷、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病、額顯癡呆（Tau蛋白病)、周圍神經(jīng)病變、 帕金森氏病、克雅氏?。–JD)、精神分裂癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、亨廷頓氏 病、多發(fā)性硬化、包涵體肌炎、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、形態(tài)非特異性肌病（mo巧hologically nonspecific myopathies)、充血性也力衰竭和神經(jīng)性疼痛。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)障礙是肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)。
[0053] 本發(fā)明的抗Nogo-A抗體或其片段的施用模式可W是將藥劑遞送給宿主的任何合 適途徑。本發(fā)明的抗體和藥物組合物可特別用于腸胃外施用，即皮下（S. C)、銷內(nèi)、腹膜內(nèi) (i. P.)、肌內(nèi)（i. m.)、靜脈內(nèi)（i. V.)或鼻內(nèi)（i. n.)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體或 其片段靜脈內(nèi)施用。在可替代實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體或其片段皮下施用。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了用于治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的抗Nogo-A 抗體，所述治療或預(yù)防包括施用所述抗Nogo-A抗體或其功能片段，其劑量實(shí)現(xiàn)且維持所述 抗體與人Nogo-A在所述患者的細(xì)胞膜上大于90%的共定位水平。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的第H個(gè)方面，提供了用于治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的藥物組合 物，所述藥物組合物包含抗Nogo-A抗體或其功能片段，所述治療或預(yù)防包括施用所述抗 Nogo-A抗體或其功能片段，其劑量實(shí)現(xiàn)且維持所述抗體與人Nogo-A在所述患者的細(xì)胞膜 上大于90%的共定位水平。
[0056] 本發(fā)明的藥物組合物通常含有在藥學(xué)上可接受的載體中的有效量的本發(fā)明的抗 體作為活性成分。在本發(fā)明的預(yù)防藥劑中，優(yōu)選的是通常在生理抑下緩沖，W準(zhǔn)備用于注 射形式的含有工程抗體的含水息浮液或溶液。腸胃外施用的組合物通常包含在藥學(xué)上可接 受的載體(通常為含水載體）中溶解的本發(fā)明的抗體或其混合物（cocktail)的溶液。可W 采用多種含水載體，例如0. 9%鹽水、0. 3%甘氨酸等等。該些溶液是無(wú)菌的并且一般不含顆 粒物。該些溶液可W通過(guò)常規(guī)、眾所周知的滅菌技術(shù)(例如過(guò)濾）進(jìn)行滅菌。該組合物可W 含有接近生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如抑調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。在此類藥 物制劑中的本發(fā)明抗體的濃度可W廣泛改變，即從小于約0. 5重量％(通常為或至少約1重 量％)到多達(dá)15或20重量％，并且將根據(jù)所選的具體施用方式，主要基于流體體積、粘度等 加 W選擇。
[0057] 因此，用于肌內(nèi)注射的本發(fā)明的藥物組合物可W制備為含有1 mL無(wú)菌緩沖水，W 及約1 ng至約100 mg,例如約50 ng至約30 mg或更多，例如約5 mg至約25 mg的本發(fā)明 抗體。類似地，用于靜脈內(nèi)輸注的本發(fā)明的藥物組合物可W制備為含有約250 ml 0.9%生 理鹽水(氯化軸）溶液，W及約1至約30且通常為5 mg至約25 mg本發(fā)明的工程抗體/ml 0. 9%生理鹽水(氯化軸）溶液。制備可腸胃外施用的組合物的實(shí)際方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知或顯而易見(jiàn)的，并且例如在Remington' S化armaceutical Science,第15版，Mack Publishing Company，Easton，Penns}dvania中更詳細(xì)地描述。關(guān)于本發(fā)明的可靜脈內(nèi)施用 的抗體制劑的制備，參見(jiàn)Lasmar U和Parkins D ""The formulation of Bio曲armaceutical products",化arma. Sci. Tech, today,第 129-137 頁(yè)，第 3 卷（2000 年 4 月 3 日），Wang, W "Instability,stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188，St油ility of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahem T. J. , Manning M. C, New York, NY: Plenum Press (1992), Akers. M. J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300，Imamura'K 等人"Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J 化arm Sci 92 (2003) 266-274，Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein- structure-stabilizing effect during freeze-化ying", J Pharm.曲armacol,54 (2002)1033-1039， Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J.化arm. Sci，91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang YJ."化roxide formation in polysorbate 80 and protein st油ility", J.化arm Sci,91 ,2252-2264, (2002)，其完 整內(nèi)容通過(guò)引用并入本文并且讀者可具體參考。
[0058] 本文描述的抗體可W凍干用于膽存且在使用前在合適載體中重構(gòu)。該技術(shù)已顯示 對(duì)于常規(guī)免疫球蛋白有效，并且可W采用領(lǐng)域已知的凍干和重構(gòu)技術(shù)。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體與進(jìn)一步的治療劑組合施用。在進(jìn)一步的 實(shí)施方案中，進(jìn)一步的治療劑是具有針對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的效力的藥劑。在再 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，具有針對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化（ALS)的效力的藥劑是右旋普拉克索 (dexpramipexole)。右旋普拉克索（KNS-760704 ;(仍-火-丙基-4, 5, 6, 7-四氨苯并[刮喔 哇-2, 6-二胺)是由Knopp Biosciences and Biogen開(kāi)發(fā)的藥物。涉及102位患者的2010 年II期臨床試驗(yàn)顯示ALS疾病進(jìn)展的減慢，并且III期試驗(yàn)?zāi)壳霸谶M(jìn)行中。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗Nogo-A抗體與具有抗谷氨酸活性的化合物一起施用。 在具體實(shí)施方案中，具有抗谷氨酸活性的化合物是利魯哇（riluzole)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，具有抗谷氨酸活性的化合物是AMPA受體枯抗劑，例如2, 3-苯二氮卓化合物 (2, 3-benzodiazepine compound),特別是他侖帕奈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有抗谷氨酸 活性的化合物是TR0 19622或頭抱曲松?？筃ogo-A抗體和具有抗谷氨酸活性的化合物可 W同時(shí)、連續(xù)或分開(kāi)施用于患者。當(dāng)具有抗谷氨酸活性的化合物是利魯哇時(shí)，約50mg至約 150或200mg利魯哇可W每天施用于患者，通常lOOmg利魯哇每天施用于患者。利魯哇通 常是口服施用的。當(dāng)具有抗谷氨酸活性的化合物是他侖帕奈時(shí)，他侖帕奈通常W約lOmg至 約250mg每天口服施用一次到五次。在一個(gè)實(shí)施方案中，他侖帕奈W 25mg或50mg的劑量 每天施用一次到五次，任選每天H次。
[0061] 本發(fā)明參考下述研究進(jìn)行舉例說(shuō)明： 實(shí)施例1 ;Nogo A和肥化16的共定位分析 激光掃描細(xì)胞計(jì)量術(shù)（LSC)使用激光來(lái)激發(fā)英光染料，W產(chǎn)生染料在細(xì)胞和組織切片 中的位置的圖像，該允許測(cè)量在所述位置中的表達(dá)。染料連接至與祀向蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。 連接至Alexa 647染料的商業(yè)抗Nogo-A抗體用于鑒定肥化16的祀。商業(yè)Nogo A抗體的 使用允許測(cè)量組織切片中的祀。還期望知道多少祀（Nogo A)定位在肌纖維膜上。該通過(guò) 用連接至Alexa 488染料的針對(duì)肌纖維膜蛋白質(zhì)抗y肌聚糖的抗體染色切片來(lái)進(jìn)行。
[0062] 該允許鑒定和測(cè)量與肌纖維膜共定位且丕與膜共定位的祀（Nogo A)的量。接下 來(lái)，需要定量在給藥的肌肉切片中的肥化16量W及與其祀（Nogo A)的共定位。為了提供 肥化16的該種定量，用Alexa 555染料標(biāo)記的針對(duì)肥化16的非中和性抗獨(dú)特型抗體用于標(biāo) 記肌肉切片。一旦H種組分用H種不同染料標(biāo)記，LSC軟件就可W用于區(qū)分且測(cè)量每種特 征。
[0063] 進(jìn)行充分掃描W鑒定組織切片（灰色圖像)，并且將四個(gè)區(qū)域(藍(lán)綠色框）置于每個(gè) 切片上。高分辨率場(chǎng)掃描產(chǎn)生H種染料的位置圖像。
[0064] 圖1顯示了其中將顏色指定至每個(gè)通道的LSC區(qū)域圖像。例如，各種蛋白質(zhì)染色 為藍(lán)色（Y肌聚糖)、紅色（Nogo A)和綠色（肥8L16)。輪廓為白色的矩形框是構(gòu)成區(qū)域圖 像的各個(gè)場(chǎng)圖像。每個(gè)區(qū)域圖像含有10個(gè)場(chǎng)圖像。
[0065] 產(chǎn)生散布圖W基于英光強(qiáng)度就特征區(qū)分染料像素。像素是使用稱為"口控"的方法 的闊值(使背景噪聲與特異性信號(hào)區(qū)分開(kāi))?？诳刈鳛椴噬€展示在散布圖上，并且根據(jù)口 產(chǎn)生的次序，將口標(biāo)記為R1、R2和R3…等（圖2)。圖2的散布圖通過(guò)針對(duì)彼此標(biāo)繪兩個(gè)通 道來(lái)產(chǎn)生。組織的膜和非膜區(qū)域通過(guò)針對(duì)"綠色強(qiáng)度"標(biāo)繪"綠色最大像素"進(jìn)行區(qū)分。R1 中的最亮像素在用Y肌聚糖抗體標(biāo)記的膜上。R5中的較微暗像素是未標(biāo)記的纖維。長(zhǎng)紅 色強(qiáng)度值針對(duì)膜值(綠色最大像素）進(jìn)行標(biāo)繪，W獲得與膜R2共定位的Nogo A的量。為了 獲得在膜上的藥物量，綠色最大像素針對(duì)黃色強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)繪。因?yàn)樵撌墙o藥前活檢樣品，所 W如果存在的話，在R3中不存在會(huì)含有在膜上的藥物的事件。最后一個(gè)圖顯示將與Nogo A 共定位在膜上的藥物。
[0066] 在口控群體內(nèi)的像素組可W作為彩色框展示在圖像上。該方法被稱為"背景口 控"。驗(yàn)證口的最準(zhǔn)確放置是質(zhì)量控制任務(wù)（圖3)。圖2中的散布圖中的口控群體展示在 圖3的圖像中。由圖3應(yīng)注意到，該些數(shù)據(jù)來(lái)自僅用媒介物給藥的患者，因此存在用針對(duì) 肥8L16的抗獨(dú)特型抗體的最小背景染色W及與Nogo-A共定位的很少證據(jù)(紅色框)。
[0067] 當(dāng)與顯示來(lái)自用15 mg/kg肥化16給藥的患者的數(shù)據(jù)的圖4和5相比較時(shí)，應(yīng)當(dāng) 指出背景口控顯示出顯示丕與Nogo A共定位的肥化16的位置的綠色框，W及顯示肥化16 直Nogo A共定位的紅色框。因此，圖4和5顯示了 R3中的陽(yáng)性藥物事件W及藥物和Nogo A的共定位。
[0068] 圖6顯示了各個(gè)英光通道。給藥前活檢樣品是紅色的，并且與給藥后活檢樣品相 比較，不存在澄色/黃色英光，所述給藥后活檢樣品顯示肥化16與Nogo A的共定位W及不 與Nogo A共定位的過(guò)量肥化16。高共定位沿纖維膜發(fā)生。
[0069] 圖7是顯示在肌纖維膜上與肥化16共定位的Nogo A百分比的圖。切H個(gè)切片并 且評(píng)估每個(gè)患者活檢樣品(用藥物或安慰劑給藥前和后)。在來(lái)自未給藥受試者(給藥前或 安慰劑給藥）的活檢樣品中可見(jiàn)一些低水平的共定位，代表用與Nogo-A共定位的抗獨(dú)特型 抗體可見(jiàn)的非特異性背景染色。更高水平的抗獨(dú)特型染色和共定位在藥物給藥后樣品中始 終可見(jiàn)，其中共定位顯示劑量依賴性增加。突出顯示的切片顯示了在肌肉膜上最高水平的 肥化16與Nogo A的共定位，該在從用15mg/kg肥化16給藥后8天的受試者中收集的活檢 樣品中可見(jiàn)。
[0070] 實(shí)施例2 ;使用共定位實(shí)驗(yàn)研究肥化16對(duì)于肌萎縮側(cè)索硬化（ALS)的最佳劑量方 案 在不存在對(duì)肌肉中的肥化16的藥效應(yīng)答的直接測(cè)量的情況下，使用肥化16在骨骼肌 細(xì)胞的膜上的祀位點(diǎn)處與Nogo-A的共定位，W告知?jiǎng)┝窟x擇，如實(shí)施例1中所述。例如，為 了評(píng)估Nogo-A的肌肉水平和肥化16對(duì)骨骼肌的生物分布，從"在人中首次"（FTiH)研究 中的指定組（cohort)收集肌肉活檢樣品。數(shù)量足W支持免疫組織化學(xué)分析的冷凍活檢樣 品（主要來(lái)自0. 5 mg/kg、2. 5 mg/kg和15 mg/kg組)用針對(duì)Nogo-A的抗體、針對(duì)肥化16的 抗獨(dú)特型抗體和抗Y肌聚糖界定肌肉膜）進(jìn)行染色。使用英光標(biāo)記的二級(jí)抗體顯影表 達(dá)，并且使用激光掃描細(xì)胞計(jì)量術(shù)（LSC)定量。使用該方法，可W評(píng)價(jià)在肌肉膜上的Nogo-A 表達(dá)，并且通過(guò)與Y肌聚糖的共定位而區(qū)別于細(xì)胞內(nèi)Nogo-A表達(dá)。另外，測(cè)量肌肉中的 肥化16水平的估計(jì)值，并且衍生在肌肉膜上Nogo-A與肥化16的共定位程度的估計(jì)值。
[0071] 使用抗獨(dú)特型染色評(píng)價(jià)肌肉中的肥化16水平，觀察到藥物染色中的劑量依賴性 增加，其中在0.5 mg/kg時(shí)無(wú)可測(cè)量的染色，并且在給藥后第22-27天時(shí)，在來(lái)自15 mg/kg 給藥受試者的活檢樣品中可見(jiàn)最高染色(與肌肉中的藥物水平的免疫測(cè)定測(cè)量一致)。改變 15 mg/kg重復(fù)劑量組(組8)中的活檢樣品收集時(shí)間點(diǎn)允許評(píng)價(jià)在給藥后藥物對(duì)肌肉的生物 分布的時(shí)間過(guò)程。該些數(shù)據(jù)顯示在第1天時(shí)在肌肉中最初較低水平的肥化16,增加直到第 8天，然后到第23-24天再次輕微下降。
[0072] 在該些活檢樣品中的膜Nogo-A水平的另外測(cè)量允許評(píng)價(jià)在給藥后在祀位點(diǎn)處 Nogo-A與肥化16的共定位程度。圖8展示了在得自2. 5 mg/kg和15 mg/kg組的給藥后活 檢樣品中的肌細(xì)胞膜處與肥化16共定位的Nogo-A的中值百分比(其中100%將等于所有膜 Nogo-A均與肥化16共定位）。
[0073] 共定位程度緊密跟隨肌肉中測(cè)量的肥化16水平，其中在來(lái)自15 mg/kg處理的受 試者的活檢樣品中可見(jiàn)的水平高于來(lái)自2.5 mg/kg組的活檢樣品。在15 mg/kg重復(fù)劑量 組中，共定位再次與H2化16水平關(guān)聯(lián)，在第1天時(shí)具有?50%中值共定位，在給藥后第8天 時(shí)在肌肉膜上與研究藥物共定位的Nogo-A增至>90%，然后在第22-27天時(shí)回落到?70%。
[0074] 盡管共定位不等于祀占據(jù)，但認(rèn)為肌肉膜Nogo-A與肥化16的>90%共定位是在整 個(gè)劑量間隔上所需的，W便實(shí)現(xiàn)最大藥效作用。基于LSC數(shù)據(jù)，需要15 mg/kg肥化16的劑 量水平W實(shí)現(xiàn)在給藥后第8天時(shí)膜Nogo-A與肥化16的>90%共定位，盡管該共定位程度未 維持到第23-24天。圖9中顯示了探索性PK-ro建模，W研究在活組織檢查時(shí)估計(jì)的血漿 肥化16濃度(使用群體PK模型)與相應(yīng)共定位水平之間的潛在關(guān)系。對(duì)該些數(shù)據(jù)應(yīng)用Emax 模型估計(jì)在"18帖/mL區(qū)域中的ECs。和^leOlVmL的ECg。。
[00巧]基于群體PK建模和后續(xù)模擬來(lái)研究給藥方案W維持血漿肥化16濃度超過(guò)ECg。，顯 而易見(jiàn)的是，在FTiH研究中利用的給藥方案(每4周一次15 mg/kg)預(yù)測(cè)未完全平均維持 在給藥間隔上超過(guò)160嗦/mL的血漿濃度。然而，將給藥頻率增加至每2周一次15 mg/kg 預(yù)測(cè)平均維持在給藥間隔上超過(guò)160嗦/血的濃度。關(guān)于每2和4周施用的15mg/kg預(yù)測(cè) 的血漿肥化16濃度時(shí)間概況在下文分別展示于圖10和圖11中。就每2周15 mg/kg的提 議給藥方案而言，預(yù)測(cè)的肥化16血漿暴露（Cm。,和AUC 展示于表1中。
[007引表1關(guān)于每2周施用的15mg/kg肥化16,預(yù)測(cè)的中值(第5百分位數(shù)和第95百分 位數(shù)）肥化16血漿Cmax和AUC (0-tau)。
【權(quán)利要求】
1. 一種治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的方法，所述方法包括給所述患者施用抗 Nogo-A抗體或其功能片段，其劑量實(shí)現(xiàn)且維持所述抗體與人Nogo-A在所述患者的細(xì)胞膜 上大于90%的共定位水平。
2. 如權(quán)利要求1中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗體劑量為0.1 mg/kg至300 mg/ kg。
3. 如權(quán)利要求2中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗體劑量為15 mg/kg。
4. 如權(quán)利要求3中限定的方法，其中所述大于90%共定位維持8至22天。
5. 如權(quán)利要求4中限定的方法，其中所述大于90%共定位維持10至18天。
6. 如權(quán)利要求5中限定的方法，其中所述大于90%共定位維持11至17天。
7. 如權(quán)利要求6中限定的方法，其中所述大于90%共定位維持12至16天。
8. 如權(quán)利要求6中限定的方法，其中所述大于90%共定位維持13至15天。
9. 如權(quán)利要求8中限定的方法，其中所述大于90%共定位維持14天。
10. -種治療或預(yù)防患者中的神經(jīng)障礙的方法，所述方法包括每14天+/- 3天以15 mg/kg的劑量給所述患者施用抗Nogo-A抗體或其功能片段。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗體是單克隆抗體。
12. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗體是人源化抗體。
13. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗體包括H28L16。
14. 如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)中限定的方法，其中所述神經(jīng)障礙選自中風(fēng)(缺血性或 出血性)、外傷性腦損傷、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病、額顳癡呆（Tau蛋白病)、周圍神經(jīng)病 變、帕金森氏病、克雅氏病（CJD)、精神分裂癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、亨廷頓 氏病、多發(fā)性硬化、包涵體肌炎、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、形態(tài)非特異性肌病、充血性心力衰竭 和神經(jīng)性疼痛。
15. 如權(quán)利要求14中限定的方法，其中所述神經(jīng)障礙是肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)。
16. 如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)中限定的方法，其進(jìn)一步包括與進(jìn)一步的治療劑組合施 用。
17. 如權(quán)利要求16中限定的方法，其中所述進(jìn)一步的治療劑是具有針對(duì)肌萎縮側(cè)索硬 化(ALS)的效力的藥劑。
18. 如權(quán)利要求17中限定的方法，其中所述具有針對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的效力的 藥劑是右旋普拉克索。
19. 如權(quán)利要求16中限定的方法，其中所述進(jìn)一步的治療劑是具有抗谷氨酸活性的化 合物。
20. 如權(quán)利要求19中限定的方法，其中所述具有抗谷氨酸活性的化合物是利魯唑。
【文檔編號(hào)】C07K16/22GK104395343SQ201380035806
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月5日
【發(fā)明者】J.布爾曼, D.克魯爾 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司