Cxcr2的雙互補(bǔ)位結(jié)合多肽及其用途【專利摘要】本發(fā)明涉及針對(duì)或特異性結(jié)合趨化因子受體CXCR2的多肽，特別是能夠調(diào)節(jié)CXCR2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽。本發(fā)明還涉及能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽的核酸、載體和宿主細(xì)胞，包含多肽的藥物組合物，和所述多肽和組合物用于治療涉及CXCR2功能異常的疾病的用途?！緦＠f(shuō)明】CXCR2的雙互補(bǔ)位結(jié)合多肽及其用途[0001]本發(fā)明涉及針對(duì)或特異性結(jié)合趨化因子受體CXCR2的多肽，特別地涉及能夠調(diào)節(jié)來(lái)自CXCR2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽。本發(fā)明還涉及能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽的核酸、載體和宿主細(xì)胞，包含多肽的藥物組合物，和所述多肽和組合物用于治療慢性阻塞性肺?。–OPD)和涉及CXCR2功能異常的其他疾病的用途。[0002]發(fā)明背景[0003]慢性阻塞性肺病（COPD)是用于描述一系列特征是氣流受限的病癥的術(shù)語(yǔ)，其在大部分情況下是進(jìn)行性的，并與肺對(duì)有毒顆粒的異常炎性應(yīng)答相關(guān)，與導(dǎo)致呼吸道功能降低的肺實(shí)質(zhì)破壞相關(guān)（BarnesPJ等人，2003,Chronicobstructivepulmonarydisease:molecularandcellularmechanisms.Eur.RespirJ,22,672-688;BarnesPJ等人，2004,MediatorsofChronicobstructivepulmonarydisease.Pharmacol.Rev.56,515-548)。雖然遺傳因素和環(huán)境因素促進(jìn)COPD的發(fā)展，但吸煙是最重要的單一原因，伴隨有導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性下降的復(fù)發(fā)性肺部感染。只有當(dāng)較早實(shí)施時(shí)，戒煙才降低疾病的發(fā)展，而在出現(xiàn)顯著癥狀后則幾乎沒有效果。一些共患病況與coro相關(guān)，如哮喘、心血管疾病、抑郁和肌肉萎縮（ManninoDM和BuistS,2007GlobalburdenofC0PD:riskfactors,prevalenceandfuturetrends.Lancet,370,765-773)〇[0004]趨化因子是趨化性因子中占優(yōu)勢(shì)的，因此在協(xié)律coro肺中的慢性炎癥及其在急性惡化的過(guò)程中的進(jìn)一步擴(kuò)大中具有關(guān)鍵性作用。趨化因子IL-8(CXCL8)、GROa(CXCLl)和ENA-78(CXCL5)的生物學(xué)活性是由兩群細(xì)胞表面受體CXCRl和CXCR2介導(dǎo)的，所述受體存在于白細(xì)胞和全身許多其他細(xì)胞類型上。白細(xì)胞的迀移主要是通過(guò)CXCR2介導(dǎo)的，CXCR2結(jié)合若干種配體，包括IL_8、GR0a、β、γ、ENA78和GCP-2。相反，CXCRl被IL-8選擇性的激活，并被GCP-2較低程度激活。仍然不清楚人嗜中性粒細(xì)胞的體內(nèi)趨化作用是由一種還是兩種受體介導(dǎo)的。[0005]CXCR2在氨基酸水平與CXCRl共享78%同源性，并且兩種受體以不同的分布模式存在于嗜中性粒細(xì)胞。CXCR在多種細(xì)胞和組織上（包括⑶8+T細(xì)胞、NK、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、表皮、內(nèi)皮、平滑肌和一大類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞類型）的表達(dá)提示了該受體在組成型條件和多種急性和慢性疾病的病理生理學(xué)中具有廣泛的功能作用。CXCR2活化刺激受體與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白的Gi家族，這反過(guò)來(lái)刺激細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇的釋放，增加的胞內(nèi)Ca2+，和，通過(guò)ERK1/2-依賴性的機(jī)制，與受指導(dǎo)的細(xì)胞向趨化因子梯度迀移相關(guān)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化。一經(jīng)活化，CXCR2就被磷酸化，并通過(guò)抑制蛋白/發(fā)動(dòng)蛋白-依賴性的機(jī)制快速內(nèi)化，導(dǎo)致受體脫敏。此過(guò)程與對(duì)于大部分其他GPCR所觀察到的結(jié)果相似，但激動(dòng)劑誘導(dǎo)的CXCR2內(nèi)化的速率和程度大于對(duì)于CXCRl所見到的（RichardsonRM，PridgenBC，HaribabuBjAliHjSyndermanR.1998Differentialcross-regualtionofthehumanchemokinereceptorsCXCRlandCXCR2.Evidencefortime-dependentsignalgeneration.JBiol.Chem，273,23830-23836)。[0006]IL-8已長(zhǎng)期被暗示為COB)中嗜中性粒細(xì)胞炎癥的介質(zhì)（KeatingsVM等人，1996,DifferencesinIL-8andtumornecrosisfactor-aininducedsputumfrompatientswithCOPDandasthma.Am.J.Respir.Crit.CareMed.153,530-534；YamamotoC等人，1997AirwayinflammationinCOPDassessedbysputumlevelsofinterleukin-8.Chest,112,505-510)。在COB)患者的支氣管呼吸道、小呼吸道和肺實(shí)質(zhì)的活組織切片中，存在T細(xì)胞滲入和增加的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)，特別是在呼吸道腔中（HoggJC等人，2004,Thenatureofsmall-airwayobstructioninchronicobstructivepulmonarydisease.N.Eng.J.Med.350,2645-2653)。嗜中性粒細(xì)胞在COro患者的肺中增加，并且這與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)（KeatingsVM等人，1996，DifferencesinIL-8andtumornecrosisfactor-aininducedsputumfrompatientswithCOPDandasthma.Am.J.Respir.Crit.CareMed.153,530-534)。此外，TNFα的水平在COPD患者的痰中升高，并且這從呼吸道的表皮細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-S(Keatings)。相比正常的吸煙者和不吸煙者，COPD患者的誘導(dǎo)的痰和支氣管肺泡灌洗（BAL)液中的GROa濃度明顯上升（TravesSL等人，2002,IncreasedlevelsofthechemokinesGROaandMCP-1insputumsamplesfrompatientswithC0PD.Thorax,57,50-595；PesciA.等人1998,InflammatorycellsandmediatorsinbronchiallavageofpatientswithC0PD.EurRespirJ.12,380-386)。GROα是由肺泡巨噬細(xì)胞和呼吸道表皮細(xì)胞響應(yīng)TNFa刺激的分泌的并選擇性地激活CXCR2，對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞是趨化性的。在COPD患者中，單核細(xì)胞對(duì)GROa的趨化性應(yīng)答增加，可能與這些細(xì)胞中增加的CXCR2更新或再生相關(guān)（TravesSL等人，2004,SpecificCXCbutnotCCchemokinescauseelevatedmonocytemigrationinCOPD:aroleforCXCR2,JLeukoc.Biol.76,441-450)。病毒和細(xì)菌性肺部感染經(jīng)常導(dǎo)致coro患者的嚴(yán)重惡化，其特征是呼吸道中增加的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)（WedzichaJA,SeemungalTA.,2007,COPDexacerbations:definingtheircauseandprevention,Lancet370(9589):786-96)?；技毙試?yán)重的COPD惡化的患者的支氣管活組織切片具有顯著增加的ENA-78、IL-8和CXCR2mRNA的表達(dá)量（QiuY等人，2003,2003,Biopsyneutrophilia,neutrophilchemokineandreceptorgeneexpressioninsevereexacerbationsofchronicobstructivepulmonarydisease.Am.J.Respir.Crit.Care.Med.168,968-975)，且痰具有增加的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（BathoornE,LieskerJJw,PostmaDS等人，Changeininflammationinout-patientCOPDpatientsfromstablephasetoasubsequentexacerbation,(2009)IntJC0PD,4(1):101-9)，提不該受體在COPD和該疾病的嚴(yán)重惡化中都具有潛在的作用。增加的CXCR2mRNA表達(dá)存在于支氣管活組織切片標(biāo)本中，與組織嗜中性粒細(xì)胞的存在相關(guān)（Qiu2003)。ENA-78主要源自上皮細(xì)胞，在COPD惡化的過(guò)程中，ENA-78在上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加（Qiu2003)。因?yàn)镮L-8、GR〇a和ENA-78的濃度在COro呼吸道中增加，并且這三種配體都通過(guò)CXCR2發(fā)信號(hào)，因此，用選擇性的拮抗劑阻斷該共同受體將是該疾病中有效的抗炎對(duì)策。[0007]coro緩慢且進(jìn)行性的發(fā)展，傳統(tǒng)上用肺功能測(cè)試（如測(cè)量用力呼氣量（FEVl)的肺量測(cè)定法）評(píng)估疾病發(fā)展。具有〈50%的預(yù)測(cè)的FEVl的患者被分類為嚴(yán)重。肺功能與死亡率密切相關(guān)，約35%的嚴(yán)重coro患者在12年內(nèi)死于該疾病，相比僅5%的輕至中度患者在12年內(nèi)死于該疾病。COPD是世界第四位的死亡原因（世界衛(wèi)生組織（WHO),WorldHealthReport,Geneva,2000.可從URL:http://www.who.int/whr/2000/en/whr00_annex_en.pdf獲得），并且可以預(yù)測(cè)其流行程度和死亡率在未來(lái)數(shù)十年間仍將增加（LopezAD，ShibuyaK,RaoC等人，2006,Chronicobstructivepulmonarydisease:currentburdenandfutureprojections,EurRespirJ,27(2),397-412)。惡化是不健康的螺旋式下降的關(guān)鍵因素，是造成大部分COPD入院病例的原因（BTS(BritishThoracicSociety),2006,BurdenofLungDiseaseReport,第2版，http://www.brit-thoracic.org.uk/Portals/0/Library/BTS%20Publications/burdeonof_lung_disease2007.pdf)。癥狀定義型惡化的平均年速率是2.3,醫(yī)療定義型惡化的平均年速率是2.8(0'ReillyJF，WilliamsAE,HoltK等人，2006,PrimCareRespirJ.15(6):346-53)。早期診斷、改善的對(duì)患者的惡化管理，以及改善的預(yù)防可幫助降低這些入院者對(duì)現(xiàn)有稀缺的醫(yī)療資源造成的壓力?？衫玫腸oro治療主要是姑息性的，沒有可利用的阻止肺功能衰減或與疾病相關(guān)的呼吸道進(jìn)行性破壞的療法?，F(xiàn)有療法使用例如短效和長(zhǎng)效腎上腺素能支氣管擴(kuò)張藥、吸入式抗膽堿能藥物（毒蕈鹼型拮抗劑）和吸入式皮質(zhì)類固醇治療疾病的癥狀和惡化?，F(xiàn)有的皮質(zhì)類固醇療法的主要限制是隨著患者出現(xiàn)對(duì)皮質(zhì)類固醇的抗性使得它們無(wú)效，使這些藥物的抗炎作用失活。很明顯，對(duì)于阻止coro發(fā)展的新型藥物仍然存在巨大的未滿足的醫(yī)學(xué)訴求。趨化因子受體拮抗劑是令人感興趣的COPD療法的方法，因?yàn)镃OPD中的炎性細(xì)胞信號(hào)運(yùn)輸受多種趨化因子協(xié)律，因此用LMW拮抗劑阻斷趨化因子受體可能是該疾病有效的抗炎對(duì)策。coro的關(guān)鍵特征是在正常吸煙者中可見的炎性應(yīng)答擴(kuò)大，因此，療法的目標(biāo)不是完全抑制炎性細(xì)胞滲入，而是將滲入水平降低至沒有coro的正常吸煙者中可見的水平。通過(guò)特異性作用，抗CXCR2將避免與類固醇相關(guān)的一般性免疫抑制-CXCRl活性的保留允許基線嗜中性粒細(xì)胞活化，這對(duì)于coro和CF中的宿主防御是重要的。目前，大部分的COPD藥物是通過(guò)吸入施用的，以降低全身性的副作用，然而，由于趨化因子拮抗劑作用于在循環(huán)的炎性細(xì)胞中表達(dá)的受體上，因此全身性施用將是最佳的。它將提供到達(dá)在coro中受影響的小呼吸道和肺實(shí)質(zhì)的有效途徑。[0008]趨化因子受體與細(xì)胞因子和白介素受體相反，屬于高度"可施藥的"7TM-GPCR超家族。除此以外，為了發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力拮抗劑的早期嘗試面臨了比基于具有小肽或生物能胺配體的GPCR經(jīng)驗(yàn)所預(yù)期的更多的困難。對(duì)于關(guān)注趨化因子-受體拮抗劑的小分子藥物發(fā)現(xiàn)程序做出的工作開始逐漸了解到趨化因子受體的特應(yīng)性，和小分子作為拮抗劑發(fā)揮作用所需的結(jié)構(gòu)元件。有趣的是，如所鑒別的根本不同的化學(xué)系列物的數(shù)目所表示的，CC-趨化因子-受體拮抗劑的結(jié)構(gòu)多樣性明顯高于CXC-趨化因子-受體拮抗劑，提示發(fā)現(xiàn)拮抗劑的相對(duì)難度在兩類受體之間可能是不同的。[0009]一般而言，已證實(shí)趨化因子受體是難以拮抗的靶，并且為了鑒別有力的、選擇性的CXCR2拮抗劑已付出了巨大的努力。在1998年描述了第1個(gè)低分子量的CXCR2拮抗劑，從那以后，已研發(fā)了多個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性的變構(gòu)CXCR2拮抗劑，其中一些目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。然而仍然明確需要更好和更有力的CXCR2功能的拮抗劑。[0010]在過(guò)去約10年間，免疫球蛋白類分子的臨床用途發(fā)生了巨大的擴(kuò)展。它們對(duì)靶的特異性和使用重組技術(shù)改造它們的能力為研發(fā)疾病的高針對(duì)性的治療提供了巨大的潛力。許多類型的免疫球蛋白分子和修飾的免疫球蛋白分子都潛在地可用于合適的改造，包括常規(guī)的四鏈抗體、Fab和F(ab)2片段、單結(jié)構(gòu)域抗體（D(ab)s)、單鏈Fvs和納米抗體。本文中將結(jié)合本發(fā)明對(duì)這些進(jìn)行進(jìn)一步討論，本發(fā)明涉及被構(gòu)建為針對(duì)CXCR2的至少兩個(gè)表位的多肽。[0011]因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供了用于預(yù)防或治療慢性阻塞性肺病癥或coro和與趨化因子受體CXCR2的功能異常相關(guān)的其他疾病的新手段。[0012]本發(fā)明的其他目標(biāo)是提供治療或預(yù)防COro和與CXCR2的功能異常相關(guān)的其他疾病的手段，所述手段是免疫療法。[0013]本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供包含免疫球蛋白⑶R的多肽，所述多肽是CXCR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑。[0014]發(fā)明概述[0015]本發(fā)明涉及包含2個(gè)免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，所述多肽針對(duì)或結(jié)合趨化因子受體CXCR2,其中所述第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在來(lái)自源自駱駝科動(dòng)物的重鏈抗體的單條重鏈的第一Vhh結(jié)構(gòu)域或其片段中，或是其序列優(yōu)化的，包括人源化的變體，并且所述第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在來(lái)自源自駱駝科動(dòng)物的重鏈抗體的單條重鏈的第二Vhh結(jié)構(gòu)域或其片段中，或是其序列優(yōu)化的，包括人源化的變體并且其中多肽的C末端包含至少一個(gè)額外的氨基酸殘基的向抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列的延伸，并且其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別CXCR2上的第一表位并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別CXCR2上的第二表位。本發(fā)明的優(yōu)選的多肽包含能夠結(jié)合由SEQIDNo.7中所示氨基酸序列組成的線性肽的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和不能結(jié)合或者以低親和力結(jié)合所述線性肽的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO.7是人CXCR2的前19個(gè)N末端氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)選的多肽是雙互補(bǔ)位的。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"雙互補(bǔ)位"意指多肽包含識(shí)別同一蛋白質(zhì)靶上的兩個(gè)不同表位的兩個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。然而，多互補(bǔ)位即，含有識(shí)別同一蛋白質(zhì)靶上的3、4或更多個(gè)表位的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，以及是雙-或多互補(bǔ)位且多價(jià)即，也具有識(shí)別一個(gè)或多個(gè)其他靶蛋白的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。[0016]在本發(fā)明的優(yōu)選的多肽中，包含第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和包含第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列通過(guò)接頭區(qū)連接。如本文中更詳細(xì)的討論所述，接頭可以是或不是免疫球蛋白來(lái)源的，但優(yōu)選是肽。[0017]在本文中，具有可自駱駝科動(dòng)物獲得的僅有重鏈的抗體類型的Vhh氨基酸序列或其片段或變體的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可備選地稱為"VHH結(jié)構(gòu)域"或其片段，或被稱為"納米抗體（Nanobody)"。必須注意到，Nanobody?、Nanobodies?和Nanoclone?是AblynxN.V.的注冊(cè)商標(biāo)。[0018]在本發(fā)明的多肽中，每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)本文定義的CDR，優(yōu)選2個(gè)或3個(gè)CDR。在本發(fā)明的優(yōu)選的多肽中，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是具有：[0019]FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR[0020]結(jié)構(gòu)的Vhh結(jié)構(gòu)域或納米抗體的結(jié)構(gòu)，其中本文中另外定義了CDR和FR。[0021]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的雙互補(bǔ)位納米抗體具有下列結(jié)構(gòu)之一：[0022].FRl-CDRl-FI^-CDI^-FRS-CDRS-FIM--接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT[0023]·FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-接頭一HLE-EXT[0024].FRl-CDRl-FI^-CDI^-FRS-CDRS-FIM--接頭一HLE-接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT[0025]，HLE-接頭--FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT[0026]其中如果FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第二抗原結(jié)構(gòu)域，而如果FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第二抗原結(jié)構(gòu)域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域：HLE是提供增加的體內(nèi)半壽期的結(jié)合單元并且EXT是至少一個(gè)額外的氨基酸殘基的C末端延伸。[0027]本發(fā)明涵蓋了上述優(yōu)選的雙互補(bǔ)位納米抗體的片段或變體，包括其中⑶R和FR是駱駝科動(dòng)物來(lái)源的實(shí)施方案，或其中一個(gè)或多個(gè)FR具有至少一個(gè)人源化替換并且優(yōu)選被完全人源化的實(shí)施方案。[0028]根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的雙互補(bǔ)位納米抗體是本文中命名為163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2和97A9/54B12的抗體，其還具有包含至少一個(gè)額外的氨基酸殘基的C末端延伸，其氨基酸序列顯示在表13中，并且特別是其變體，其中FR包括本文定義的序列優(yōu)化的氨基酸替換，如在表32中顯示了組分的納米抗體。[0029]根據(jù)本發(fā)明的其他特別優(yōu)選的雙互補(bǔ)位納米抗體是表33中所示的那些，其還具有包含至少一個(gè)額外的氨基酸殘基的C末端延伸。[0030]本發(fā)明的優(yōu)選的多肽結(jié)合包含SEQIDNo.I(CXCR2)的氨基酸Fll、F14和W15的表位。在本發(fā)明的優(yōu)選的雙互補(bǔ)位多肽（如雙互補(bǔ)位納米抗體）中，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合在人CXCR2外環(huán)中的表位（SEQIDNo.1的氨基酸殘基106-120,184-208和274-294)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位是構(gòu)象的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述表位包括SEQIDNo.l的氨基酸殘基W112、G115、I282和T285。[0031]本發(fā)明還涵蓋了編碼根據(jù)本發(fā)明的任何多肽的核酸分子，以及編碼其片段的核酸，如編碼包含在雙互補(bǔ)位納米抗體內(nèi)的單個(gè)納米抗體的核酸。本發(fā)明還涵蓋了包含本發(fā)明核酸的載體，和包含所述載體并能夠表達(dá)根據(jù)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞。[0032]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多肽與可藥用的載劑、稀釋劑或賦形劑的組合的藥物組合物。由于本發(fā)明的多肽能夠阻斷、抑制或降低CXCR2的活性，因此其可用于治療其中來(lái)自CXCR2的異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮了作用的疾病。此類疾病可包括動(dòng)脈粥樣硬化、腎小球性腎炎、炎性腸病（克氏?。?、血管發(fā)生、多發(fā)性硬化，銀肩病、壞疽性膿皮病、衰老相關(guān)的黃斑退行性疾病、眼部白塞病、葡萄膜炎、非小細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食道癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌或缺血灌注損傷。此類疾病還可以包括呼吸道的病況，如囊性纖維化、哮喘、嚴(yán)重哮喘、哮喘惡化、過(guò)敏性哮喘、嗜中性粒細(xì)胞性哮喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、特發(fā)性肺纖維化、氣道重塑、細(xì)支氣管炎閉塞綜合征或支氣管肺發(fā)育異常。[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明的多肽用于治療哮喘，特別是嚴(yán)重哮喘和哮喘的惡化。[0034]在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療慢性阻塞性肺病癥（COPD)或coro惡化，其特征是白細(xì)胞（特別是嗜中性粒細(xì)胞）向肺實(shí)質(zhì)的迀移，和之后肺實(shí)質(zhì)的破壞，所述迀移是通過(guò)CXCR2信號(hào)傳遞介導(dǎo)的。本發(fā)明的多肽阻斷、抑制或降低CXCR2活性的能力使其成為用于預(yù)防或治療該疾病的優(yōu)秀候選對(duì)象。[0035]用于治療人類，本發(fā)明的多肽優(yōu)選針對(duì)或特異性結(jié)合人CXCR2。然而優(yōu)選的是如果所述多肽可以與靈長(zhǎng)類CXCR2,特別是與食蟹猴CXCR2交叉反應(yīng)，以便可以在所述猴子中進(jìn)行恰當(dāng)?shù)亩拘詼y(cè)試。如果考慮獸醫(yī)學(xué)用途，則本發(fā)明的多肽可以針對(duì)或特異性結(jié)合來(lái)自其他物種的CXCR2同源物。[0036]由本文的其他討論，本發(fā)明的其他方面是顯而易見的。附圖簡(jiǎn)介[0037]圖1顯示了應(yīng)答曲線，所述應(yīng)答曲線是在增加的納米抗體濃度下測(cè)量本發(fā)明的兩個(gè)納米抗體和雙互補(bǔ)位納米抗體阻斷用激動(dòng)劑Gro-α刺激的CHO-CXCR2膜釋放[35S]GTPyS的能力時(shí)獲得的。[0038]圖Ia顯示了納米抗體54Β12(表9中的SEQIDNo90)的結(jié)果，圖Ib顯示了納米抗體163E3(表9中的SEQIDNo42)的結(jié)果，圖Ic顯示了雙互補(bǔ)位納米抗體54B12/163E3(表13中的SEQIDNo68)的結(jié)果。[0039]圖2通過(guò)GROα的抑制-作為在多個(gè)GRO-α濃度下％抑制相對(duì)抗體濃度顯示了兩個(gè)代表性納米抗體127D1(圖2a)，163Ε3(圖2b)和雙互補(bǔ)位163E-35GS-127D1(圖2c)的效能（potency)和功效（efficacy)。觀察到127D1是有效能的，但不是有功效的，然而163E3具有較低的效能，但比127D1更有功效。當(dāng)組合這兩種結(jié)合分子時(shí)，顯示獲得的雙互補(bǔ)位結(jié)合分子既有效能也有功效。[0040]圖3顯示測(cè)試本發(fā)明的代表性多肽對(duì)CXCR2的特異性高于對(duì)CXCRl的特異性的結(jié)果，如下表中所示?！緳?quán)利要求】1.包含2個(gè)免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，所述多肽針對(duì)或結(jié)合趨化因子受體CXCR2,其中所述第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在來(lái)自源自駱駝科動(dòng)物的重鏈抗體的單條重鏈的第一VHH結(jié)構(gòu)域或其片段中，或是其序列優(yōu)化的，包括人源化的變體，并且所述第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在來(lái)自源自駱駝科動(dòng)物的重鏈抗體的單條重鏈的第二VHH結(jié)構(gòu)域或其片段中，或是其序列優(yōu)化的，包括人源化的變體并且其中多肽的C末端包含至少一個(gè)額外的氨基酸殘基的向抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列的延伸，并且其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別CXCR2上的第一表位并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別CXCR2上的第二表位。2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合由SEQIDNo.7中所示氨基酸序列組成的線性肽，并且所述第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合或者以較低的親和力結(jié)合所述線性肽。3.權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽具有下述結(jié)構(gòu)之一：?FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT?FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--接頭一HLE-EXT?FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接頭一HLE-接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT?HLE-接頭--FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接頭一FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT其中如果FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第二抗原結(jié)構(gòu)域，并且如果FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第二抗原結(jié)構(gòu)域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域：HLE是提供增加的體內(nèi)半壽期的結(jié)合單元并且EXT是至少一個(gè)額外的氨基酸殘基的C末端延伸。4.權(quán)利要求3的多肽，其中肽接頭的長(zhǎng)度在3至50個(gè)氨基酸之間。5.權(quán)利要求4的多肽，其中接頭由氨基酸甘氨酸和絲氨酸構(gòu)成。6.權(quán)利要求5的多肽，其中肽接頭由SEQIDNo220中所示氨基酸序列組成。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多肽，其中C末端延伸是A、AA、AS、AST、ASTKP或GGGS。8.根據(jù)權(quán)利要求7的多肽，其中C末端延伸由2個(gè)丙氨酸殘基組成。9.包含權(quán)利要求3的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1-8的多肽，其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.213、214、216和219,或與這些中的一條具有至少80%同一性的多肽，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.215、217和218,或與這些中的一條具有至少80%同一性的多肽。10.包含如權(quán)利要求3中要求的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1-8的多肽，其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白中，⑶R1包含如SEQIDNo141中所示氨基酸序列，⑶R2包含SEQIDNo236中所示氨基酸序列，并且⑶R3包含SEQIDNo181中所示氨基酸序列，并且其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白中，⑶R4包含如SEQIDNo146中所示氨基酸序列，CDR5包含SEQIDNo237中所示氨基酸序列，并且CDR6包含SEQIDNo186中所示氨基酸序列。11.權(quán)利要求10的多肽，其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.216或與SEQIDNo.216具有至少80%同一性的多肽，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.217或與SEQIDNo.217具有至少80%同一性的多肽。12.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，包含SEQIDNo.221和由2個(gè)丙氨酸殘基組成的C末端延伸。13.包含如權(quán)利要求3中要求的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1-8的多肽，其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白中，⑶R1包含如SEQIDNo141中所示氨基酸序列，⑶R2包含SEQIDNo236中所示氨基酸序列，并且⑶R3包含SEQIDNo181中所示氨基酸序列，并且其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白中，⑶R4包含如SEQIDNo145中所示氨基酸序列，CDR5包含SEQIDNo165中所示氨基酸序列，并且CDR6包含SEQIDNo185中所示氨基酸序列。14.權(quán)利要求13的多肽，其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.216或與SEQIDNo.216具有至少80%同一性的多肽，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.218或與SEQIDNo.218具有至少80%同一性的多肽。15.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，包含SEQIDNo.222和由2個(gè)丙氨酸殘基組成的C末端延伸。16.包含如權(quán)利要求3中要求的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1-8的多肽，其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白中，⑶R1包含如SEQIDNo141中所示氨基酸序列，⑶R2包含SEQIDNo236中所示氨基酸序列，并且⑶R3包含SEQIDNo181中所示氨基酸序列，并且其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白中，⑶R4包含如SEQIDNo143中所示氨基酸序列，CDR5包含SEQIDNo235中所示氨基酸序列，并且CDR6包含SEQIDNo183中所示氨基酸序列。17.權(quán)利要求16的多肽，其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.216或與SEQIDNo.216具有至少80%同一性的多肽，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.215或與SEQIDNo.215具有至少80%同一性的多肽。18.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，包含SEQIDNo.216和SEQIDNo.215,所述SEQIDNo.216和SEQIDNo.215被具有SEQIDNo.220的接頭分開。19.包含如權(quán)利要求3中要求的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1-8的多肽，其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白中，⑶R1包含如SEQIDNo151中所示氨基酸序列，⑶R2包含SEQIDNo171中所示氨基酸序列，并且⑶R3包含SEQIDNo191中所示氨基酸序列，并且其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白中，⑶R4包含如SEQIDNo146中所示氨基酸序列，CDR5包含SEQIDNo237中所示氨基酸序列，并且CDR6包含SEQIDNo186中所示氨基酸序列。20.權(quán)利要求19的多肽，其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.219或與SEQIDNo.219具有至少80%同一性的多肽，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.217或與SEQIDNo.217具有至少80%同一性的多肽。21.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，包含SEQIDNo.223和由2個(gè)丙氨酸殘基組成的C末端延伸。22.包含如權(quán)利要求3中要求的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1-8的多肽，其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白中，⑶R1包含如SEQIDNo151中所示氨基酸序列，⑶R2包含SEQIDNo171中所示氨基酸序列，并且⑶R3包含SEQIDNo191中所示氨基酸序列，并且其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白中，⑶R4包含如SEQIDNo145中所示氨基酸序列，CDR5包含SEQIDNo165中所示氨基酸序列，并且CDR6包含SEQIDNo185中所示氨基酸序列。23.權(quán)利要求22的多肽，其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.219或與SEQIDNo.219具有至少80%同一性的多肽，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.218或與SEQIDNo.218具有至少80%同一性的多肽。24.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，包含SEQIDNo.224和由2個(gè)丙氨酸殘基組成的C末端延伸。25.包含如權(quán)利要求3中要求的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1-8的多肽，其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第二免疫球蛋白中，⑶R1包含如SEQIDNo151中所示氨基酸序列，⑶R2包含SEQIDNo171中所示氨基酸序列，并且⑶R3包含SEQIDNo191中所示氨基酸序列，并且其中在所述單可變結(jié)構(gòu)域的第一免疫球蛋白中，⑶R4包含如SEQIDNo143中所示氨基酸序列，CDR5包含SEQIDNo235中所示氨基酸序列，并且CDR6包含SEQIDNo183中所示氨基酸序列。26.權(quán)利要求25的多肽，其中第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.219或與SEQIDNo.219具有至少80%同一性的多肽，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNo.215或與SEQIDNo.215具有至少80%同一性的多肽。27.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，包含SEQIDNo.219和SEQIDNo.215和由2個(gè)丙氨酸殘基組成的C末端延伸，所述SEQIDNo.219和SEQIDNo.215被具有SEQIDNo.220的接頭分開。28.權(quán)利要求1-27的多肽，其中所述第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合表位，所述表位包含SEQIDNo.1的氨基酸F11、F14和W15。29.權(quán)利要求1-28的多肽，其中所述表位是線性的。30.權(quán)利要求1-29的多肽，其中所述第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合人CXCR2的外環(huán)中的表位（SEQIDNo.1的氨基酸殘基106-120、184-208和274-294)。31.權(quán)利要求1-30的多肽，其中所述表位在SEQIDNo.1的氨基酸殘基106-120中。32.權(quán)利要求1-31的多肽，其中所述表位是構(gòu)象的。33.權(quán)利要求1-32的多肽，其中所述第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合CXCR2的表位，所述表位包含SEQIDNo.1的氨基酸殘基W112、G115、1282和T285。34.權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽可以以1(T5至1(T12摩爾/升或更低，并且優(yōu)選1(T7至1(T12摩爾/升或更低，并且更優(yōu)選1(T8至1(T12摩爾/升的解離常數(shù)（Kd)特異性結(jié)合人CXCR2。35.權(quán)利要求1至34中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽可以以在10至約10之間，優(yōu)選在lO^^slP107M_1s_1之間，更優(yōu)選在104M_1slP107M_1s_1之間，如在105M_1s1口lOlY1之間的締合速率（km-速率）特異性結(jié)合人CXCR2。36.權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽可以以在It1和KrY1之間，優(yōu)選在10_2^和10if之間，更優(yōu)選在10_3s_i和10_6^之間，如在10_4s_i和10_6^之間的解離速率（k。^速率）特異性結(jié)合人CXCR2。37.權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽可以以低于500nM，優(yōu)選低于200nM，更優(yōu)選低于10nM，如低于500pM的親和力特異性結(jié)合人CXCR2。38.權(quán)利要求1至37中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽能夠以低于20nM的IC50抑制Gro-a與人CXCR2的結(jié)合。39.權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽能夠以低于100nM的IC50抑制表達(dá)人CXCR2的RBL細(xì)胞的Gro-a-誘導(dǎo)的鈣釋放。40.權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽能夠以低于50nM的IC50抑制在人CH0-CXCR2膜中Gro-a-誘導(dǎo)的[35S]GTPyS積累。41.根據(jù)權(quán)利要求1至100中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽能夠交叉阻斷CXCR2與權(quán)利要求12、15、18、21、24或27中任一項(xiàng)的多肽的結(jié)合。42.根據(jù)權(quán)利要求1至18或28至41中的任一項(xiàng)的多肽，其由選自SEQIDNo.225,226或227的序列組成，所述序列任一具有由兩個(gè)丙氨酸殘基組成的C末端延伸。43.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽的核酸分子。44.表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含如權(quán)利要求43要求的核酸分子。45.宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求43的核酸序列的根據(jù)權(quán)利要求1至42的多肽。46.通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求45的宿主細(xì)胞可獲得的雙互補(bǔ)位或多互補(bǔ)位納米抗體。47.藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽和可藥用的載劑或稀釋劑。48.根據(jù)權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽用作藥物。49.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽用于治療慢性阻塞性肺病（C0PD)和coro的惡化。50.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽用于治療囊性纖維化、哮喘、特別是嚴(yán)重哮喘和哮喘惡化、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、特發(fā)性肺纖維化、氣道重塑、細(xì)支氣管炎閉塞綜合征或支氣管肺發(fā)育異常。51.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、腎小球性腎炎、炎性腸?。耸喜。⒀馨l(fā)生和以新血管發(fā)育為特征的疾病，包括黃斑退化、糖尿病視網(wǎng)膜病和糖尿病腎病、多發(fā)性硬化、銀肩病、壞疽性膿皮病、衰老相關(guān)的黃斑退行性疾病、眼部白塞病、葡萄膜炎、包括特發(fā)性PAH、家族性PAH和相關(guān)的PAH的肺動(dòng)脈高壓（PAH)、慢性炎癥性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、非小細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、缺血再灌注損傷、鐮刀細(xì)胞疾病中由溶血性輸血誘導(dǎo)的血管閉塞危險(xiǎn)、缺血/再灌注損傷、急性中風(fēng)/心肌梗塞、閉鎖性頭部損傷、創(chuàng)傷后炎癥或胰島素抗性糖尿病。52.治療慢性阻塞性肺?。–0PD)或（C0PD)惡化的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康母鶕?jù)權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽。53.治療選自由囊性纖維化、哮喘、特別是嚴(yán)重哮喘和哮喘惡化、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、特發(fā)性肺纖維化、氣道重塑、細(xì)支氣管炎閉塞綜合征或支氣管肺發(fā)育異常組成的組的病況的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康母鶕?jù)權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽。54.治療選自由動(dòng)脈粥樣硬化、腎小球性腎炎、炎性腸?。耸喜。?、血管發(fā)生和以新血管發(fā)育為特征的疾病，包括黃斑退化、糖尿病視網(wǎng)膜病和糖尿病腎病、多發(fā)性硬化、銀肩病、壞疽性膿皮病、衰老相關(guān)的黃斑退行性疾病、眼部白塞病、葡萄膜炎、包括特發(fā)性PAH、家族性PAH和相關(guān)的PAH的肺動(dòng)脈高壓（PAH)、慢性炎癥性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、非小細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食道癌，卵巢癌、乳腺癌、實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、缺血再灌注損傷、鐮刀細(xì)胞疾病中由溶血性輸血誘導(dǎo)的血管閉塞危險(xiǎn)、缺血/再灌注損傷、急性中風(fēng)/心肌梗塞、閉鎖性頭部損傷、創(chuàng)傷后炎癥或胰島素抗性糖尿病組成的組的病況的方法，所述方法通過(guò)向?qū)ο笫┯糜行Я康母鶕?jù)權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽。55.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽在制造用于治療慢性阻塞性肺?。–OPD)或COPD惡化的藥物中的用途。56.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽在制造用于治療哮喘、特別是嚴(yán)重哮喘和哮喘惡化、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、特發(fā)性肺纖維化、氣道重塑、細(xì)支氣管炎閉塞綜合征或支氣管肺發(fā)育異常的藥物中的用途。57.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的多肽在制造用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、腎小球性腎炎、炎性腸?。耸喜。?、血管發(fā)生和以新血管發(fā)育為特征的疾病，包括黃斑退化、糖尿病視網(wǎng)膜病和糖尿病腎病、多發(fā)性硬化、銀肩病、壞疽性膿皮病、衰老相關(guān)的黃斑退行性疾病、眼部白塞病、葡萄膜炎、包括特發(fā)性PAH、家族性PAH和相關(guān)的PAH的肺動(dòng)脈高壓（PAH)、慢性炎癥性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、非小細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食道癌，卵巢癌、乳腺癌、實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、缺血再灌注損傷、鐮刀細(xì)胞疾病中由溶血性輸血誘導(dǎo)的血管閉塞危險(xiǎn)、缺血/再灌注損傷、急性中風(fēng)/心肌梗塞、閉鎖性頭部損傷、創(chuàng)傷后炎癥或胰島素抗性糖尿病的藥物中的用途?！疚臋n編號(hào)】C07K16/28GK104487456SQ201380036290【公開日】2015年4月1日申請(qǐng)日期:2013年5月8日優(yōu)先權(quán)日:2012年5月9日【發(fā)明者】Z·布朗,M·布拉德利,S·J·查爾頓,G·A·范黑克,K·克羅米,B·東布雷克特,S·斯特芬森,J·鮑邁斯德,M-P·布歇,C·布東,M-A·比斯,V·斯諾埃克,S·斯塔埃朗申請(qǐng)人:諾華股份有限公司