通過用正電性有機(jī)添加劑處理來降低蛋白質(zhì)制劑中蛋白質(zhì)-污染物復(fù)合物和聚集物水平 ...的制作方法
【專利摘要】通過以低濃度的正電性有機(jī)添加劑(例如依沙吖啶、氯己定或聚乙烯亞胺)與酰脲(例如尿素、尿酸或尿囊素)或有機(jī)調(diào)節(jié)劑(例如非離子有機(jī)聚合物、表面活性劑、有機(jī)溶劑或酰脲)的組合的處理來降低抗體和其他蛋白質(zhì)制劑中的聚集物水平的方法。本發(fā)明的一些方面涉及用于降低細(xì)胞培養(yǎng)物收獲物的聚集物水平并使其澄清的方法。其還涉及將這些能力與另一些純化方法整合，以達(dá)到期望的最終純化水平。
【專利說明】通過用正電性有機(jī)添加劑處理來降低蛋白質(zhì)制劑中蛋白 質(zhì)-污染物復(fù)合物和聚集物水平的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)包含抗體在內(nèi)的蛋白的純化的方法。其特別涉及用于降低細(xì) 胞培養(yǎng)物收獲物的聚集物水平并使其澄清的方法。其還涉及將這些能力與另一些純化方法 整合，以達(dá)到期望的最終純化水平。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 有研宄表明，來源于宿主細(xì)胞的污染物與體外細(xì)胞培養(yǎng)法產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)之 間自發(fā)形成非天然的異質(zhì)結(jié)合（Shukla等，Biotechnol.Progr. (2008)24:1115-1121; Luhrs等，J.Chromatogr.B(2009) 877: 1543-1552;Mechetner等，J.Chromatogr. B(2011)879:2583-2594;Gagnon等，J.Chromatogr.A, (2011) 1218:2405-2412 ; Gagnon,BioprocessingJ. (2010)9(4) :14-24)。這些異質(zhì)結(jié)合可在兩個(gè)方面視作非天然 的：1)組成型污染物常常是非人源的，由活的非人宿主細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中或當(dāng)非人宿主 細(xì)胞在死亡后裂解時(shí)釋放至培養(yǎng)基中。在活人體內(nèi)，這樣的非人污染物不存在；以及2)與 快速消除死細(xì)胞組分的人體內(nèi)系統(tǒng)相比，組成型污染物積累至高濃度。因此，重組產(chǎn)物暴露 于一般不出現(xiàn)在活系統(tǒng)中的濃度的高水平強(qiáng)相互作用性污染物。同時(shí)，重組蛋白質(zhì)的高表 達(dá)水平使它們成為與這些非人污染物非特異性結(jié)合的合適底物，傾向于形成不期望的多種 組合物的異質(zhì)結(jié)合，包括復(fù)合物和聚集物。
[0004] 通過直接革E1向污染性蛋白質(zhì)（Shukla等和Gagnon等，見上文）以及間接通過革巴向 與污染性蛋白質(zhì)有關(guān)的相應(yīng)DNA組分（Luhrs等和Gagnon，間上文），在一定程度上克服了 異質(zhì)聚集物中的污染性蛋白含量。當(dāng)一些復(fù)合物解離時(shí)，指示抗體聚集水平的降低（Shukla 等、Mechetner等和Gagnon，見上文）。公開了陰離子交換劑降低抗體-污染物復(fù)合物水平 的的能力（Luhrs等和Gagnon等，見上文），但是沒有指示陰離子交換處理能夠完全消除異 質(zhì)聚集物。已經(jīng)嘗試使用了尺寸排阻色譜、陽(yáng)離子交換色譜和疏水相互作用色譜來降低異 質(zhì)聚集物，但是這些技術(shù)一般不如陰離子交換（Gagnon等，見上文）。
[0005]用可期望使異質(zhì)聚集物解離的試劑處理抗體制劑一般被證明是無(wú)效的。例如，使 用高濃度尿素、鹽或這兩者的組合基本不使IgM-污染物的異質(zhì)聚集物解離（Gagnon等，見 上文）。有研宄表明，以尿素、醇和表面活性劑進(jìn)行洗脫前洗滌的蛋白A親和色譜比不進(jìn)行 洗滌更有效地降低異質(zhì)聚集物水平（Shukla等，見上文），組合尿素、鹽和EDTA以及蛋白G 親和色譜的洗脫前洗滌的亦有此效果（Mechetner等，見上文）。有研宄表明，以尿素進(jìn)行 洗脫前洗滌的陰離子交換色譜比沒有尿素洗滌更有效地減少異質(zhì)聚集物（Gagnon等，見上 文）。還有研宄表明，以EDTA進(jìn)行洗脫前洗滌的陽(yáng)離子交換色譜比不進(jìn)行洗滌更有效地減 少異質(zhì)聚集物（Gagnon等，見上文）。最后，以尿素和/或鹽進(jìn)行洗脫前洗滌的羥磷灰石層 析也比不進(jìn)行這樣的洗滌更有效地減少異質(zhì)聚集物（Gagnon，見上文）。盡管有這些發(fā)現(xiàn)， 但是一般而言，在對(duì)結(jié)合至色譜柱的抗體進(jìn)行洗脫前洗滌中使用解離試劑僅取得了中度的 成功。
[0006] 有研宄指示了正電性有機(jī)添加劑用于酸性蛋白質(zhì)沉淀（Farhner等，美國(guó)專利申 請(qǐng)No. 20080193981;Ma等，J.Chromatogr.B(2010)878:798-806;Peram等，Biotechnol.Progr.，（2010) 26:1322-1326 ;Glynn，inU.Gottschalk(編寫），ProcessScale PurificationofAntibodies,J.T.Wiley和Sons, (2009)Hoboken, 309-324)，以及用于 DNA和內(nèi)毒素沉淀（Glynn，見上文；Cordes等，Biotechnol.Progr.，（1990) 6:283-285 ; Dissingetal.，Bioseparation, (1999)7221:9-11)和病毒失活（Bernhardt，美國(guó)專利 5, 559, 250)。還有研宄表明，多價(jià)金屬陽(yáng)離子從一些蛋白制劑去除DNA和內(nèi)毒素（Akcasu 等，Nature, (1960) 187:323-324;Matsuzawa等，Nucl.AcidsRes.，（2003) 3 (3): 163-164; Christensen等，Prot.Expr.Purif.，（2004)37:468-471;Kejnovsky等，Nucl.Acids Res.，（1997) 25:1870-1871 ;0ngkudon等，Anal.Chem.，（2011) 83391:13-17) 〇 [0007]發(fā)明概述
[0008] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過以正電性有機(jī)添加劑處理樣品來降低 包含所需蛋白質(zhì)種類的樣品（例如蛋白質(zhì)制劑）中產(chǎn)物-污染物復(fù)合物和聚集物的量的方 法。在某些實(shí)施方案中，以超低水平的正電性有機(jī)添加劑實(shí)現(xiàn)復(fù)合物和/或聚集物的減少。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明特別降低包含染色質(zhì)殘余物（例如核小體和/或組蛋白和/或 DNA)的聚集物的含量。在某些實(shí)施方案中，在升高的電導(dǎo)率值（鹽濃度）下處理所述樣品。 在某些實(shí)施方案中，以未溶解的酰脲額外處理所述樣品，并收集包含所需蛋白質(zhì)的上清。在 某些實(shí)施方案中，替選地或額外的用諸如非離子有機(jī)聚合物、有機(jī)溶劑、表面活性劑或酰脲 的其他有機(jī)添加劑處理所述樣品，以增強(qiáng)復(fù)合物或聚集物中與所需蛋白質(zhì)結(jié)合的污染物的 解離。在某些實(shí)施方案中，隨后將經(jīng)處理的樣品暴露于攜帶化學(xué)部分的固體材料，所述化學(xué) 部分從所述所需蛋白質(zhì)選擇性去除正電性有機(jī)添加劑以及其他可能的化學(xué)實(shí)體。
[0009] 發(fā)明詳述
[0010] 提供了用于蛋白質(zhì)純化的方法和試劑盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過 使抗體或其他蛋白質(zhì)與正電性有機(jī)添加劑接觸來從抗體或其他蛋白質(zhì)的制劑中減少蛋白 質(zhì)-污染物復(fù)合物和聚集物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以在從所謂生理學(xué)條件至最高 3倍或更多倍這樣的生理學(xué)條件的電導(dǎo)率值的電導(dǎo)率水平范圍內(nèi)實(shí)施；這樣的升高的電導(dǎo) 率水平可抑制所需蛋白質(zhì)或靶蛋白的沉淀。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以超低濃度的正 電性有機(jī)添加劑來實(shí)施，例如是這樣的添加劑用于介導(dǎo)沉淀目的時(shí)的濃度的1/10或1/100 的水平。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以下優(yōu)點(diǎn)，降低針對(duì)為目的蛋白定制的要求開發(fā) 要求的需要、改進(jìn)目的蛋白的回收、改進(jìn)純化方法的重現(xiàn)性并降低去除聚集物的額外處理 步驟的需要。
[0011] 本文公開的實(shí)施方案提供了降低包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集物含量的方法，所 述方法包括使所述樣品與正電性有機(jī)添加劑和未溶解的酰脲接觸。
[0012] 在一些這樣的實(shí)施方案中，在15mS/cm或更高的電導(dǎo)率值下降低包含所需蛋白質(zhì) 的樣品的聚集物含量的方法，所述方法包括以〇. 1 %或更低濃度添加正電性有機(jī)添加劑。
[0013] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，降低包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集物含量的 方法，所述樣品具有5mS/cm或更高電導(dǎo)率值，所述方法包括在一種或多種有機(jī)添加劑的存 在下以0. 1%或更低的濃度添加正電性有機(jī)添加劑，以減少沉淀形成，其中所述一種或多種 有機(jī)添加劑選自酰脲、有機(jī)溶劑或表面活性劑。
[0014] 在前述實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)中，降低包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集物含量的方 法，所述方法包括提供包含聚集物的樣品，以及使所述樣品與正電性有機(jī)添加劑接觸，其中 所述所需蛋白質(zhì)溶解于所述樣品中。
[0015] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述酰脲是尿囊素。
[0016] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述酰脲以約0. 5 %重量/體積至約2 %重量 /體積的范圍存在。
[0017] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述正電性有機(jī)添加劑包含選自依沙吖啶、 氯己定、聚乙烯亞胺、亞甲藍(lán)和苯扎氯銨中的一種。
[0018] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，在添加正電性有機(jī)添加劑之前添加所述酰 脲。
[0019] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，添加鹽至基本防止所需蛋白質(zhì)形成沉淀的水 平。
[0020] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述所需蛋白質(zhì)包含選自抗體、因子VIII、生 長(zhǎng)激素和重組蛋白質(zhì)中的一種。
[0021] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，添加所述正電性有機(jī)添加劑至1 %重量/體 積或更低重量/體積的水平。
[0022] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，添加所述正電性有機(jī)添加劑至0. 1 %重量/ 體積或更低重量/體積的水平。
[0023] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，添加所述正電性有機(jī)添加劑至0. 01%重量/ 體積或更低重量/體積的水平。
[0024] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，添加所述正電性有機(jī)添加劑至0. 001%重量 /體積或更低重量/體積的水平。
[0025] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述正電性有機(jī)添加劑以0. 02 %至0. 03% 的濃度范圍存在。
[0026] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，存在多種正電性有機(jī)添加劑。
[0027] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃度是1% 重量/體積或更低重量/體積。
[0028] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃度是 0. 1 %重量/體積或更低重量/體積。
[0029] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃度是 〇. 〇1 %重量/體積或更低重量/體積。
[0030] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃度是 0. 001 %重量/體積或更低重量/體積。
[0031] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述未溶解的酰脲是尿囊素。
[0032] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，尿囊素以約0. 56%重量/體積至約1%重量 /體積的濃度范圍存在。
[0033] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，尿囊素以約1%重量/體積至約2%重量/體 積的濃度范圍存在。
[0034] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，尿囊素以約2%重量/體積至約5%重量/體 積的濃度范圍存在。
[0035] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，尿囊素以約5 %重量/體積至約10 %重量/ 體積的濃度范圍存在。
[0036] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，尿囊素以約10%重量/體積至約15%重量/ 體積的濃度范圍存在。
[0037] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，在添加所述正電性有機(jī)添加劑之前向所述樣 品中添加酰脲。
[0038] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至足夠高的水平以 抵消所述所需蛋白質(zhì)因沉淀而造成的大量損失。
[0039] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至比抵消所述所需 蛋白質(zhì)的大量損失所需水平更高的水平。
[0040] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)為高至生理學(xué)電導(dǎo) 率的兩倍。
[0041] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)為高至生理學(xué)電導(dǎo) 率的三倍過更高。
[0042] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，降低所述樣品的電導(dǎo)率，但保持足夠高以抵 消所述所需蛋白質(zhì)的大量損失。
[0043] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，在添加所述正電性有機(jī)添加劑之前調(diào)節(jié)所述 樣品的電導(dǎo)率。
[0044] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，存在有機(jī)溶劑。
[0045] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑包括選自乙醇、異丙醇、乙二 醇、丙二醇、三（正丁基）磷酸酯和甘油中的一種。
[0046] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑包括約0. 01 %重量/體積至約 20 %重量/體積范圍的濃度。
[0047] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑包括約0. 01%至約1%濃度范 圍的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇、異丙醇或三（正丁基）磷酸酯。
[0048] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑包括約1%至約5%濃度范圍 的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇或異丙醇。
[0049] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑包括約5 %至約10 %濃度范圍 的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇或異丙醇。
[0050] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑包括約10%至約20%濃度范 圍的乙二醇、丙二醇或甘油。
[0051] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，存在有機(jī)溶劑，并且其包含選自乙醇、異丙醇 和三（正丁基）磷酸酯中的一種。
[0052] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑的濃度小于1%。
[0053] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑的濃度小于0. 1%。
[0054] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述有機(jī)溶劑的濃度小于0. 01%。
[0055] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，存在可溶酰脲。
[0056] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述可溶酰脲是尿素。
[0057] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述可溶酰脲以約0. 5M至約1M的濃度范圍 存在。
[0058] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述可溶酰脲以約1M至約2M的濃度范圍存 在。
[0059] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述可溶酰脲以約2M至約4M的濃度范圍存 在。
[0060] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述可溶酰脲以約4M至約8M的濃度范圍存 在。
[0061 ] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，存在表面活性劑。
[0062] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述表面活性劑包括非離子表面活性劑。
[0063] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述表面活性劑包括選自吐溫和Triton中 的一種。
[0064] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述表面活性劑包括兩性離子表面活性劑。
[0065] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述兩性離子表面活性劑包括選自CHAPS、 CHAPS0和十八燒基葡糖苷（octaglucoside)中的一種。
[0066] 56.如權(quán)利要求51至55中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑以低于1 %的 非零濃度存在。
[0067] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述表面活性劑以低于0. 1%的非零濃度存 在。
[0068] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述表面活性劑以低于0. 01%的非零濃度存 在。
[0069] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，存在螯合劑。
[0070] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述螯合劑帶正電。
[0071] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述帶正電的螯合劑包括三（2-氨基乙基） 胺或去鐵胺。
[0072] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述螯合劑以低于100mM的非零濃度存在。
[0073] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述螯合劑以低于50mM的非零濃度存在。
[0074] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述螯合劑以低于20mM的非零濃度存在。
[0075] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述螯合劑以低于10mM的非零濃度存在。
[0076] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述螯合劑以低于5mM的非零濃度存在。
[0077] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，存在以下物質(zhì)中的多種：(a)有機(jī)溶劑，（b) 有機(jī)聚合物，（c)可溶酰脲，（d)表面活性劑，（e)螯合劑和（f)鹽。
[0078] 在前述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)中，所述被接觸的樣品暴露于一種或多種固體， 以在隨后的使所述所需蛋白質(zhì)與殘余的污染物分離的處理步驟之前除去至少一種正電性 有機(jī)添加劑。
[0079] 提供了用于實(shí)施前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述方法的試劑盒。
[0080] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于降低具有比所需蛋白質(zhì)更高分子量的聚集 物（例如同質(zhì)聚集物）水平的方法，還提供了用于降低流體動(dòng)力學(xué)尺寸僅中度大于所需蛋 白質(zhì)的聚集物（例如異質(zhì)聚集物）的水平的方法。在某些實(shí)施方案中，聚集物包括所需蛋 白質(zhì)與污染物的異質(zhì)聚集物，并且在某些這樣的實(shí)施方案中，所述污染物是核酸、核苷酸、 內(nèi)毒素、金屬離子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基組分。在某些實(shí)施方案中，基本消除存在的所 需蛋白質(zhì)的同質(zhì)聚集物。在某些實(shí)施方案中，基本消除存在的所需蛋白質(zhì)與污染物的異質(zhì) 聚集物。
[0081] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了與聚集物的減少一起的諸如DNA、內(nèi)毒素和病 毒等污染物水平的降低。在某些實(shí)施方案中，通過額外包括抗病毒劑來實(shí)施本發(fā)明。
[0082] 在某些實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)種類（例如待純化的所需蛋白質(zhì)）是重組來源的， 并且蛋白質(zhì)制劑可包括：包含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物收獲物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清、澄清的細(xì)胞培養(yǎng) 物上清、色譜柱的洗脫物或得自之前純化步驟的包含蛋白質(zhì)的溶液。在某些實(shí)施方案中，所 述蛋白質(zhì)制劑包含抗體，并且在某些這樣的實(shí)施方案中，所述抗體是IgG、IgM或其片段形 式，或者抗體或抗體片段的融合蛋白，例如Fc融合蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述所需蛋 白質(zhì)可為凝血蛋白，例如因子VIII。在某些實(shí)施方案中，所述所需蛋白質(zhì)可為肽激素，例如 人生長(zhǎng)激素。
[0083] 在某些實(shí)施方案中，使所述樣品的電導(dǎo)率處于基本避免所述所需蛋白質(zhì)從所述樣 品中沉淀的足夠高的水平來實(shí)施本發(fā)明?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法通過添加鹽或稀釋劑來 調(diào)節(jié)電導(dǎo)率。在某些實(shí)施方案中，所述電導(dǎo)率比確定為避免所述所需蛋白質(zhì)大量沉淀所需 的水平高51113/〇11、1〇1113/〇11、151113/〇]1或2〇1113/〇]1。在某些實(shí)施方案中，所述電導(dǎo)率大于2〇1113/ cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45ms/cm或大于 45mS/cm。在升高的電導(dǎo)率下去除 重要的污染物亞群的方法的能力是本發(fā)明的令人意想不到的特征之一，因?yàn)橐阎谏叩?電導(dǎo)率下這些系統(tǒng)中的電荷相互作用降低。例如，在25mS/cm和更高的電導(dǎo)率下，已知僅少 數(shù)帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合至正電性表面。除了本方法之外，制備IgG抗體的大多數(shù)正電性試 劑的應(yīng)用在低于5mS/cm的電導(dǎo)率下進(jìn)行，并且通常具有附加的堿性pH運(yùn)行要求。本方法 不要求這樣的運(yùn)行pH。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是，升高的電導(dǎo)率可具有弱化聚集 物中內(nèi)部靜電結(jié)合的效果，并因此提高本方法實(shí)現(xiàn)解離聚集物和/或去與所需蛋白質(zhì)結(jié)合 的污染物的能力。
[0084]在某些實(shí)施方案中，所述正電性有機(jī)添加劑是依沙吖啶、9-氨基吖啶（氨吖啶）、 3, 6吖啶二胺（原黃素）、吖啶瑣辛、叮啶氯（酚吖啶）、吖啶橙、喹吖因、樂殺螨（acricide)、 吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶（1_[ (6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨基]-3-(二乙基 氨基）-2-丙醇二鹽酸鹽）、酚藏花紅、酚噁嗪、吩噻嗪、B丫啶黃（氯化3, 6-二氨基-10-甲基 吖啶和3, 6-吖啶二胺）、聚乙烯亞胺（聚（亞氨基亞乙基））、氯己定或聚氨基酸。在某些 實(shí)施方案中，所述正電性有機(jī)添加劑是依沙吖啶、聚乙烯亞胺或氯己定，或其鹽。
[0085]在某些實(shí)施方案中，以基本為足以促進(jìn)期望的聚集物減少程度的最低濃度來提供 所述正電性有機(jī)添加劑。在某些實(shí)施方案中，所述正電性有機(jī)添加劑的濃度為低于（基于 重量/體積）〇.l%、〇. 05%、0. 04%、0. 025%或0. 001%。在某些實(shí)施方案中，以0. 01%至 0. 04 %或0. 02 %至0. 025%的濃度提供所述正電性有機(jī)添加劑。在某些這樣的實(shí)施方案 中，所述正電性有機(jī)添加劑是依沙吖啶、聚乙烯亞胺（PEI)或氯己定。所述方法在所述正電 性有機(jī)添加劑低于0. 1%濃度的情況下實(shí)現(xiàn)有用效果的能力凸顯了所述方法的另一個(gè)意想 不到的特征：除了以升高的電導(dǎo)率并且無(wú)需堿性pH要求運(yùn)行外，所述方法可為高度有效的 而不引起顯著的沉淀量。正電性有機(jī)添加劑通常用于介導(dǎo)酸性蛋白質(zhì)、DNA和病毒等污染物 的沉淀。因此，可以以例如1%或更高的高濃度來使用它們。本發(fā)明的目的是解離聚集物， 或弱化聚集物內(nèi)部的結(jié)合，或除去使聚集物穩(wěn)定的非產(chǎn)物污染物。在許多實(shí)施方案中，本方 法的第二目的是使沉淀最小化或避免沉淀，或者使去除沉淀的需要最小或避免該需要，這 是低的正電性有機(jī)添加劑濃度和高運(yùn)行電導(dǎo)率的原因。
[0086] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可在選擇的pH下實(shí)施，以在降低樣品中聚集物的量的 同時(shí)避免或限制所需蛋白質(zhì)的沉淀。可通過常規(guī)方法調(diào)節(jié)pH水平，并且可結(jié)合電導(dǎo)率的選 擇來選擇pH水平。在某些實(shí)施方案中，所述樣品的pH為約4至約9、約5至約8、或約6至 約7. 5。這再次凸顯了使用正電性有機(jī)添加劑的該不尋常的性質(zhì)。
[0087] 在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選基本在添加所述正電性有機(jī)添加劑的同時(shí)，使所述樣品 還與抗病毒劑接觸。在某些這樣的實(shí)施方案中，所述抗病毒劑本身是正電性有機(jī)分子，例如 苯扎氯銨或亞甲藍(lán)。也可使用電中性或非離子抗病毒劑，例如三（正丁基）磷酸酯。抗病 毒劑可以低于約1% (w/v)、低于約0. 1% (w/v)或低于約0.01% (w/v)或低于約0.001 % 的量存在。在蛋白質(zhì)不耐受通過在低pH下處理來進(jìn)行病毒失活的情況下，這樣的試劑可為 特別有用的。
[0088] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使所述樣品與足以使酰脲不在所述樣品中溶解 的量的酰脲接觸的步驟。然后可使包含所述所需蛋白質(zhì)的上清從包含經(jīng)沉淀的污染物的樣 品平衡中分離。在某些這樣的實(shí)施方案中，在使所述樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接觸的 步驟之前提供所述酰脲，在另一些實(shí)施方案中，在使所述樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接 觸的步驟的基本同時(shí)提供所述酰脲，并且在另一些實(shí)施方案中，在使所述樣品與所述正電 性有機(jī)添加劑接觸的步驟之后提供所述酰脲。在某些這樣的實(shí)施方案中，所述酰脲可為任 意的以下物質(zhì)：尿酸、乙內(nèi)酰脲（咪唑啉啶-2,4-二酮）、尿囊素（2, 5-二氧-4-咪唑烷基） 脲、尿囊素氯羥鋁、尿囊素羥鋁、hemocane、脲基乙內(nèi)酰脲、5-脲基乙內(nèi)酰脲）、乙醛?；?脲、乙醛酸二酰脲、2, 5-二氧-4-咪唑烷基脲、咪唑基啶基脲和嘌呤。在某些實(shí)施方案中，所 述酰脲是尿囊素，并且在一些這樣的情況下，所述尿囊素以高于0. 56 % (w/v)、1 %、1. 5 %、 2 %或更高的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，所述酰脲是尿酸，并且在一些這樣的情況下，所 述尿酸以高于〇. 0025% (w/v)、0. 005%、0. 01%、0. 05%、0. 1%、1%或更高的濃度存在。
[0089] 在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括使所述樣品與使酰脲完全溶解的量的酰脲接 觸。在某些這樣的實(shí)施方案中，所述可溶酰脲可為尿素、咪唑基啶基脲或其他酰脲。在某 些實(shí)施方案中，所述酰脲是尿素，并且在一些這樣的情況下，所述尿素以高于0.5M，或高于 1M，或高于2M，或高于4M，或高于6M，或高于8M的濃度存在。這再次凸顯了所述方法的該出 乎意料的性質(zhì)，其中避免蛋白質(zhì)沉淀是所述方法的特定目的。諸如尿素等高度可溶的酰脲 具有使許多化合物的溶解度升高的一般效果，換言之，其的存在抵抗沉淀的形成。對(duì)本領(lǐng)域 技術(shù)人員將顯而易見的是，高度可溶的酰脲的存在可具有弱化聚集物中內(nèi)部疏水和/或氫 鍵鍵合結(jié)合的效果，并因此提高本方法實(shí)現(xiàn)解離聚集物和/或去與所需蛋白質(zhì)結(jié)合的污染 物的能力。
[0090] 在某些實(shí)施方案中，通過以下事實(shí)增強(qiáng)了本發(fā)明的效用，其還加速了細(xì)胞培養(yǎng)物 收獲物中的細(xì)胞碎肩的沉淀，并顯著降低所存在的DNA、內(nèi)毒素和病毒的水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表 明，一些酰脲傾向于與聚集物、內(nèi)毒素和病毒相互作用的能力對(duì)這些結(jié)果有貢獻(xiàn)，并且與不 存在酰脲的情況下用正電性有機(jī)添加劑相比，低水平溶解的酰脲可貢獻(xiàn)它們所支持的更高 的抗體回收率。本發(fā)明與非正電性的抗病毒劑的添加相容，后者可進(jìn)一步擴(kuò)展本發(fā)明的效 用。在處理后，可通過沉淀或過濾去除固體材料，留下上清中基本不含聚集物的蛋白質(zhì)。這 提供了本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即，經(jīng)處理的材料為光學(xué)澄清的并且沒有顆粒，而通過其他方 法處理的材料通常是渾濁并且不透明的。
[0091] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可通過使所述樣品與諸如非離子有機(jī)聚合物、有機(jī)溶 劑、表面活性劑或酰脲等可溶有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的附加步驟來實(shí)施。在某些這樣的實(shí)施方案 中，在使所述樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接觸步驟之前進(jìn)行使所述樣品與所述有機(jī)調(diào)節(jié) 劑接觸的步驟。在另一些實(shí)施方案中，在使所述樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接觸步驟的 基本同時(shí)進(jìn)行使所述樣品與所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟。在另一些實(shí)施方案中，在使所述 樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接觸步驟之后進(jìn)行使所述樣品與所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步 驟。在某些實(shí)施方案中，所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑是非離子有機(jī)聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇和 聚丁二醇，并且在某些這樣的實(shí)施方案中，所述非離子有機(jī)聚合物的平均分子量為約1000D 或更低、500D或更低、250D或更低或者100D或更低。在某些實(shí)施方案中，所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑 是有機(jī)溶劑，例如乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲基亞砜、乙醇或苯氧乙醇。在某些實(shí)施方案 中，以約1% (w/v)或更高的濃度提供所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑。在某些實(shí)施方案中，所述有機(jī)調(diào)節(jié) 劑是表面活性劑，例如吐溫、triton、CHAPS、CHAPSO或辛基葡糖苷，并且在某些這樣的實(shí)施 方案中，以約1% (w/v)或更低、約0. 1 %或更低或者約0. 02% (w/v)或更低的濃度提供所 述表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑是以亞飽和量提供的酰脲，并且在某些 這樣的實(shí)施方案中，所述酰脲是尿素、乙內(nèi)酰脲或尿囊素。這再次凸顯了本發(fā)明的該不同尋 常的性質(zhì)，其中在降低或消除顯著量的沉淀形成的條件下使用正電性有機(jī)添加劑。除了異 常低濃度的正電性有機(jī)添加劑外，高的運(yùn)行電導(dǎo)率、對(duì)堿性pH的非依賴性以及公知的尿素 增溶效果、有機(jī)溶劑和表面活性劑的存在，都具有弱化某些優(yōu)選的正電性有機(jī)添加劑與蛋 白質(zhì)污染物或其他污染物之間的疏水相互作用的效果。這尤其適用于疏水性的正電性有機(jī) 添加劑，例如依沙吖啶或其類似物，或者適用于氯己定或苯扎氯銨。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯 而易見的是，諸如所述的有機(jī)添加劑的存在可具有弱化聚集物中內(nèi)部化學(xué)結(jié)合的效果，并 因此提高本方法實(shí)現(xiàn)解離聚集物和/或去與所需蛋白質(zhì)結(jié)合的污染物的能力。
[0092] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于降低溶液中包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集 物含量的方法，其中使所述樣品與正電性有機(jī)添加劑接觸。在某些實(shí)施方案中，所述樣品的 電導(dǎo)率處于基本避免所述所需蛋白質(zhì)從所述樣品中沉淀的足夠高的水平。在某些實(shí)施方案 中，所述電導(dǎo)率高于15mS/cm，或者所述電導(dǎo)率高于30mS/cm。
[0093] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述正電性有機(jī)添加劑的濃 度低于約0.1% (w/v)。在某些實(shí)施方案中，所述正電性有機(jī)添加劑選自依沙吖啶、9-氨基 吖啶（氨吖啶）、3, 6吖啶二胺（原黃素）、吖啶瑣辛、叮啶氯（酚吖啶）、吖啶橙、喹吖因、樂 殺螨（acricide)、吖啶酮、丫啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶（1-[(6_氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨 基]-3-(二乙基氨基）-2-丙醇二鹽酸鹽）、酚藏花紅、酚噁嗪、吩噻嗪、叮啶黃（氯化3, 6-二 氨基-10-甲基吖啶和3, 6-吖啶二胺）、聚乙烯亞胺、氯己定和聚氨基酸。在某些實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述正電性有機(jī)添加劑是依沙吖啶、聚乙烯亞胺或氯己 定，或其鹽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供這樣的方法，其中所述正電性有機(jī)添加劑以約 0. 01 %至約0. 05%的量存在，或以低于約0. 01 %的量存在，或以低于約0. 005%的量存在， 或以低于約0. 001 %的量存在。
[0094] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述樣品的pH為約4至約9、 約5至約8或約6至約7. 5。
[0095] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，減少的聚集物包括所需蛋白質(zhì)的 同質(zhì)聚集物，在另一些實(shí)施方案中，減少的聚集物包括所需蛋白質(zhì)與污染物的異質(zhì)聚集物， 并且在另一些實(shí)施方案中，所述聚集物包括同質(zhì)聚集物和異質(zhì)聚集物二者。在某些實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中基本消除樣品中聚集物。在某些實(shí)施方案中，減少的 聚集物具有與所需蛋白質(zhì)基本相同的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。在某些實(shí)施方案中，減少的聚集物 是異質(zhì)聚集物，包括核酸、核苷酸、內(nèi)毒素、金屬離子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基組分。
[0096] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所需蛋白質(zhì)是抗體或抗體片 段。在某些實(shí)施方案中，所述樣品是細(xì)胞培養(yǎng)物收獲物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清、來源于細(xì)胞培養(yǎng) 物的包含抗體的溶液或來源于之前的蛋白質(zhì)純化階段的包含抗體的溶液。
[0097] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述樣品是來源于之前的蛋 白質(zhì)純化階段的包含所需蛋白質(zhì)的溶液。在某些實(shí)施方案中，所述樣品是來自色譜柱的洗 脫物。
[0098] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中還使所述樣品與抗病毒劑接觸的方法。在 某些實(shí)施方案中，所述抗病毒劑選自苯扎氯銨、亞甲藍(lán)和三（正丁基）磷酸酯。在某些實(shí)施 方案中，所述抗病毒劑以低于約1% (w/v)的量存在，或以低于約0.1% (w/v)的量存在，或 以低于約0.01% (w/v)的量存在。
[0099] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其包括以下附加步驟：使所述樣品 與足以使酰脲不在所述樣品中溶解的量的酰脲接觸，并且從所述樣品的部分分離包含所需 蛋白質(zhì)的上清。
[0100] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中在使所述樣品與所述正電性 有機(jī)添加劑接觸步驟之前進(jìn)行使所述樣品與所述酰脲接觸的步驟。
[0101] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中在使所述樣品與所述正電性 有機(jī)添加劑接觸步驟的基本同時(shí)進(jìn)行使所述樣品與所述酰脲接觸的步驟。
[0102] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中在使所述樣品與所述正電性 有機(jī)添加劑接觸步驟之后進(jìn)行使所述樣品與所述酰脲接觸的步驟。
[0103] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述酰脲選自尿素、尿酸、乙 內(nèi)酰脲、尿囊素、尿囊素氯羥鋁、尿囊素羥鋁、hemocane、脲基乙內(nèi)酰脲、5-脲基乙內(nèi)酰脲、乙 醛?；ｋ濉⒁胰┧岫ｋ?、2, 5-二氧-4-咪唑烷基脲和嘌呤。
[0104] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述酰脲是尿囊素。在某些實(shí) 施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述尿囊素以高于0.5% (w/v)的量存在。在某 些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述尿囊素以高于約1% (w/v)的量存在。
[0105] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述酰脲是尿酸。在某些實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述尿酸以高于0.0025% (w/v)的量存在。在某 些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述尿酸以高于約0.01% (w/v)的量存在。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述尿酸以高于約0.1% (w/v)的量存 在。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述尿酸以高于約1% (w/v)的量 存在。
[0106] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述方法包括使所述樣品與 選自有機(jī)聚合物、有機(jī)溶劑、表面活性劑和酰脲的有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的額外步驟。在某些實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中在使所述樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接觸步驟 之前進(jìn)行使所述樣品與所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這 樣的方法，其中在使所述樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接觸步驟的基本同時(shí)進(jìn)行使所述樣 品與所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中在使 所述樣品與所述正電性有機(jī)添加劑接觸步驟之后進(jìn)行使所述樣品與所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸 的步驟。
[0107] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自聚乙 二醇、聚丙二醇和聚丁二醇的非離子有機(jī)聚合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的 方法，其中所述非離子有機(jī)聚合物的平均分子量為約500D或更低。
[0108] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自乙二 醇、丙二醇、丁烯醇、二甲基亞砜、乙醇和苯氧乙醇的有機(jī)溶劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明 提供了這樣的方法，其中以約1% (w/v)或更高的濃度提供所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑。
[0109] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自吐溫、 triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷的表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這 樣的方法，其中以約1% (w/v)或更低的濃度提供所述表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了這樣的方法，其中以約0. 1% (w/v)或更低的濃度提供所述表面活性劑。在某些 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述有機(jī)調(diào)節(jié)劑是以亞飽和量提供的酰脲。在 某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中所述酰脲選自尿素、乙內(nèi)酰脲和尿囊素。
[0110] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了為方便地實(shí)施本文所公開的任意方法提供的試 劑盒，所述試劑盒包含正電性有機(jī)添加劑和足以使所述樣品過飽和的量的至少一種酰脲、 有機(jī)調(diào)節(jié)劑以及抗病毒劑抗病毒劑，其中以對(duì)于提供試劑盒所針對(duì)的樣品足以方便地實(shí)施 本發(fā)明的量來提供所提供的材料。
[0111] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于方便地實(shí)施本發(fā)明某些方法的試劑盒。這 樣的試劑盒可提供用于實(shí)施本發(fā)明的可用試劑，例如一種或多種多價(jià)有機(jī)陽(yáng)離子、酰脲、有 機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑，以及用于調(diào)節(jié)電導(dǎo)率的試劑。所述試劑盒可提供適于實(shí)施本發(fā)明用于 蛋白質(zhì)純化的量和濃度的材料。這樣的試劑盒可適用于某些蛋白質(zhì)，例如IgG抗體或IgM 抗體，并且可適于適合某些級(jí)別的蛋白質(zhì)制備和純化的量。材料可提供為即用的溶液形式、 適于稀釋的濃縮溶液或由使用者制備溶液來使用的固體形式，用于實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0112] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明之后可使所述樣品與固體材料接觸，目的是所述固體 具有在其他處理之前從所述樣品選擇性去除所述正電性試劑或其他樣品組分的效果。
[0113] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可與常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法組合，以達(dá)到更高的純化 水平或去除其他污染物。例如，本發(fā)明可結(jié)合包括沉淀、色譜、和液體-液體萃取法在內(nèi)的 常規(guī)純化方法來實(shí)施?？墒惯@樣的其他方法與本發(fā)明組合成它們?cè)诒景l(fā)明的方面之前、期 間或之后進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠開發(fā)適于這些方法的條件，并且使其與本文描述的發(fā) 明整合以實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行期望的純化。
[0114] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明允許在色譜純化開始前降低聚集物水平，消除后續(xù)處 理步驟的負(fù)荷?？膳c減少聚集物一起降低DNA、內(nèi)毒素和病毒水平，這進(jìn)一步減少了下游純 化步驟的負(fù)荷。在某些實(shí)施方案中，使用有機(jī)調(diào)節(jié)劑組合正電性有機(jī)添加劑防止形成大量 沉淀，并且潛在地使根據(jù)本發(fā)明處理的樣品可以直接應(yīng)用于色譜柱，而無(wú)需中間處理步驟 來除去固體。這樣的實(shí)施方案還可與添加非正電性有機(jī)添加劑抗病毒試劑相容。
[0115] 在某些實(shí)施方案中，運(yùn)行條件可相對(duì)于pH和/或由存在的螯合劑、有機(jī)聚合物或 溶劑、表面活性劑、離液劑以及多種鹽而變化，以調(diào)節(jié)聚集物減少到的程度并且所需蛋白質(zhì) 保持于溶液中。
[0116] 本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將部分地記載于下面的描述中，以及部分地通過該描述 而顯而易見，或者可通過實(shí)施本發(fā)明來知曉。通過權(quán)利要求中規(guī)定的元素和組合將使本發(fā) 明的目的和優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)知和得到。
[0117] 應(yīng)理解，前述的一般描述和下面的詳細(xì)描述二者都僅是示范性的和解釋性的，并 且不限制要求保護(hù)的本發(fā)明。
[0118] 發(fā)明詳述
[0119] 定義
[0120] 定義術(shù)語(yǔ)以更容易地理解本發(fā)明。另一些定義記載于詳細(xì)描述中。
[0121] "聚集物"是指在生理學(xué)條件下穩(wěn)定的并且可在寬pH范圍和電導(dǎo)率條件下穩(wěn)定的 兩個(gè)或更多個(gè)分子的結(jié)合物。聚集物常常包含至少一種生物分子，例如蛋白質(zhì)、核酸或脂 質(zhì)，以及另一種分子或金屬離子。所述結(jié)合通過任意類型的化學(xué)相互作用或化學(xué)作用的任 意組合來發(fā)生?？贵w聚集物可分為兩大類："同質(zhì)聚集物"是指兩個(gè)或更多個(gè)抗體分子的穩(wěn) 定結(jié)合；"異質(zhì)聚集物"是指一種或多種抗體分子與一種或多種非抗體分子的穩(wěn)定結(jié)合。非 抗體組分可由選自核酸、內(nèi)毒素、金屬離子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基組分的一種或多種 實(shí)體組成。
[0122] "抗體"是指免疫球蛋白、復(fù)合物或其片段化形式。該術(shù)語(yǔ)可包括但不限于衍生自 人其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM類型的多克隆抗體或單克隆抗體，包括 天然形式或遺傳改造形式，例如人源化、人、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變、移植以及體 外生成的抗體。"抗體"還可包括復(fù)合物形式，包括但不限于包含免疫球蛋白部分的融合蛋 白。"抗體"還可包括抗體片段，例如Fab、F(ab'）2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc以及其他組合物， 無(wú)論其是否保留抗原結(jié)合功能。
[0123] "內(nèi)毒素"是指在裂解后從細(xì)胞釋放的存在于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的有毒的熱 穩(wěn)定的脂多糖物質(zhì)。
[0124] "非離子有機(jī)聚合物"是指天然存在的或合成的包含連接重復(fù)有機(jī)亞單位的烴，其 不含帶電基團(tuán)。其可為直鏈的、主要直鏈帶有一些分枝的或主要分枝的。適于實(shí)施本發(fā)明 的實(shí)例包括但不限于聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。PEG具有結(jié)構(gòu)式 H〇-(CH2-CH2-〇)n-H。實(shí)例包括但不限于平均聚合物分子量范圍低于100道爾頓至高于1000 道爾頓的組合物。
[0125] "正電性有機(jī)添加劑"是指攜帶至少一個(gè)正電荷并且可包含多個(gè)正電荷的有機(jī)分 子、陽(yáng)離子或者天然的鹽或合成來源的鹽。所述正電性有機(jī)添加劑還可攜帶負(fù)電荷，但是在 這種情況下，在使用其的工作條件下，其仍然保持凈正電荷。在所述正電性有機(jī)添加劑為凈 正電的情況下，其可與抗衡離子（陰離子）一起提供，例如氯離子、溴離子、硫酸根、有機(jī)酸、 乳酸根、葡糖酸根或不與所述方法相抵觸的任何其他陰離子。在某些實(shí)施方案中，由胺、亞 胺或其他氮部分提供正電性有機(jī)添加劑的某些正電荷。正電性有機(jī)添加劑還可包括疏水殘 基、金屬親和殘基、氫鍵鍵合殘基、其他官能部分，和/或其可具有參與其他類型的化學(xué)相 互作用的能力。在某些實(shí)施方案中，正電性有機(jī)添加劑的實(shí)例包括但不限于二氨基酸、二 肽、三肽或更大的均聚或異聚肽，例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚鳥氨酸；聚乙烯亞 胺；聚烯丙胺；聚芐菊酯（polydimethrine)、聚甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氨；聚二烯丙基 二甲基氨；聚乙烯基芐基三甲基氨；聚乙烯基胍；聚（N-乙基-4-乙烯基吡啶）；DEAE-葡聚 糖；DEAE-纖維素；依沙吖啶（CAS號(hào)442-16-0 ;7_乙氧基吖啶-3, 9-二胺）；三（2-氨基 乙基）胺；胍；氯己定；阿來西定；citricidal、魚精蛋白；精胺；亞精胺；鞋精蛋白、殼聚糖； 以及前述物質(zhì)的變體和衍生物。例如，依沙吖啶的變體和衍生物被理解為包括9-氨基吖啶 (氨吖啶）、3, 6吖啶二胺（原黃素）、吖啶瑣辛、叮啶氯（酚吖啶）、吖啶橙、奎吖因、樂殺螨、 吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶（1_[ (6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨基]-3-(二乙基 氨基）-2-丙醇二鹽酸鹽）、酚藏花紅、吩噁嗪、吩噻嗪、B丫啶黃（氯化3, 6-二氨基-10-甲基 吖啶和3, 6-吖啶二胺），以及其鹽（例如，氯化物、溴化物、硫酸鹽、乳酸鹽、葡糖酸鹽）。
[0126] "有機(jī)溶劑"是指天然存在的或合成的以液體狀態(tài)存在的有機(jī)化合物。適于實(shí)施本 發(fā)明的實(shí)例包括但不限于乙二醇、丙二醇、二甲亞砜、乙醇和苯氧乙醇。
[0127] "有機(jī)聚合物"是指有機(jī)單體的天然存在的或合成的聚合物。實(shí)例包括但不限于聚 乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖或纖維素等。
[0128] "多核苷酸"是指由鏈中共價(jià)結(jié)合的多個(gè)核苷酸單體組成的聚合物。DNA(脫氧核 糖核酸）和RNA(核糖核酸）是多核苷酸的實(shí)例。
[0129] "蛋白質(zhì)"是指包含碳、氫、氧、氮以及常常包含硫并且主要包含通過肽鍵連接的一 條或多條氨基酸鏈的復(fù)合有機(jī)大分子群的任意一種，。蛋白質(zhì)可為天然來源的或重組來源 的。蛋白質(zhì)可由非氨基酸部分修飾，例如通過糖基化、聚乙二醇化或與另一些化學(xué)部分綴 合。蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于抗體、凝血因子、酶和肽類激素。
[0130] "未溶解的酰脲"是指在特定蛋白質(zhì)制備中常用的條件下包含超過酰脲最大溶解 度的量的酰脲的溶液。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明以高于酰脲在樣品中的溶解度的量提供 具有酰脲的樣品，使這樣的樣品處于這樣的酰脲中的一部分在樣品中以未溶解的形式存在 的條件下。
[0131] "表面活性劑"包括"表面活性的試劑"，例如一類一般體現(xiàn)疏水部分和親水部分 的有機(jī)分子，這使其被稱為兩性分子。在水溶液中足夠濃度下，表面活性劑可自結(jié)合成簇， 其中疏水部分濃縮于中央從而最小程度地與水的接觸，并且親水部分向外輻射從而最大 化程度地與水接觸。在存在生物學(xué)制劑尤其是包含具有疏水性質(zhì)或具有疏水性面積的材 料的生物學(xué)制劑的情況下，表面活性劑的疏水部分傾向于自發(fā)地與疏水材料的一部分結(jié) 合，并通過表面活性劑親水部分的影響來提高所述制劑的溶解度。它們還可用于調(diào)節(jié)溶 解于水性溶劑中的兩種不同疏水材料之間的發(fā)生的疏水相互作用。適于實(shí)施本發(fā)明某些 實(shí)施方案的表面活性劑實(shí)例包括但不限于，非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯表面活性 劑（例如，吐溫20,聚氧乙烯（20)山梨醇酐單月桂酸酯以及吐溫80,聚氧乙烯（20)山梨 醇酐單油酸酯）和Triton(例如，聚乙二醇對(duì)（1，1，3, 3-四甲基丁基）-苯基醚）；以及兩 性離子表面活性劑，例如CHAPS(3-[(3-膽酰氨基丙基）二甲基胺基]-1-丙烷磺酸鹽）， CHAPS0 (3-[ (3-膽酰氨基丙基）二甲基胺基]_2_輕基-1-丙燒橫酸鹽），以及辛基葡糖苷 (例如，（2R，3S，4S，5R，6R) -2-(羥甲基）-6-辛氧基環(huán)氧乙烷-3, 4, 5-三醇）。
[0132] "病毒"或"病毒體"是指僅在主要為細(xì)菌、植物和動(dòng)物的活宿主的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的超 顯微（直徑約20nm至300nm)的代謝惰性的傳染劑，其包含RNA或DNA核心、蛋白質(zhì)外殼， 以及（在更復(fù)雜的類型中）周圍的包膜。
[0133] 在根據(jù)某些實(shí)施方案準(zhǔn)備使用本發(fā)明的情況下，將必須選擇正電性有機(jī)添加劑。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)揭示，作為一般物質(zhì)，正電性有機(jī)添加劑的疏水性越低，則目的蛋白質(zhì)的回收率越 高。此外，疏水性越低，則可施用正電性有機(jī)添加劑以達(dá)到有效的聚集物減少而不顯著損失 蛋白質(zhì)的濃度范圍越寬并且越高。因此，弱疏水的PEI可視為比更疏水的依沙吖啶或疏水 性高得多的氯己定更好的候選物。然后，還必須將比產(chǎn)品回收率更重要的其他問題納入考 慮。PEI體現(xiàn)出公知的細(xì)胞毒性，并且難以以足夠的靈敏度來檢測(cè)它，以容易地驗(yàn)證其從通 過純化方法路線的蛋白質(zhì)制劑中去除?？蓛?yōu)選依沙吖啶，因?yàn)槠湓谘獫{蛋白質(zhì)分級(jí)領(lǐng)域中 以及作為抗病毒劑具有悠久的歷史。此外，其亮黃色和固有熒光有助于在給定樣品中靈敏 地測(cè)量其含量，從而幫助證明在實(shí)施本方法后除去了依沙吖啶。不同的正電性有機(jī)添加劑 可體現(xiàn)不同的二級(jí)化學(xué)官能性，使其具有介導(dǎo)期望作用的能力。例如，PEI被視為主要通過 靜電相互作用和氫鍵來結(jié)合DNA。依沙吖啶為這兩種相互作用提供較少的機(jī)會(huì)，但是已知其 插入DNA。這樣的差異可在一種正電性有機(jī)添加劑的相對(duì)適用性與另一種的相對(duì)適用性之 間催生微小但是有用的差異，其凸顯的點(diǎn)在于，評(píng)價(jià)可能表面上看起來非理想的候選物可 具有實(shí)際益處。
[0134] 在評(píng)價(jià)正電性有機(jī)添加劑用于某些實(shí)施方案的使用的過程中，用于施用所述正電 性有機(jī)添加劑的條件可按照以下來研宄。正電性有機(jī)添加劑的使用對(duì)可用于實(shí)施某些實(shí)施 方案中的方法的條件施加了一些限制。例如，可期望采用基本防止正電性有機(jī)添加劑與目 的蛋白質(zhì)之間強(qiáng)相互作用的條件。一種得到該條件的近似條件的簡(jiǎn)單方法是將目的蛋白質(zhì) 施用至陰離子交換劑，并在鹽梯度中進(jìn)行洗脫。剛剛高于所述蛋白質(zhì)主要洗脫所處的閾值 的鹽濃度鑒定為可最有效實(shí)施所述方法的最小電導(dǎo)率。該濃度將受到pH的影響，這可通過 相同的方法來建模。如果該方法應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)物上清，對(duì)于IgG抗體可不需要添加鹽或 改變pH以避免顯著的損失。對(duì)于IgM抗體可需要添加鹽，甚至添加至是電導(dǎo)率接近30mS/ cm(約為生理學(xué)電導(dǎo)率的2倍）。在某些涉及使用未溶解的酰脲和正電性有機(jī)添加劑的實(shí) 施方案中，可在低于生理學(xué)電導(dǎo)率的條件下進(jìn)行IgG的應(yīng)用，潛在地包括lmS/cm或更低的 值，在這種情況下，可結(jié)合解離聚集物來去除大量宿主蛋白質(zhì)。這樣的使用可要求正電性有 機(jī)添加劑的濃度提高至彌補(bǔ)通過結(jié)合至宿主蛋白質(zhì)而損失的量。在這樣的環(huán)境下，更低的 運(yùn)行電導(dǎo)率還可提高對(duì)DNA、內(nèi)毒素和病毒的去除。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明將一般支持 高于95 %，并且常常為98 %至99 %的抗體回收率。通常應(yīng)在添加酰脲或正電性有機(jī)添加劑 之前建立樣品的電導(dǎo)率和pH條件。
[0135] 在某些實(shí)施方案中，與由離子相互作用介導(dǎo)的大多數(shù)過程相反，建議對(duì)實(shí)施本發(fā) 明的條件評(píng)價(jià)具體包括并且潛在地傾向于基本高于實(shí)際最小值的電導(dǎo)率值。顯著低于生理 學(xué)電導(dǎo)率的條件，特別是當(dāng)施用于諸如細(xì)胞培養(yǎng)物上清等粗制品，可促使正電性有機(jī)添加 劑與酸性蛋白質(zhì)的強(qiáng)相互作用，這潛在地產(chǎn)生至少兩種不期望的結(jié)果，一種是這樣的條件 可促使沉淀形成。另一種是，正電性有機(jī)添加劑的子群體被酸性蛋白質(zhì)和/或沉淀螯合將 降低剩余的正電性有機(jī)添加劑的有效濃度，具有限制本發(fā)明降低聚集物含量的潛在效果。 作為一個(gè)一般問題，高至3倍生理學(xué)值的電導(dǎo)率值將支持有效聚集物的減少，并且抗體回 收率高于90%。
[0136] 在某些實(shí)施方案中，并且與針對(duì)由離子相互作用（尤其是生物分子和正電性有機(jī) 添加劑之間的離子相互作用）介導(dǎo)的大多數(shù)過程的建議相反，可降低pH，甚至降至低至4或 更低的值。這樣的極限條件幾乎是不必需的，并且可能比中性pH值要求更高的電導(dǎo)率以維 持的蛋白質(zhì)溶解度。
[0137] 在某些實(shí)施方案中，一種評(píng)價(jià)用于經(jīng)澄清的包含IgG單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上 清的條件的有效方法是覆蓋〇. 005 %至0. 05%正電性有機(jī)添加劑的范圍，以及從生理學(xué)值 至2倍生理學(xué)值范圍的電導(dǎo)率。所述范圍還可按需要進(jìn)一步擴(kuò)展或縮窄。在這些范圍內(nèi) 觀察到沉淀的情況下，經(jīng)?？赏ㄟ^將電導(dǎo)率提高至高至3倍生理學(xué)值而不降低聚集物的減 少。這對(duì)應(yīng)于約45mS/cm。更高的電導(dǎo)率也可起作用。在添加正電性有機(jī)添加劑之前調(diào)節(jié) 樣品的電導(dǎo)率一般將是有利的。
[0138] 在某些實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明開發(fā)針對(duì)經(jīng)澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物上清的純化方 法的適當(dāng)起點(diǎn)是使用〇. 02%依沙吖啶。未澄清的包含細(xì)胞的收獲物將很可能受益于使用更 高濃度，因?yàn)榧?xì)胞可結(jié)合至足夠的正電性有機(jī)添加劑，從而降低可用于異質(zhì)聚集物解離的 量。在應(yīng)用于包含細(xì)胞的制劑的情況下，本發(fā)明的第二益處是其大幅加快了細(xì)胞和碎肩的 沉淀，利于它們的去除。在本發(fā)明應(yīng)用于包含細(xì)胞的制劑的情況下，可建議維持近生理學(xué)條 件以避免過量的細(xì)胞死亡率和/或細(xì)胞內(nèi)容物釋放至制劑中。
[0139] 在某些實(shí)施方案中，通過在添加正電性有機(jī)添加劑之前將有機(jī)調(diào)節(jié)劑分散于細(xì)胞 制劑中來起始可為有利的，因?yàn)樵搶?shí)踐可改善抗體回收率。在添加正電性有機(jī)添加劑之前 進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間孵育使不必要的；15分鐘或更短即足夠，盡管長(zhǎng)時(shí)間孵育未表現(xiàn)出缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)一般顯示，當(dāng)在正電性有機(jī)添加劑之前以約1%過度飽和的量添加尿囊素提高IgG的 回收率。
[0140] 在某些實(shí)施方案中，建議在將正電性有機(jī)添加劑添加于樣品前，將所述正電性有 機(jī)添加劑陽(yáng)離子溶解于例如水或緩沖液中，以利于其快速遍布于蛋白質(zhì)制劑中。應(yīng)警惕 避免持續(xù)的局部過量，例如通過將溶解的正電性有機(jī)添加劑逐漸灌注至充分混合的混懸劑 中。孵育時(shí)間應(yīng)至少為15分鐘，優(yōu)選30分鐘，但長(zhǎng)于60分鐘的時(shí)間未表現(xiàn)出顯著的益處。
[0141] 所述方法一般可在環(huán)境溫度下實(shí)施，但是還可在更高或更低的溫度下進(jìn)行，例如 4°C至37°C。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，溫度基本不改變所得結(jié)果，這將使蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性要求成為選 擇運(yùn)行溫度的決定因素。
[0142] 在某些實(shí)施方案中，將正電性有機(jī)添加劑溶解或分散于例如水或緩沖液中，并且 在將其添加至樣品前調(diào)解pH。這是因?yàn)?，某些正電性有機(jī)添加劑，尤其包括陽(yáng)離子組合物， 是極度堿性的，并且具有以未預(yù)料到的方式大幅改變實(shí)驗(yàn)條件的可能性。
[0143] 在某些涉及使用超飽和酰脲和正電性有機(jī)添加劑二者的實(shí)施方案中，一般可有利 的是，通過在添加正電性有機(jī)添加劑之前將所述酰脲分散于細(xì)胞制劑中來起始可為有利 的，因?yàn)槭褂悯ｋ迥蚰宜氐慕?jīng)驗(yàn)顯示該實(shí)施可改進(jìn)抗體回收率。在添加正電性有機(jī)添加劑 之前進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間孵育是不必要的；15分鐘或更短即足夠，盡管長(zhǎng)時(shí)間孵育未表現(xiàn)出缺點(diǎn)。
[0144] 在某些實(shí)施方案中，期望選擇有機(jī)調(diào)節(jié)劑和正電性有機(jī)添加劑以開始確定哪種組 合或運(yùn)行條件將最適于具體的應(yīng)用的方法?？赏ㄟ^以下知識(shí)來輔助所述選擇：所述正電 性有機(jī)添加劑的特性至少部分的確定最適有機(jī)調(diào)節(jié)劑，或有機(jī)調(diào)節(jié)劑的工作濃度，和/或 反之亦然。在一般情況中，針對(duì)某些實(shí)施方案，正電性有機(jī)添加劑越疏水，則對(duì)具有強(qiáng)的弱 化疏水相互作用的能力的有機(jī)調(diào)節(jié)劑的要求越高，或者以更高的濃度使用較低疏水的調(diào)節(jié) 劑。這過于簡(jiǎn)單化，因?yàn)檎{(diào)節(jié)還涉及氫鍵，并且可預(yù)期到不同的正電性有機(jī)添加劑和不同的 有機(jī)調(diào)節(jié)劑具備疏水相互作用和氫鍵鍵合能力的不同平衡，但是這僅是舉例說明該設(shè)想。 因此，在一些例子中，弱疏水的PEI可為優(yōu)選的，因?yàn)槠涫褂米钚舛鹊臏睾陀袡C(jī)調(diào)節(jié)劑得 到良好的結(jié)果，但是由于其已知的細(xì)胞毒性以及難以以足夠的靈敏度檢測(cè)PEI來容易地驗(yàn) 證通過純化方法的過程從蛋白質(zhì)制劑中去除，所以PEI較低優(yōu)選。在一些例子中，強(qiáng)疏水性 的依沙吖啶可為較低優(yōu)選，因?yàn)槠鋬A向于使與其相互作用的材料沉淀，但是，依沙吖啶可為 優(yōu)選，因?yàn)槠湓谘獫{蛋白質(zhì)分級(jí)領(lǐng)域中以及作為抗病毒劑的悠久歷史。此外，其亮黃色和固 有熒光有助于在指定樣品中靈敏地測(cè)量其含量，從而幫助證明在實(shí)施本方法后除去了依沙 吖啶?？赏ㄟ^適當(dāng)濃度的合適有機(jī)調(diào)劑來彌補(bǔ)依沙吖啶的結(jié)合/沉淀傾向。氯己定的更高 疏水性將還需要更高程度的調(diào)節(jié)，但是該選擇可因其在280nm處的強(qiáng)UV吸收而不被鼓勵(lì)。
[0145] 存在多種選擇用于監(jiān)測(cè)通過所述方法實(shí)現(xiàn)的聚集物的解離或去除，無(wú)論是在研發(fā) 方法時(shí)還是在生產(chǎn)中。最簡(jiǎn)單的是在具有合適選擇性的柱子上進(jìn)行分析性體積排除色譜， 并在280nmUV波長(zhǎng)處進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這可揭示HMW(高分子量）聚集物，因?yàn)樗鼈兂３＞邆溥m度 符合非聚集產(chǎn)物的多種尺寸的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。異質(zhì)聚集物通常被該方法所忽視，因?yàn)樗?們的流體動(dòng)力學(xué)尺寸可僅比非聚集產(chǎn)物的流體動(dòng)力學(xué)尺寸高一點(diǎn)點(diǎn)。在這種情況下，可通 過計(jì)算254nm處的UV吸收度與280nm處的吸收度的比率來揭示聚集物的異質(zhì)組合物，然后 將該值與被視為完全不含結(jié)合的污染物的經(jīng)純化的蛋白質(zhì)的吸收度比率進(jìn)行比較。將通過 升高的254/280比率來揭示包含例如DNA等的異質(zhì)聚集物。如果色譜提供相應(yīng)能力的話， 可同時(shí)在365nm處監(jiān)測(cè)依沙吖啶含量。這可有助于證明通過后續(xù)的純化方法來去除依沙吖 啶。還可使用多波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)與其他色譜方法相結(jié)合。
[0146] 在某些實(shí)施方案中，可使本發(fā)明與在后續(xù)純化之前去除樣品中的正電性有機(jī)添加 劑和可能的其他組分的處理整合。這樣的處理可包括使樣品暴露于攜帶性質(zhì)與正電性有機(jī) 添加劑的性質(zhì)互補(bǔ)的化學(xué)部分的固體，以期它們使正電性有機(jī)添加劑從樣品剩余物除去。
[0147] 在某些實(shí)施方案中，可使本發(fā)明與一種或多種純化方法整合，所述純化方法包括 蛋白A和其他形式的生物學(xué)親和色譜、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色 譜、固定化的金屬親和色譜、羥磷灰石或其他混合模式的色譜，和/或非色譜法，例如沉淀 和液體-液體萃取。處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的視界范圍內(nèi)的是，開發(fā)適于所述多種方法的條 件，并且使其與本發(fā)明整合以達(dá)到特定抗體的必需純化。
[0148] 在某些實(shí)施方案中，必須選擇至少一種酰脲用于評(píng)價(jià)其在實(shí)施本發(fā)明中的用途。 尿酸是幾乎不溶的，其優(yōu)點(diǎn)是在去除未溶解的尿酸后，經(jīng)處理的蛋白質(zhì)制劑中幾乎不存在 尿酸，但是溶解的尿囊素表現(xiàn)出調(diào)節(jié)正電性有機(jī)添加劑的效果，并且通常支持更高的抗體 回收率。對(duì)于正電性有機(jī)添加劑的選擇，依沙吖啶提供了幾個(gè)引人注意的特征，特別是其在 血漿蛋白分級(jí)領(lǐng)域以及作為抗病毒劑的悠久歷史。其還插入DNA，并強(qiáng)結(jié)合至內(nèi)毒素。此外， 其亮黃色和固有熒光有助于在指定樣品中靈敏地測(cè)量其含量，從而幫助證明在實(shí)施本方法 后除去了依沙吖啶。
[0149] 在某些實(shí)施方案中，酰脲和正電性有機(jī)添加劑的期望濃度將受到其所用于處理的 蛋白制劑的組成的影響。對(duì)于澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物上清，便利的起始點(diǎn)是1%尿素和0. 02% 依沙吖啶。這兩者皆可實(shí)驗(yàn)性地改變，以微調(diào)提供期望結(jié)果的量。本發(fā)明在包含細(xì)胞的細(xì) 胞培養(yǎng)物收獲物中的應(yīng)用將很可能需要更大量的酰脲和正電性有機(jī)添加劑二者。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 特別指示，在某些實(shí)施方案中，可需要更高量的尿囊素以達(dá)到過飽和，并且可需要更高量的 依沙吖啶以彌補(bǔ)細(xì)胞表面上損失的量。實(shí)驗(yàn)可有助于鑒定該二者的適當(dāng)?shù)挠行Я?。在某?實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了有價(jià)值的益處，通過解離聚集物而非除去聚集物來提高抗體的 回收率，在非常高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物產(chǎn)生大比例的聚集抗體的情況下尤其有益。這進(jìn)而使 得能夠從極度高產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化蛋白質(zhì)，其結(jié)果大幅改善了產(chǎn)量以及生產(chǎn)/純化方 法的總體經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的另一個(gè)益處是，其大幅加速了細(xì)胞核碎肩的沉淀，有利于它們 的去除。
[0150] 來自差示掃描量熱的數(shù)據(jù)指示，35mM(近飽和的）尿囊素對(duì)IgG具有降低IgG熱轉(zhuǎn) 變溫度的效果，其量為用35mM尿素降低熱轉(zhuǎn)變溫度的量的約一半。這指示，具有尿囊素的 蛋白質(zhì)變性的風(fēng)險(xiǎn)是零。還指示，與僅用正電性有機(jī)添加劑實(shí)現(xiàn)的那些病毒失活水平相比， 尿囊素與正電性有機(jī)添加劑的組合可提高病毒失活水平，其中除了由未溶解的酰脲結(jié)合病 毒之外，還表現(xiàn)出發(fā)生這樣的病毒失活。 實(shí)施例
[0151] 實(shí)施例1.用于減少HMW聚集物和解離異質(zhì)聚集物的正電性有機(jī)添加劑的比較。通 過在200mM精氨酸、10mMEDTA、50mMMES、pH6. 5的緩沖液中進(jìn)行體積排除色譜來分析包 含單克隆IgM的澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物上清。所述材料包含11%HMW聚集物，并且IgM峰值表 現(xiàn)出0. 506的254/280比率，這指示存在大量異質(zhì)聚集物。通過添加氯化鈉將上清的電導(dǎo) 率提高至 20mS/cm。用 0? 01%、0. 05%和 0? 1% 的PEI-1200 ;0? 01%、0. 05%和 0? 1% 的依 沙吖啶；以及〇. 01 %、〇. 05%和0. 1 %的氯己定處理9個(gè)樣品，孵育30分鐘，然后通過SEC 分析（結(jié)果如下）。在分析前沉淀〇. 1%氯己定樣品。將所述樣品孵育30分鐘，然后通過 SEC分析。僅依沙吖啶消除HMW聚集物。其還支持有效的異質(zhì)聚集物解離。PEI在所有濃 度下都提供高于97%的回收率，并且異質(zhì)聚集物解離良好，但是異質(zhì)聚集物的減少不良。氯 己定大致在依沙吖啶與PEI之間。
[0152]

【權(quán)利要求】
1. 降低包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集物含量的方法，所述方法包括使所述樣品與正電 性有機(jī)添加劑和未溶解的酰脲接觸。
2. 用于在15mS/cm或更高的電導(dǎo)率值下降低包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集物含量的 方法，所述方法包括以〇. 1 %或更低濃度添加正電性有機(jī)添加劑。
3. 降低包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集物含量的方法，所述樣品具有5mS/cm或更高的 電導(dǎo)率值，所述方法包括在一種或多種有機(jī)添加劑的存在下以0. 1%或更低的濃度添加正 電性有機(jī)添加劑，以減少沉淀形成，其中所述一種或多種有機(jī)添加劑選自酰脲、有機(jī)溶劑或 表面活性劑。
4. 降低包含所需蛋白質(zhì)的樣品的聚集物含量的方法，所述方法包括提供包含聚集物的 樣品，以及使所述樣品與正電性有機(jī)添加劑接觸，其中所述所需蛋白質(zhì)溶解于所述樣品中。
5. 如權(quán)利要求1和3所述的方法，其中所述酰脲是尿囊素。
6. 如權(quán)利要求1、3或5所述的方法，其中所述酰脲以約0. 5 %重量/體積至約2 %重量 /體積的范圍存在。
7. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述正電性有機(jī)添加劑包含選自依沙 吖啶、氯己定、聚乙烯亞胺、亞甲藍(lán)和苯扎氯銨中的一種
8. 如權(quán)利要求1、5或6中任一項(xiàng)所述的方法，其中在添加所述正電性有機(jī)添加劑之前 添加所述酰脲。
9. 如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加鹽至基本防止所需蛋白質(zhì)形成沉 淀的水平。
10. 如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需蛋白質(zhì)包含選自抗體、因子 VIII、生長(zhǎng)激素和重組蛋白質(zhì)中的一種。
11. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加所述正電性有機(jī)添加劑至1% 重量/體積或更低重量/體積的水平。
12. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加所述正電性有機(jī)添加劑至 0. 1 %重量/體積或更低重量/體積的水平。
13. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加所述正電性有機(jī)添加劑至 〇. 01 %重量/體積或更低重量/體積的水平。
14. 如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加所述正電性有機(jī)添加劑至 0. 001 %重量/體積或更低重量/體積的水平。
15. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述正電性有機(jī)添加劑以0. 02%至 0.03%的濃度范圍存在。
16. 如權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中存在多種正電性有機(jī)添加劑。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃度是1%重量 /體積或更低重量/體積。
18. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃度是 0. 1 %重量/體積或更低重量/體積。
19. 如權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃 度是0. 01 %重量/體積或更低重量/體積。
20. 如權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多種正電性有機(jī)添加劑的總濃 度是0. 001%重量/體積或更低重量/體積。
21. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述未溶解的酰脲是尿囊素。
22. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中尿囊素以約0. 56%重量/體積至約 1 %重量/體積的濃度范圍存在。
23. 如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中尿囊素以約1 %重量/體積至約2% 重量/體積的濃度范圍存在。
24. 如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中尿囊素以約2 %重量/體積至約5% 重量/體積的濃度范圍存在。
25. 如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中尿囊素以約5 %重量/體積至約10% 重量/體積的濃度范圍存在。
26. 如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中尿囊素以約10 %重量/體積至約 15%重量/體積的濃度范圍存在。
27. 如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中在添加所述正電性有機(jī)添加劑之前 向所述樣品中添加酰脲。
28. 如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至足夠高 的水平以抵消所述所需蛋白質(zhì)因沉淀而造成的大量損失。
29. 如權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至比抵消 所述所需蛋白質(zhì)的大量損失所需水平更高的水平。
30. 如權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)為高至生 理學(xué)電導(dǎo)率的兩倍。
31. 如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述樣品的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)為高至生 理學(xué)電導(dǎo)率的三倍或更高。
32. 如權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中降低所述樣品的電導(dǎo)率，但保持足夠 高以抵消所述所需蛋白質(zhì)的大量損失。
33. 如權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中在添加所述正電性有機(jī)添加劑之前 調(diào)節(jié)所述樣品的電導(dǎo)率。
34. 如權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中存在有機(jī)溶劑。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括選自乙醇、異丙醇、乙二醇、丙 二醇、三（正丁基）磷酸酯和甘油中的一種。
36. 如權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括約0. 01 %重量/體積至 約20 %重量/體積范圍的濃度。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括約0. 01 %至約1 %濃度范圍的 乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇、異丙醇或三（正丁基）磷酸酯。
38. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括約1%至約5%濃度范圍的乙二 醇、丙二醇、甘油、乙醇或異丙醇。
39. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括約5%至約10%濃度范圍的乙 二醇、丙二醇、甘油、乙醇或異丙醇。
40. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括約10%至約20%濃度的乙二 醇、丙二醇或甘油。
41. 如權(quán)利要求1至40中任一項(xiàng)所述的方法，其中存在有機(jī)溶劑，并且其包含選自乙 醇、異丙醇和三（正丁基）磷酸酯中的一種。
42. 如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑濃度低于1 %。
43. 如權(quán)利要求41或42所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑濃度低于0. 1 %。
44. 如權(quán)利要求41至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑濃度低于0. 01 %。
45. 如權(quán)利要求1至44中任一項(xiàng)所述的方法，其中存在可溶酰脲。
46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述可溶酰脲是尿素。
47. 如權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述可溶酰脲以約0. 5M至約1M的濃度范圍 存在。
48. 如權(quán)利要求45至47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可溶酰脲以約1M至約2M的濃 度范圍存在。
49. 如權(quán)利要求45至48中任一項(xiàng)所述方法，其中所述可溶酰脲以約2M至約4M的濃度 范圍存在。
50. 如權(quán)利要求45至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可溶酰脲以約4M至約8M的濃 度范圍存在。
51. 如權(quán)利要求1至50中任一項(xiàng)所述的方法，其中存在表面活性劑。
52. 如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述表面活性劑包括非離子表面活性劑。
53. 如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述表面活性劑包括選自吐溫和Triton中的一 種。
54. 如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述表面活性劑包括兩性離子表面活性劑。
55. 如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述兩性離子表面活性劑包括選自CHAPS、CHAPSO 和十八烷基葡糖苷中的一種。
56. 如權(quán)利要求51至55中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑以低于1 %的非零 濃度存在。
57. 如權(quán)利要求51至56中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑以低于0. 1 %的非 零濃度存在。
58. 如權(quán)利要求51至57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑以低于0. 01 %的 非零濃度存在。
59. 如權(quán)利要求1至58中任一項(xiàng)所述的方法，其中存在螯合劑。
60. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述螯合劑帶正電。
61. 如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述帶正電的螯合劑包括三（2-氨基乙基）胺或 去鐵胺。
62. 如權(quán)利要求59至61中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述螯合劑以低于lOOmM的非零濃 度存在。
63. 如權(quán)利要求59至62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述螯合劑以低于50mM的非零濃 度存在。
64. 如權(quán)利要求59至63中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述螯合劑以低于20mM的非零濃 度存在。
65. 如權(quán)利要求59至64中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述螯合劑以低于10mM的非零濃 度存在。
66. 如權(quán)利要求59至65中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述螯合劑以低于5mM的非零濃度 存在。
67. 如權(quán)利要求1至66中任一項(xiàng)所述的方法，其中存在以下物質(zhì)中的多種：(a)有機(jī)溶 劑，（b)有機(jī)聚合物，（c)可溶酰脲，（d)表面活性劑，（e)螯合劑和（f)鹽。
68. 如權(quán)利要求1至67中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述被接觸的樣品暴露于一種或多 種固體，以在隨后的使所述所需蛋白質(zhì)與殘余的污染物分離的處理步驟之前除去至少一種 正電性有機(jī)添加劑。
69. 用于實(shí)施權(quán)利要求1至68中任一項(xiàng)所述方法的試劑盒。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK104507953SQ201380040495
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】彼得·加尼翁 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局