一種高效制備重組人mica蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于在畢赤酵母中高效表達(dá)重組人MICA蛋白的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒從5’至3’依次包括以下元件：(1)控制基因轉(zhuǎn)錄的畢赤酵母啟動子；(2)控制所述重組人MICA在畢赤酵母中分泌表達(dá)的信號肽序列；(3)所述重組人MICA的編碼序列；和(4)轉(zhuǎn)錄終止子；其中所述信號肽序列為α-factor的Pre序列，其核酸序列如SEQ?ID?No:9所示。本發(fā)明還提供甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并純化人MICA蛋白的方法以及組成型表達(dá)并純化人MICA蛋白的方法。
【專利說明】—種高效制備重組人MICA蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及畢赤酵母生產(chǎn)重組人MICA蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MICA是mic基因家族的一個成員，位于6號染色體距離HLA-B基因座著絲粒端約46.5kb處，屬于非經(jīng)典的HLA-1類基因。正常生理條件下，其編碼的蛋白存在于細(xì)胞表面，且被高度N-糖基化修飾。區(qū)別于經(jīng)典的MHC I類分子，MICA不與beta-2-微球蛋白結(jié)合形成異二聚體。作為NKG2D的受體，MICA被認(rèn)為直接參與了 NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷腫瘤功能。此外，Bauer等證實MICA作為NKG2D的配體在器官移植所引起的免疫反應(yīng)方面也發(fā)揮著重要的作用(Bauer, S.，V.Groh等(1999)."Activation of NK cells and T cells by NKG2D, areceptor for stress-1nducible MICA."Science285(5428):727-729)。
[0003]本發(fā)明前，市場上出售的重組人MICA主要是用大腸桿菌和人的細(xì)胞系進(jìn)行重組表達(dá)的。眾所周知，現(xiàn)有的大腸桿菌系統(tǒng)不具備對重組表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，特別是N-糖基修飾。在大腸桿 菌中重組表達(dá)的蛋白多以包涵體的形式存在，涉及復(fù)雜的變復(fù)性過程，且整個系統(tǒng)會產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素等諸多不利因素。人的細(xì)胞系等動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)通常需要消耗大量的血清而大大增加了生產(chǎn)成本,且生產(chǎn)周期和生產(chǎn)設(shè)備要求高,但產(chǎn)量卻很有限。值得注意的是，有很多的研究顯示了動物細(xì)胞系統(tǒng)所生產(chǎn)的蛋白產(chǎn)品具有潛在的病毒污染風(fēng)險。此外，曹利平等公開了一項MICA蛋白的制備方法專利(CN102154302A)，他用重組的桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞來重組表達(dá)和制備MICA蛋白。由于該方法采用了桿狀病毒系統(tǒng)，有直接的病毒污染的可能性，不符合目前關(guān)于臨床注射用治療性蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。同時，Sf9昆蟲表達(dá)系統(tǒng)具有一般動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所含有的缺點。
[0004]盡管畢赤酵母被廣泛用于嘗試表達(dá)各種人來源的重組蛋白，但是由于不同的蛋白本身具有復(fù)雜性和特殊性，因而最終的表達(dá)和制備效果是無法預(yù)測的。同時，成功地利用畢赤酵母來重組表達(dá)和制備MICA蛋白目前還沒有報道。
[0005]綜上，當(dāng)前急需要一種簡便，活性高，產(chǎn)量高和有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的重組人MICA蛋白的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案
[0007]本發(fā)明提供了一種利用畢赤酵母表達(dá)和制備重組人MICA蛋白的方法。
[0008]本發(fā)明的方案-1提供了在畢赤酵母中利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組人MICA蛋白的方法，其包括了重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)和重組蛋白的純化方法。
[0009]本發(fā)明的方案-2提供了在畢赤酵母中利用組成型表達(dá)(非甲醇誘導(dǎo))重組人MICA蛋白的方法，其包括了重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、重組蛋白表達(dá)和重組蛋白的純化方法。
[0010]具體而言，方案-1和方案-2都包含以下步驟:[0011](1)構(gòu)建組成型表達(dá)載體，其包含啟動子、終止子、抗生素抗性基因、分泌信號肽和MICA的編碼序列；
[0012](2)電轉(zhuǎn)畢赤酵母，利用抗生素濃度梯度來篩選高效表達(dá)克??；
[0013](3) MICA蛋白的表達(dá)和純化；
[0014]在本發(fā)明的一方面中，所用的分泌信號肽為a -factor的Pre序列(SEQ IDNo:1),而非完整的 a -factor Pre-Pro 序列(SEQ ID No: 2)。
[0015]在本發(fā)明的另一方面中，所用的MICA的編碼序列是未經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列。
[0016]在本發(fā)明的另一方面中，所用的MICA的編碼序列是經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列。對編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以利于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0017]在本發(fā)明的另一方面中，所表達(dá)的MICA蛋白的C末端不帶有6 X His標(biāo)簽。
[0018]在本發(fā)明的另一方面中，所表達(dá)的MICA蛋白的C末端帶有6 X His標(biāo)簽。
[0019]在本發(fā)明的方案-1的一個方面中，所構(gòu)建的甲醇誘導(dǎo)MICA表達(dá)載體包含的啟動子為AOXl轉(zhuǎn)錄啟動子，終止子為AOXl轉(zhuǎn)錄終止子，抗性基因為Zeocin抗性基因，分泌信號肽為a -factor的Pre序列，MICA的編碼序列為人MICA(AAH16929.1)胞外區(qū)編碼序列(Glu24-Gln308)。
[0020]在本發(fā)明的方案-2的一個方面中，所構(gòu)建的組成型表達(dá)MICA載體包含的啟動子為GAP啟動子，終止子為GAP轉(zhuǎn)錄終止子，抗性基因為Zeocin抗性基因，分泌信號肽為a -factor的Pre序列，MICA的編碼序列為人MICA(AAH16929.1)胞外區(qū)編碼序列(Glu24-Gln308)。
[0021]在本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域人員熟知的各種適用于畢赤酵母表達(dá)的質(zhì)粒載體，具體而言，方案-1的方法包括但不限于PPIC9K，pPICZ a -A/B/C ;方案-2的方法包括但不限于 pGAPZ-A/B/C，pGAPZ a -A/B/C。
[0022]在本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種合適的分泌信號肽，其包括但不限于a-factor、α _淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信號肽。
[0023]在本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域人員熟知的各種畢赤酵母菌株，其包括但不限于 X-33、GS115 和 KM71。
[0024]在本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如【具體實施方式】)具體描述的各技術(shù)特征可以互相結(jié)合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。
[0025]本發(fā)明的技術(shù)效果
[0026]本發(fā)明人員發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用a-factor Pre-Pro序列作為信號肽,會導(dǎo)致發(fā)酵上清中存在相當(dāng)一部分的Pro序列未被切割的Pro-MICA。因而,本研究人員采用a-factor的Pre序列作為信號肽，解決了 Pro序列殘留的問題，典型的效果展示見圖3。
[0027]本發(fā)明人員發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明方法表達(dá)和制備的MICA蛋白的分子量與用人的細(xì)胞系表達(dá)的MICA蛋白的分子量很接近。用糖苷酶F處理純化的MICA蛋白(見圖7)，發(fā)現(xiàn)分子量變?yōu)槔碚撝?4kDa，表明了 MICA被N-糖基修飾，這與MICA的天然形式很接近。
[0028]本發(fā)明方法表達(dá)產(chǎn)量高，搖瓶發(fā)酵就能實現(xiàn)> 20mg/L的產(chǎn)量。同時，發(fā)酵液的后期處理和純化方便，通過Ni柱純化和SlOOHR分子篩純化這兩步就可以實現(xiàn)純化過程。
[0029]更具體地，本發(fā)明提供以下各項:
[0030]1.一種用于在畢赤酵母中高效表達(dá)重組人MICA蛋白的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒從5’至3’依次包括以下元件:
[0031](1)控制基因轉(zhuǎn)錄的畢赤酵母啟動子；
[0032](2)控制所述重組人M1CA在畢赤酵母中分泌表達(dá)的信號肽序列；
[0033](3)所述重組人M1CA的編碼序列；和
[0034](4)轉(zhuǎn)錄終止子；
[0035]其中所述信號肽序列為a-factor的Pre序列，其核酸序列如SEQ 1D No:9所示。
[0036]2.根據(jù)1所述的表達(dá)盒，其中所述重組人M1CA的編碼序列如SEQ 1DNo:10所示。
[0037]3.根據(jù)1所述的表達(dá)盒，其中所述啟動子為PP1C9K質(zhì)粒中的AOXl啟動子，并且所述轉(zhuǎn)錄終止子為PP1C9K質(zhì)粒中的AOXl轉(zhuǎn)錄終止子。
[0038]4.根據(jù)3所述的表達(dá)盒,其序列如SEQ 1D No: 13所示。
[0039]5.根據(jù)1所述的表達(dá)盒，其中所述啟動子為pGAPZ a-A質(zhì)粒中的GAP啟動子，并且所述轉(zhuǎn)錄終止子為pGAPZ a -A質(zhì)粒中的GAP轉(zhuǎn)錄終止子。
[0040]6.根據(jù)5所述的表達(dá)盒,其序列如SEQ 1D No: 14所示。
[0041]7.一種畢赤酵母工程菌，所述畢赤酵母工程菌含有3或4所述的表達(dá)盒。
[0042]8.一種畢赤酵母工程菌，所述畢赤酵母工程菌含有5或6所述的表達(dá)盒。
[0043]9.一種甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并純化人M1CA蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0044](1)培養(yǎng)根據(jù)7所述的畢赤酵母工程菌，并且用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母AOXl啟動子，使得所述工程菌分泌表達(dá)人M1CA蛋白；和
[0045](2)從發(fā)酵液中純化所述人M1CA蛋白。
[0046]10.一種組成型表達(dá)并純化人M1CA蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0047](1)培養(yǎng)根據(jù)8所述的畢赤酵母工程菌，并且利用GAP啟動子使得所述工程菌組成型分泌表達(dá)人M1CA蛋白；和
[0048](2)從發(fā)酵液中純化所述人M1CA蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1:Pre-M1CA-H1s/pP1C9K 質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖；
[0050]圖2 =Pre-M1CA-H1 s/pGAPZ-A 質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖；
[0051]圖3:用Pre序列作為信號肽優(yōu)于用完整的a -factor Pre-Pro序列作為信號肽的效果圖；
[0052]圖4:蛋白質(zhì)印跡法(Western blott1ng)檢測甲醇誘導(dǎo)M1CA表達(dá)；
[0053]圖5:蛋白質(zhì)印跡法(Western blott1ng)檢測組成型M1CA表達(dá)；
[0054]圖6:分子篩S100HR純化的峰圖；
[0055]圖7:考馬斯亮藍(lán)染色方法檢測糖苷酶F處理的M1CA。
【具體實施方式】
[0056]實驗材料
[0057]1.1菌株與質(zhì)粒
[0058]巴斯德畢赤酵母(P1ch1apastor1s)菌株 GS115 和 X_33、pP1C9K 質(zhì)粒和 pGAPZ-A質(zhì)粒購自1nv1trogen公司。[0059]1.2 試劑
[0060]TRIzol 購自 Invitrogen 公司；M_MLV Reverse Transcriptase 購自 LifeTechnologies ；oligo dT 購自上海生工；pMD18_T 購自寶生物工程；Yeast NitrogenBase (YNB)購自 BD 公司；Yeast Extract 和 Trypton 購自 OXOID 公司；D_Sorbitol、Biotin、DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、蛋白marker和PAGE配制相關(guān)試劑購自上海生工；質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；G418購自Sigma-Aldrich公司；糖苷酶F購自New England Biolabs公司；抗His-標(biāo)簽mAb購自Abmart公司；二抗ant1-mouse IgG-HRP購自Bio Legend公司；其他化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)。
[0061 ] 下述實施例中其他所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0062]下述實施例中其他所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0063]實施例1.甲醇誘導(dǎo)MICA表達(dá)和制備方法，包括以下步驟:
[0064]1.lPre-MICA_His/pPIC9K 質(zhì)粒的構(gòu)建
[0065]1.1.1克隆完整的MICA基因的編碼序列(Metl_Ala383)
[0066]用TRIzol并按其說明書抽取離體的健康人外周血(購自合肥血站)單核細(xì)胞的總RNA,在M-MLV Reverse Transcriptase的作用下，以oligo dT為引物合成人cDNA。再以合成的cDNA為模板，用引物-1 (SEQ ID No: 3)和引物_2(SEQ ID No: 4)進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物插入到TA載體pMD18-T，獲得MICA/pMD18T。質(zhì)粒委托英俊公司測序，結(jié)果與預(yù)期一致。
[0067]1.1.2擴增Pre序列、MICA編碼序列(Glu24_Gln308)和6 XHis標(biāo)簽的融合片段Pre-MICA-His
[0068](I)以 MICA/pMD18T 質(zhì)粒為模板，用引物-3(SEQ ID No:5)和引物 _4(SEQ IDNo:6)進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為:先94°C 3分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C I分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約920bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。最后，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對PCR片段進(jìn)行回收。
[0069](2)用上述(I)的PCR回收產(chǎn)物為模板，用引物-5 (SEQ ID No:7)和引物_4(SEQID No:6)進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為:先94°C 3分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C I分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約955bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。最后，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對PCR片段進(jìn)行回收，進(jìn)而獲得了 Pre-MICA-His片段(N末端帶有BamH I限制性酶切位點，C末端帶有Not I限制性酶切位點)。
[0070]1.1.3Pre-MICA-His 片段與 pPIC9K 質(zhì)粒的連接
[0071]用BamH I和Not I分別雙酶切Pre-MICA-His片段和pPIC9K質(zhì)粒，分別純化回收Pre-MICA-His片段和pPIC9K質(zhì)粒，再用T4DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆。陽性重組質(zhì)粒委托英俊公司測序，結(jié)果表明Pre-MICA-His片段和pPIC9K質(zhì)粒正確連接，且Pre-MICA-His序列與預(yù)期一致，進(jìn)而獲得了 Pre-MICA-His/pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒，整個構(gòu)建流程見圖1。
[0072]以上所述質(zhì)粒中MICA蛋白的編碼序列如下所示:(ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCT)〈GAGCCCCACAGTCTTCGTTATAACCTCACGGTGCTGT CCTG
【權(quán)利要求】
1.一種用于在畢赤酵母中高效表達(dá)重組人MICA蛋白的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒從5’至3’依次包括以下元件: (1)控制基因轉(zhuǎn)錄的畢赤酵母啟動子； (2)控制所述重組人MICA在畢赤酵母中分泌表達(dá)的信號肽序列； (3)所述重組人MICA的編碼序列；和 (4)轉(zhuǎn)錄終止子； 其中所述信號肽序列為a -factor的Pre序列，其核酸序列如SEQ ID No:9所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述重組人MICA的編碼序列如SEQID No: 10所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述啟動子為PPIC9K質(zhì)粒中的AOXl啟動子，并且所述轉(zhuǎn)錄終止子為PPIC9K質(zhì)粒中的AOXl轉(zhuǎn)錄終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其序列如SEQID No: 13所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述啟動子為pGAPZa -A質(zhì)粒中的GAP啟動子，并且所述轉(zhuǎn)錄終止 子為pGAPZ a -A質(zhì)粒中的GAP轉(zhuǎn)錄終止子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒，其序列如SEQID No: 14所示。
7.一種畢赤酵母工程菌，所述畢赤酵母工程菌含有權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)盒。
8.一種畢赤酵母工程菌，所述畢赤酵母工程菌含有權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)盒。
9.一種甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并純化人MICA蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: (1)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求7所述的畢赤酵母工程菌，并且用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母AOXl啟動子，使得所述工程菌分泌表達(dá)人MICA蛋白；和 (2)從發(fā)酵液中純化所述人MICA蛋白。
10.一種組成型表達(dá)并純化人MICA蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: (1)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求8所述的畢赤酵母工程菌，并且利用GAP啟動子使得所述工程菌組成型分泌表達(dá)人MICA蛋白；和 (2)從發(fā)酵液中純化所述人MICA蛋白。
【文檔編號】C07K14/47GK103789340SQ201410027717
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】肖衛(wèi)華, 鐘永軍, 馬佳佳, 鄔婧, 仰露, 康文瑤, 田志剛 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)