一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素b分離提取方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其步驟是發(fā)酵液經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附，乙酸乙酯解析后，得粗品；粗品首先經(jīng)微濾膜、超濾膜除去大分子等雜質(zhì)；再將上述濾液經(jīng)過(guò)埃博霉素B分子印跡聚合物膜過(guò)濾得到純的埃博霉素B液體；最后經(jīng)過(guò)結(jié)晶得到埃博霉素B。本發(fā)明便于連續(xù)操作、易于放大、操作簡(jiǎn)單、成本低、選擇性高，可快速地將埃博霉素B分子從其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的混合物中分離出來(lái)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗生素分離提取領(lǐng)域，具體地涉及到一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]埃博霉素B(Epothilone B)是微生物纖維堆囊菌產(chǎn)生的一類(lèi)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物。1994年美國(guó)國(guó)家癌癥學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)埃博霉素B對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制活性，Merck實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)它和紫彬醇至少在微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)中具有相同作用，證明了埃博霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用的事實(shí)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)埃博霉素具有比紫彬醇優(yōu)越的抗腫瘤特性，使得研究者把更多的精力投入到對(duì)其合成及分離提取上，以期更快的將其開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤藥物。但是目前公開(kāi)發(fā)表的分離提取埃博霉素B方法步驟繁瑣，生產(chǎn)成本高，尚需研究大規(guī)模和簡(jiǎn)單廉價(jià)是分離純化方法。
[0003]分子印跡技術(shù)以其預(yù)定性、識(shí)別性和實(shí)用性三大特點(diǎn)引起科學(xué)界廣泛關(guān)注。將分子印跡技術(shù)與膜分離技術(shù)結(jié)合起來(lái)，制成的分子印跡聚合物膜(Molecular ImprintedMembrane, MIM),兼具分子印跡技術(shù)與膜分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，一方面,該技術(shù)具有便于連續(xù)操作、易于放大、能耗低、能量利用率高等優(yōu)點(diǎn)，被看作是一種“綠色化學(xué)”的典型；另一方面，與傳統(tǒng)的分子印跡微球材料相比，分子印跡聚合物膜具有材料更穩(wěn)定，不需研磨等繁瑣的制備過(guò)程，擴(kuò)散阻力小， 易于應(yīng)用等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)；另外，與目前商售膜如超濾、微濾及反滲透膜等無(wú)法實(shí)現(xiàn)單個(gè)物質(zhì)的選擇性分離的缺點(diǎn)相比，分子印跡膜的最大特點(diǎn)就是對(duì)模板分子的識(shí)別具有可預(yù)見(jiàn)性，針對(duì)性及高度選擇性，為將特定目標(biāo)分子從其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的混合物中分離出來(lái)提供了可行且有效的解決途徑。分子印跡膜鑒于以上特點(diǎn)，將其應(yīng)用到埃博霉素B的分離提取中將具有十分誘人的前景。
[0004]經(jīng)過(guò)檢索，目前還沒(méi)有將分子印跡聚合物膜應(yīng)用到埃博霉素B的分離純化過(guò)程中的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其操作簡(jiǎn)便，選擇性高，極大地降低了提純成本。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0007](I)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附:將纖維堆囊菌在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，并向液體培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)處理的大孔樹(shù)脂，發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾得到吸附樹(shù)脂；其中，大孔樹(shù)脂的加入量為液體培養(yǎng)基體積的2-5% ；
[0008](2)乙酸乙酯浸提:用乙酸乙酯浸提吸附樹(shù)脂，收集浸提液；
[0009](3)浸提液的初步過(guò)濾:將浸提液首先通過(guò)孔徑為0.2-0.5um的微濾膜過(guò)濾，除去殘留的菌體，得到濾液；再將濾液采用截留分子量為1000-5000的超濾膜過(guò)濾以去除大分子雜質(zhì)，收集濾液，得到粗提物；[0010](4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾:首先將博霉素B分子印跡聚合物膜固定在透過(guò)裝置的原料池和透過(guò)池之間，向原料池中加入粗提物，透過(guò)池中加入乙酸乙酯，將透過(guò)裝置密封，攪拌下進(jìn)行15_30min后，收集透過(guò)液得到埃博霉素B溶液；
[0011](5)結(jié)晶:將埃博霉素B溶液進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液于-20~-10°C下進(jìn)行結(jié)晶，得到白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0012]所述的步驟(1)中的液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉2.5~3.0g/L，蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖 0.2 ~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η20 2.3 ~2.5g/L, CaCl23.0 ~
3.5g/L, EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L，pH 值為 7.2 ;發(fā)酵的時(shí)間為 120_150h。
[0013]所述步驟(1)中纖維堆囊菌菌株號(hào)為ATCC25532或ATCC25569。
[0014]所述步驟(1)中大孔樹(shù)脂的采用如下方法進(jìn)行處理:首先，用3~5倍大孔樹(shù)脂體積的甲醇浸泡大孔樹(shù)脂，搖床震蕩12-16h后，去除甲醇溶液，水洗至無(wú)甲醇味；再用甲醇浸泡12-16h后，水洗至無(wú)甲醇味；大孔樹(shù)脂為XAD-16型大孔樹(shù)脂。
[0015]所述步驟(2)中乙酸乙酯的用量為大孔樹(shù)脂體積的3~5倍，浸提的時(shí)間為24-48h。
[0016]所述步驟(3)中微濾膜與超濾膜的材質(zhì)均為醋酸纖維素、聚砜、聚丙烯、聚丙烯腈、聚乙烯醇或聚酰胺。
[0017]所述步驟(3)中微濾膜過(guò)濾的操作壓力為0.1-0.5Mpa，操作溫度為0_40°C，控制流速5-10mL/min ;超濾 膜過(guò)濾的操作壓力為0.1-0.6MPa，溫度0_40°C，控制流速5_10mL/min0
[0018]所述的埃博霉素B分子印跡聚合物膜是采用如下方法得到的:將埃博霉素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比1:4:20混合均勻后，溶解于體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，攪拌均勻加入偶氮二異丁氰，充N(xiāo)2反應(yīng)12h ;然后將尼龍微孔濾膜浸泡20min后取出放入兩個(gè)玻璃片之間，在波長(zhǎng)為365nm、功率為400W的紫外燈下照射IOh后，將玻璃片分開(kāi)，用乙酸:甲醇體積比為1:9的溶液清洗掉埃博霉素B，即得到以尼龍微孔濾膜為支撐材料的埃博霉素B分子印跡聚合物膜；其中，所述體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量為20~25mL/lmmol埃博霉素B ;偶氮二異丁腈與埃博霉素B的比為5mg:Imol ο
[0019]所述步驟(4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾的具體過(guò)程如下:透過(guò)裝置為H型透過(guò)裝置，包括兩個(gè)完全相同的500mL帶有磨口支管的原料池和透過(guò)池，原料池和透過(guò)池中間用夾子將埃博霉素B分子印跡聚合物膜固定，保持原料池和透過(guò)池底部連通，H型透過(guò)裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm，原料池中加入粗提物250mL，透過(guò)池中加入乙酸乙酯250mL，將透過(guò)裝置密封，在攪拌下進(jìn)行15-30min后，收集透過(guò)液即得到埃博霉素B溶液。
[0020]所述步驟(5)中濃縮的溫度為40~45°C，真空度為-0.085~-0.09MPa。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明一方面采用膜過(guò)濾技術(shù)初步分離埃博霉素B，可以有效地去除一些大分子物質(zhì)，并且具有操作簡(jiǎn)便，選擇性好，低污染等特點(diǎn)。本發(fā)明另一方面將濾液滲透過(guò)分子印跡聚合物膜的方法，不僅是因?yàn)榘２┟顾谺分子印跡聚合物膜具有與埃博霉素B分子相匹配的孔穴，這些孔穴具有高度的選擇性及專(zhuān)一識(shí)別性，只能夠使埃博霉素B快速順利地通過(guò)孔道，而限制了其他分子的透過(guò)，最終得到純凈的埃博霉素B溶液；而且分子印跡膜在分離方面有著色譜分離所不具備的優(yōu)勢(shì)，它可以進(jìn)行連續(xù)的分離，兩且分離物的量也不受限制，簡(jiǎn)化了分離步驟，便于工業(yè)化大生產(chǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明中H型透過(guò)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]其中，I為原料池，2為透過(guò)池，3為埃博霉素B分子印跡聚合物膜。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0025]實(shí)施例1
[0026](I)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，并向液體培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)處理的大孔樹(shù)脂XAD-16，大孔樹(shù)脂XAD-16存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵120h后過(guò)濾得到吸附樹(shù)脂；
[0027]其中，大孔樹(shù)脂XAD-16的加入量為液體培養(yǎng)基體積的2% ；
[0028]大孔樹(shù)脂X AD-16的采用如下方法進(jìn)行處理:首先,用3倍大孔樹(shù)脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹(shù)脂XAD-16，搖床震蕩12h后，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹(shù)脂XAD-16至無(wú)甲醇味；再用甲醇浸泡12h后,純水洗至無(wú)甲醇味；
[0029]液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4 ? 7H20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0030](2)乙酸乙酯浸提:用4倍樹(shù)脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹(shù)脂24h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
[0031](3)用超濾膜過(guò)濾浸提液:
[0032]將埃博霉素B的粗提物首先通過(guò)孔徑為0.2-0.5um的醋酸纖維素材質(zhì)的微濾膜過(guò)濾，除去殘留的菌體，并用50mL的乙酸乙酯洗濾I次，合并濾液；其中，微濾膜過(guò)濾操作壓力為0.2Mpa，操作溫度為20°C，控制流速5mL/min。
[0033]再將合并后的濾液用超濾膜進(jìn)一步過(guò)濾:采用截留分子量為1000的醋酸纖維素材質(zhì)的超濾膜過(guò)濾，去除大分子雜質(zhì)，并用50mL的乙酸乙酯洗濾I次，合并濾液，得粗提物；其中，超濾膜過(guò)濾的操作壓力為0.2MPa，溫度20°C，控制流速5mL/min。
[0034](4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾:參見(jiàn)圖1，首先取兩個(gè)完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個(gè)為原料池1，另一個(gè)為透過(guò)池2，于兩個(gè)玻璃池中間用夾子將埃博霉素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒(méi)有滲漏，組成密封H型透過(guò)裝置，透過(guò)裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池I中加入上述濾液250mL，向透過(guò)池2中加入乙酸乙酯純?nèi)軇?50mL，將透過(guò)裝置密封，在電磁攪拌下進(jìn)行15min后，再將埃博霉素B分子印跡聚合物膜取出，用50mL乙酸乙酯洗脫I次得洗脫液，將透過(guò)液與洗脫液合并即為埃博霉素B溶液。
[0035]所述的埃博霉素B分子印跡聚合物膜是采用如下方法得到的:將埃博霉素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比1:4:20混合均勻后，溶解于體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，攪拌均勻加入偶氮二異丁氰，充N(xiāo)2反應(yīng)12h ;然后將尼龍微孔濾膜放入混合液中浸泡20min ;取出尼龍微孔濾膜置于兩個(gè)玻璃片之間，在波長(zhǎng)為365nm、功率為400W的紫外燈下照射IOh后，將玻璃片分開(kāi)，用乙酸:甲醇體積比為1:9的溶液清洗掉埃博霉素B，即得到以尼龍微孔濾膜為支撐材料的埃博霉素B分子印跡聚合物膜；其中，所述體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量為20~25mL/lmmol埃博霉素B ;偶氮二異丁腈與埃博霉素B的比為5mg: Imol ο
[0036](5)結(jié)晶:將埃博霉素B溶液在溫度為40°C、真空度為-0.085MPa下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器中-20°C低溫結(jié)晶，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0037]實(shí)施例2
[0038](I)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25569在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，并向液體培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)處理的大孔樹(shù)脂XAD-16，大孔樹(shù)脂XAD-16存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵150h后過(guò)濾得到吸附樹(shù)脂。
[0039]其中，大孔樹(shù)脂XAD-16的加入量為液體培養(yǎng)基體積的3% ；
[0040]大孔樹(shù)脂XAD-16的采用如下方法進(jìn)行處理:首先,用3倍大孔樹(shù)脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹(shù)脂XAD-16，搖床震蕩12h后，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹(shù)脂XAD-16至無(wú)甲醇味；再用甲醇浸泡12h后,純水洗至無(wú)甲醇味；
[0041]液體培養(yǎng)基成分為土豆淀 粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0042](2)乙酸乙酯浸提:用3倍樹(shù)脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹(shù)脂36h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
[0043](3)用超濾膜過(guò)濾浸提液:
[0044]將埃博霉素B的粗提物首先通過(guò)孔徑為0.2-0.5um的聚丙烯材質(zhì)的微濾膜過(guò)濾，除去殘留的菌體,并用乙酸乙酯洗濾2次，每次50mL，合并濾液；其中，微濾膜過(guò)濾操作壓力為0.4Mpa，操作溫度為30°C，控制流速8mL/min。
[0045]再將合并后的濾液用超濾膜進(jìn)一步過(guò)濾:采用截留分子量為2000的聚丙烯材質(zhì)的超濾膜過(guò)濾，去除大分子雜質(zhì)，并用乙酸乙酯洗濾2次，每次50mL，合并濾液，得粗提物；其中，超濾膜過(guò)濾的操作壓力為0.5MPa，溫度30°C，控制流速8mL/min。
[0046](4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾:首先取兩個(gè)完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個(gè)為原料池1，另一個(gè)為透過(guò)池2，于兩個(gè)玻璃池中間用夾子將埃博霉素B分子印跡聚合物膜固定，保持底部連通，保證兩池沒(méi)有滲漏，組成密封H型透過(guò)裝置，透過(guò)裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池I中加入上述濾液250mL，向透過(guò)池2中加入乙酸乙酯純?nèi)軇?50mL，將透過(guò)裝置密封，在電磁攪拌下進(jìn)行25min后，再將埃博霉素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫2次，每次50mL，得洗脫液，將透過(guò)液與洗脫液合并即為埃博霉素B溶液。
[0047]本實(shí)施例中的埃博霉素B分子印跡聚合物膜的制備方法同實(shí)施例1。
[0048](5)結(jié)晶:將埃博霉素B溶液在溫度為42°C、真空度為_(kāi)0.088MPa下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器中-20°C低溫結(jié)晶，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0049]實(shí)施例3
[0050](I)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，并向液體培養(yǎng)基加入經(jīng)過(guò)處理的大孔樹(shù)脂XAD-16，大孔樹(shù)脂XAD-16存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵130h后過(guò)濾得到吸附樹(shù)脂；
[0051 ] 其中，大孔樹(shù)脂XAD-16的加入量為液體培養(yǎng)基體積的5% ；
[0052]大孔樹(shù)脂XAD-16的采用如下方法進(jìn)行處理:首先，用3倍大孔樹(shù)脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹(shù)脂XAD-16，搖床震蕩12h后，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹(shù)脂XAD-16至無(wú)甲醇味；再用甲醇浸泡12h后,純水洗至無(wú)甲醇味；
[0053]液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0054](2)乙酸乙酯浸提:用5倍樹(shù)脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹(shù)脂48h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
[0055](3)用超濾膜過(guò)濾浸提液:將埃博霉素B的粗提物首先通過(guò)孔徑為0.2-0.5um的聚乙烯腈材質(zhì)的微濾膜過(guò)濾，除去殘留的菌體,并用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合并濾液；其中，微濾膜過(guò)濾操作壓力 為0.5Mpa，操作溫度為40°C，控制流速10mL/min。
[0056]再將合并后的濾液用超濾膜進(jìn)一步過(guò)濾:采用截留分子量為3000的聚乙烯腈材質(zhì)的超濾膜過(guò)濾，去除大分子雜質(zhì)，并用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合并濾液，得粗提物；其中，超濾操作壓力為0.6MPa，溫度40°C，控制流速10mL/min。
[0057](4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾:首先取兩個(gè)完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個(gè)為原料池1，另一個(gè)為透過(guò)池2，于兩個(gè)玻璃池中間用夾子將埃博霉素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒(méi)有滲漏，組成密封H型透過(guò)裝置，透過(guò)裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm，一池中加入上述濾液250mL，另一池中加入乙酸乙酯純?nèi)軇?50mL，將透過(guò)裝置密封，在電磁攪拌下進(jìn)行30min后，再將埃博霉素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫3次，每次50mL，將透過(guò)液與洗脫液合并即為埃博霉素B溶液。
[0058]本實(shí)施例中的埃博霉素B分子印跡聚合物膜的制備方法同實(shí)施例1。
[0059](5)結(jié)晶:將埃博霉素B溶液在溫度為45°C、真空度為_(kāi)0.09MPa下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器中-20°C低溫結(jié)晶，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0060]實(shí)施例4
[0061](I)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，并向液體培養(yǎng)基加入經(jīng)過(guò)處理的大孔樹(shù)脂XAD-16，大孔樹(shù)脂XAD-16存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵140h后過(guò)濾得到吸附樹(shù)脂；
[0062]其中，大孔樹(shù)脂XAD-16的加入量為液體培養(yǎng)基體積的4% ；
[0063]大孔樹(shù)脂XAD-16的采用如下方法進(jìn)行處理:首先，用5倍大孔樹(shù)脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹(shù)脂XAD-16，搖床震蕩14h后，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹(shù)脂XAD-16至無(wú)甲醇味；再用甲醇浸泡16h后,純水洗至無(wú)甲醇味；
[0064]液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4 ? 7H20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0065](2)乙酸乙酯浸提:用3倍樹(shù)脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹(shù)脂30h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
[0066](3)用超濾膜過(guò)濾浸提液:將埃博霉素B的粗提物首先通過(guò)孔徑為0.2-0.5um的聚乙烯醇材質(zhì)的微濾膜過(guò)濾，除去殘留的菌體,并用50mL的乙酸乙酯洗濾3次，合并濾液；其中，微濾膜過(guò)濾操作壓力為0.1Mpa,操作溫度為10°C,控制流速6mL/min。
[0067]再將合并后的濾液用超濾膜進(jìn)一步過(guò)濾:采用截留分子量為4000的聚乙烯醇材質(zhì)的超濾膜過(guò)濾，去除大分子雜質(zhì)，并用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合并濾液，得粗提物；其中，超濾操作壓力為0.1MPa，溫度0°C，控制流速7mL/min。 [0068](4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾:首先取兩個(gè)完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個(gè)為原料池1，另一個(gè)為透過(guò)池2，于兩個(gè)玻璃池中間用夾子將埃博霉素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒(méi)有滲漏，組成密封H型透過(guò)裝置，透過(guò)裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池中加入上述濾液(即粗提物)250mL,向透過(guò)池中加入乙酸乙酯純?nèi)軇?50mL，將透過(guò)裝置密封，在電磁攪拌下進(jìn)行20min后，再將埃博霉素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫3次，每次50mL，將透過(guò)液與洗脫液合并即為埃博霉素B溶液。
[0069]本實(shí)施例中的埃博霉素B分子印跡聚合物膜的制備方法同實(shí)施例1。
[0070](5)結(jié)晶:將埃博霉素B溶液在溫度為41°C、真空度為-0.09MPa下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器中-20°C低溫結(jié)晶，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0071]實(shí)施例5
[0072](I)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，并向液體培養(yǎng)基加入經(jīng)過(guò)處理的大孔樹(shù)脂XAD-16，大孔樹(shù)脂XAD-16存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵125h后過(guò)濾得到吸附樹(shù)脂；
[0073]其中，大孔樹(shù)脂XAD-16的加入量為液體培養(yǎng)基體積的2% ；
[0074]大孔樹(shù)脂XAD-16的采用如下方法進(jìn)行處理:首先，用4倍大孔樹(shù)脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹(shù)脂XAD-16，搖床震蕩16h后，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹(shù)脂XAD-16至無(wú)甲醇味；再用甲醇浸泡14h后,純水洗至無(wú)甲醇味；
[0075]液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4 ? 7H20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0076](2)乙酸乙酯浸提:用5倍樹(shù)脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹(shù)脂40h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
[0077](3)用超濾膜過(guò)濾浸提液:將埃博霉素B的粗提物首先通過(guò)孔徑為0.2-0.5um的聚砜材質(zhì)的微濾膜過(guò)濾，除去殘留的菌體,并用乙酸乙酯洗濾2次，每次50mL，合并濾液；其中，微濾膜過(guò)濾操作壓力為0.5Mpa，操作溫度為40°C，控制流速10mL/min。
[0078]再將合并后的濾液用超濾膜進(jìn)一步過(guò)濾:采用截留分子量為3000的聚砜材質(zhì)的超濾膜過(guò)濾，去除大分子雜質(zhì)，并用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合并濾液，得粗提物；其中，超濾操作壓力為0.6MPa，溫度40°C，控制流速10mL/min。
[0079](4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾:首先取兩個(gè)完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個(gè)為原料池1，另一個(gè)為透過(guò)池2，于兩個(gè)玻璃池中間用夾子將埃博霉素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒(méi)有滲漏，組成密封H型透過(guò)裝置，透過(guò)裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池I中加入上述濾液250mL，向透過(guò)池2中加入乙酸乙酯純?nèi)軇?50mL，將透過(guò)裝置密封，在電磁攪拌下進(jìn)行30min后，再將埃博霉素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫3次，每次50mL，將透過(guò)液與洗脫液合并即為埃博霉素B溶液。
[0080]本實(shí)施例中的埃博霉素B分子印跡聚合物膜的制備方法同實(shí)施例1。
[0081](5)結(jié)晶:將埃博霉素B溶液在溫度為45°C、真空度為-0.09MPa下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器中-20°C低溫結(jié)晶，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0082]本發(fā)明提供了一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其步驟是發(fā)酵液經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附，乙酸乙酯解析后，得粗品；粗品首先經(jīng)微濾膜、超濾膜除去大分子等雜質(zhì)；再將上述濾液經(jīng)過(guò)埃博霉素B分子印跡聚合物膜過(guò)濾得到純的埃博霉素B液體；最后經(jīng)過(guò)結(jié)晶得到埃博霉素B的晶體。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):便于連續(xù)操作、易于放大、操作簡(jiǎn)單、成本低、選擇性高，可快速地將埃博霉素B分子從其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的混合物中分離出來(lái)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有十分誘人的前景。
[0083]本發(fā)明所提供的分子印跡膜的方法便于連續(xù)操作、易于放大，并且具有可預(yù)見(jiàn)性，針對(duì)性及高度選擇性等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了特定的目標(biāo)分子從其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的混合物中分離出來(lái)的目的。`
【權(quán)利要求】
1.一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附:將纖維堆囊菌在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，并向液體培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)處理的大孔樹(shù)脂，發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾得到吸附樹(shù)脂；其中，大孔樹(shù)脂的加入量為液體培養(yǎng)基體積的2-5% ； (2)乙酸乙酯浸提:用乙酸乙酯浸提吸附樹(shù)脂，收集浸提液； (3)浸提液的初步過(guò)濾:將浸提液首先通過(guò)孔徑為0.2-0.5um的微濾膜過(guò)濾，除去殘留的菌體，得到濾液；再將濾液采用截留分子量為1000-5000的超濾膜過(guò)濾以去除大分子雜質(zhì)，收集濾液，得到粗提物； (4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾:首先將博霉素B分子印跡聚合物膜固定在透過(guò)裝置的原料池和透過(guò)池之間，向原料池中加入粗提物，透過(guò)池中加入乙酸乙酯，將透過(guò)裝置密封，攪拌下進(jìn)行15-30min后，收集透過(guò)液得到埃博霉素B溶液； (5)結(jié)晶:將埃博霉素B溶液進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液于-20~-10°C下進(jìn)行結(jié)晶，得到白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。`
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述的步驟(1)中的液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉2.5~3.0g/L，蔗糖0.7~1.0g/L，葡萄糖 0.2 ~0.5g/L，豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7H202.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L，pH 值為 7.2 ;發(fā)酵的時(shí)間為 120_150h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述步驟(1)中纖維堆囊菌菌株號(hào)為ATCC25532或ATCC25569。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述的步驟(1)中大孔樹(shù)脂的采用如下方法進(jìn)行處理:首先，用3~5倍大孔樹(shù)脂體積的甲醇浸泡大孔樹(shù)脂，搖床震蕩12-16h后，去除甲醇溶液，水洗至無(wú)甲醇味；再用甲醇浸泡12-16h后，水洗至無(wú)甲醇味；大孔樹(shù)脂為XAD-16型大孔樹(shù)脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中乙酸乙酯的用量為大孔樹(shù)脂體積的3~5倍，浸提的時(shí)間為24-48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中微濾膜與超濾膜的材質(zhì)均為醋酸纖維素、聚砜、聚丙烯、聚丙烯腈、聚乙烯醇或聚酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中微濾膜過(guò)濾的操作壓力為0.1-0.5Mpa，操作溫度為0-40°C，控制流速5-10mL/min ;超濾膜過(guò)濾的操作壓力為0.1-0.6MPa，溫度0_40°C，控制流速5_10mL/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述的埃博霉素B分子印跡聚合物膜是采用如下方法得到的:將埃博霉素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比1:4:20混合均勻后，溶解于體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，攪拌均勻加入偶氮二異丁氰，充N(xiāo)2反應(yīng)12h ;然后將尼龍微孔濾膜浸泡20min后取出放入兩個(gè)玻璃片之間，在波長(zhǎng)為365nm、功率為400W的紫外燈下照射IOh后，將玻璃片分開(kāi)，用乙酸:甲醇體積比為1:9的溶液清洗掉埃博霉素B，即得到以尼龍微孔濾膜為支撐材料的埃博霉素B分子印跡聚合物膜；其中，所述體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量為20~25mL/lmmol埃博霉素B ;偶氮二異丁腈與埃博霉素B的比為5mg:1mol ο
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述步驟(4)埃博霉素B分子印跡膜過(guò)濾的具體過(guò)程如下:透過(guò)裝置為H型透過(guò)裝置，包括兩個(gè)完全相同的500mL帶有磨口支管的原料池和透過(guò)池，原料池和透過(guò)池中間用夾子將埃博霉素B分子印跡聚合物膜固定，保持原料池和透過(guò)池底部連通，H型透過(guò)裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm，原料池中加入粗提物250mL，透過(guò)池中加入乙酸乙酯250mL，將透過(guò)裝置密封，在攪拌下進(jìn)行15-30min后，收集透過(guò)液即得到埃博霉素B溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡膜過(guò)濾技術(shù)的埃博霉素B分離提取方法，其特征在于，所述`步驟(5)中濃縮的溫度為40~45°C，真空度為-0.085~-0.09MPa。
【文檔編號(hào)】C07D493/04GK103772406SQ201410032060
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】龔國(guó)利, 趙婷峰 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)