雙酚A的抗原模擬表位Ph3及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及雙酚A的抗原模擬表位，其氨基酸序列為YPAYTYNNLMHN。本發(fā)明雙酚A抗原模擬表位可以替代價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應(yīng)用于雙酚A的免疫學(xué)檢測，該抗原的模擬表位具有與天然雙酚A分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了雙酚A對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】雙酚A的抗原模擬表位Ph3及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及雙酚A抗原模擬表位及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雙酚A (Bisphenol A，BPA)是一種化工材料，用來生產(chǎn)防碎塑料。資料表明，雙酚A屬于毒性化學(xué)物。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙酚A有模擬雌激素的效果，即使很低的劑量也能使動(dòng)物產(chǎn)生雌性早熟、精子數(shù)下降、前列腺增長的作用。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雙酚A具有一定的胚胎毒性和致畸性。雙酚A能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，威脅胎兒和兒童的健康，癌癥和新陳代謝紊亂導(dǎo)致的肥胖也被認(rèn)為與此有關(guān)。在人類生活環(huán)境中，雙酚A無處不在，從飲料水瓶、醫(yī)療器械到食品包裝內(nèi)里，很多塑料制品都含有雙酚A。對(duì)雙酚A進(jìn)行即使檢測是預(yù)防和控制其危害的有效手段。 [0003]目前對(duì)雙酚A的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、光譜分析法、電化學(xué)分析法、免疫學(xué)檢測等。雖然上述方法靈敏、精確、可靠，但所需設(shè)備昂貴且運(yùn)行費(fèi)用高，很難在基層工作中大規(guī)模開展。免疫學(xué)檢測方法以其靈敏度高、檢測方便、成本低廉等優(yōu)勢在雙酚A的檢測中得到廣泛應(yīng)用。但是該方法必須使用標(biāo)準(zhǔn)品，不僅增加了檢測成本，而且對(duì)檢測人員及環(huán)境易造成危害，在一定程度上制約了免疫學(xué)方法的應(yīng)用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨(dú)特型抗體及抗原模擬表位技術(shù)來實(shí)現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的替代，并取得了一定的進(jìn)展。噬菌體展示肽庫技術(shù)的主要特點(diǎn)是可有效地篩選出與目標(biāo)靶體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，該技術(shù)在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位、新型疫苗的研制等方面應(yīng)用廣泛。
[0004]本方面通過用噬菌體展示肽庫技術(shù)，從肽庫中篩選出能與靶分子(抗雙酚A單克隆抗體)特異性結(jié)合的多肽(抗原模擬表位)。該抗原模擬表位具有與天然雙酚A分子相似的免疫反應(yīng)特性，通過獲得的雙酚A抗原模擬表位，一替代價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應(yīng)用于雙酚A的免疫學(xué)檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供雙酚A的抗原模擬表位及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明以抗雙酚A單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標(biāo)板上，投入噬菌體隨機(jī)展示十二肽庫，進(jìn)行親和淘選，獲得了雙酚A的抗原模擬表位Ph3。氨基酸序列如下:YPAYTYNNLMHN。
[0007]本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，分別對(duì)應(yīng)為:TATCCTGCGTATACGTATAATAATCTTATGCATAATo
[0008]上述抗原模擬表位(多肽)結(jié)構(gòu)中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，即C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，W代表色氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，A代表丙氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基。
[0009]所述抗原模擬表位的制備方法，可通過噬菌體擴(kuò)增、化學(xué)合成或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備；所述噬菌體擴(kuò)增是指將展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體，通過生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體粒子；所述化學(xué)合成指依據(jù)模擬表位模擬表位氨基酸序列，通過化學(xué)合成多肽的方式進(jìn)行多肽合成；所述基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼模擬表位的基因，通過克隆至表達(dá)載體，以多肽-融合蛋白的形式進(jìn)行雙酚A抗原模擬表位的大量制備。
[0010]本發(fā)明還涉及所述雙酚A抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測分析中的應(yīng)用。免疫學(xué)檢測的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點(diǎn)雜交等基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測類型。
[0011]本發(fā)明雙酚A抗原模擬表位(YPAYTYNNLMHN)在應(yīng)用時(shí)，可以把合成的模擬表位用于免疫學(xué)檢測分析，將通過噬菌體擴(kuò)增獲得的展示有雙酚A抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測，當(dāng)然，也可以將雙酚A抗原模擬表位從噬菌體上切下來代替雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行免疫學(xué)檢測分析。
[0012]還涉及雙酚A抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學(xué)檢測分析中應(yīng)用。
[0013]還涉及雙酚A抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應(yīng)用。
[0014]前述雙酚A抗原模擬表位可以代替價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應(yīng)用于雙酚A的免疫學(xué)檢測，該抗原模擬表位具有天然雙酚A分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。
[0015]本發(fā)明的有益效果是·:本發(fā)明雙酚A抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應(yīng)用于雙酚A的免疫學(xué)檢測，該抗原模擬表位具有與天然雙酚A分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了雙酚A對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1以雙酚A抗原模擬表位建立的間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。雙酚A抗原模擬表位Ph-3 (YPAYTYNNLMNH)與抗雙酚A抗體的IC50值分別為24pg/ml。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1.雙酚A抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定
雙酚A抗原模擬表位的親和淘選:具體方法為:用IOmM PBS (pH 7.4)稀釋抗雙酚A單克隆抗體，并以終濃度60 Pg/mL包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用TBST (50mMNaCl, pH 7.5 包含0.1% Tween_20(v/v))洗滌 10次后加入300 μ L封閉液(3% BSA-PBS)4°C孵育2小時(shí)。兩小時(shí)后棄封閉液，用TBS 10倍稀釋噬菌體原液，約1.0X10npfu)。22°C震蕩反應(yīng)0.5小時(shí)。棄去未結(jié)合的噬菌體，用TBST洗滌10次，結(jié)合上的噬菌體用0.2 MGlycine-HCl (pH 2.2)洗脫，并立即用 15 μ L IM Tris-HCl (pH 9.I)中和。取 10 μ L洗脫噬菌體測滴度，其余的用于感染20 mL生長至對(duì)數(shù)前期的Ε.Coli ER2738菌株進(jìn)行擴(kuò)增。第三天用PEG/NaCl沉淀純化噬菌體，并測定擴(kuò)增后噬菌體的滴度。[0018]在第二、第三輪的淘選過程中，包被的抗雙酚A單克隆抗體濃度分別為45 Pg/mL和35 Pg/mL，所用的TBST濃度為0.5%和1.5%，其余步驟同上。
[0019]2)陽性噬菌體克隆的鑒定:從第三輪淘選后測定噬菌體滴度的平板中隨機(jī)挑取20個(gè)曬菌體斑,進(jìn)行曬菌體的擴(kuò)增，采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay, 1-ELISA)進(jìn)行陽性曬菌體克隆的鑒定,具體方法為:首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗雙酚A單克隆抗體，lOPg/mL，包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS,0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37°C孵育I小時(shí)；投入100 μ L噬菌體斑擴(kuò)增液(1.0 X 10npfu)，以原始噬菌體肽庫作為陰性對(duì)照，37°C孵育I小時(shí)；加入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記抗M13噬菌體二抗100 μ L，37°C孵育I小時(shí)；加入100 μ L TMB底物液，避光顯色5min，酶標(biāo)儀(ThermoScientific Multiskan FC)讀取450 nm處的吸收值。選取0D450大于陰性對(duì)照2倍的噬圃體克隆為陽性克隆。
[0020]3)雙酚A抗原模擬表位的鑒定:采用間接競爭ELISA的方法進(jìn)行雙酚A抗原模擬表位的鑒定，具體方法為:用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗雙酚A單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標(biāo)板，4°C孵育過夜；第二天用PBST (10 mM PBS,0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37°C孵育I小時(shí)；投入50 μ L經(jīng)間接ELISA鑒定為陽性的噬菌體克隆(1.0X IO11Pfu)和50 UL雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品(濃度范圍為0-2 ng/mL)，37°C孵育I小時(shí)；加入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記抗M13噬菌體二抗100 μ L，37°C孵育I小時(shí)；加入100 μ L TMB底物液，避光顯色5min，讀取0D450，能結(jié)合抗雙酚A單克隆抗體，且能被雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品所阻斷的噬菌體，鑒定為雙酚A的抗原模擬表位。
[0021]實(shí)施案例2.雙酚A抗原模擬表位編碼基因的測序及其氨基酸序列的確定
將實(shí)施例1經(jīng)過間接競爭ELISA鑒定展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，提取噬菌體的DNA測序模板。簡要過程如下:進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，在第一部離心后將800 UL含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新離心管。加入200 μ L PEG/NaCl沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100 μ L 碘化物緩沖液(10 mM Tris-HClCpH 8.0), I mM EDTA, 4M NaCl),加入 250 μ L無水乙醇沉淀DNA，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(DNA測序模板)。沉淀最終重懸于20 μ L滅菌水，取2 y L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5 UL噬菌體模板進(jìn)行DNA測序，其-96 g III測序引物為:5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依據(jù)DNA測序結(jié)果及密碼子表可獲得雙酚A抗原模擬表位的氨基酸序列Ph3。氨基酸序列如下:YPAYTYNNLMHN。
[0022]實(shí)施案例3雙酚A抗原模擬表位作為競爭抗原在ELISA中的應(yīng)用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60%的甲醇-PBS溶液，200rpm震蕩5min ;將提取液用whatman I號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0023](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗雙酚A單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37 °C孵育I小時(shí)后，用PBST洗板6次待用。
[0024]( 3 )標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ L展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體(1.0X IO11Pfu)和一系列不同濃度的50 μ L雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D450。以雙酚A濃度對(duì)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入雙酚A的孔的0D450/未加入雙酚A的孔的0D450X 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，線性相關(guān)性較好(圖1)。如圖1，以雙酚A抗原模擬表位建立的間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。雙酚A抗原模擬表位Ph-3 (YPAYTYNNLMNH)與抗雙酚A抗體的IC50值分別為24pg/ml。
[0025](4)樣品的檢測
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ L展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體(1.0X IO11Pfu)和待測樣品提取液，37°C孵育I小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D450，計(jì)算結(jié)合率，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，倒推出樣品雙酚A的含量。
[0026]實(shí)施例4.雙酚A抗原模擬表位作為固相抗原在ELISA中的應(yīng)用 樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60%的甲醇-PBS溶液，200 rpm震蕩
5分鐘；將提取液用whatman I號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0027](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體(2.0X 10npfu)，100微升包被于酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS,0.05%Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的·PBS進(jìn)行封閉，37 °C孵育I小時(shí)后，用PBST洗板6次待用。
[0028]( 3 )標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ L抗雙酚A單克隆抗體(2ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ L雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D450。以雙酚A濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入雙酚A的孔的雙酚A的孔的0D450/未加入雙酚A的孔的0D450X 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029](4)樣品的檢測
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 111^抗雙酚4單克隆抗體(21^/!111)和一系列不同濃度的50 μ L雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D450。以雙酚A濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入雙酚A的孔的雙酚A的孔的0D450/未加入雙酚A的孔的0D450X 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030]實(shí)施例5.雙酚A抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層系分析中的應(yīng)用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60%的甲醇-PBS溶液，200 rpm震蕩5分鐘；將提取液用whatman I號(hào)濾紙進(jìn)行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0031](2)噬菌體及控制線的點(diǎn)陣用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體(2.0 X 10npfu)，用點(diǎn)陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑0.2-0.45微米)，作為檢測線；將0.5 mg/ml的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，用點(diǎn)陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測線的上方，距離大于5毫米)，作為控制線。
[0032]( 3 )膠體金標(biāo)記雙酚A抗體
將雙酚A抗體逐滴加入膠體金溶液(pH=8.2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1%PEG加入上述溶液中，繼續(xù)攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% BSA溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標(biāo)記的雙酚A抗體溶液。
[0033](4)膠體金檢測卡的組裝
將膠體金標(biāo)記的雙酚A抗體點(diǎn)噴于膠金墊上(1.0微克/毫升)，將樣品墊、膠金墊，點(diǎn)陣了檢測線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進(jìn)行組裝，切成試紙條，裝入檢測卡中待用。
[0034](5)樣品的檢測
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有雙酚A且超過膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區(qū)域不顯色，而控制線區(qū)域顯色；若樣品中不含有雙酚A且低于膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區(qū)域顯色，控制線區(qū)域也顯色。若控制線區(qū)域不顯色，表明試紙條失效。
[0035]實(shí)施例5雙酚A抗原模擬表位的大量制備
(I)以曬菌體擴(kuò)增的方式
將展示有雙酚A抗原模擬表位·的噬菌體加入至20 ml接種有ER 2738的培養(yǎng)物中，37V 220 rpm震蕩培養(yǎng)4.5小時(shí)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入另一離心管中，4°C 1000 rpm離心10 min,將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4 V下靜置120 min。4°C1000Orpm離心PEG/NaCl靜置溶液15min。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入ImLTBS進(jìn)行重懸，即為噬菌體擴(kuò)增液。
[0036](2)以雙酚A抗原模擬表位-融合蛋白的方式進(jìn)行制備 A.用PCR擴(kuò)增雙酚A抗原模擬表位的外源編碼基因
PCR反應(yīng)體系:(50μ L)
10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus) 5 M-L
dNTP Mixture (each for 2.5 mM) 4 M-L
M13KE insert extension primer (10 mM) I M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM) I M-L
噬菌體DNA模板I μL
Pyrobest DNA Polymerase 0.5 M-L
滅菌 ddH20 37.5 μL
PCR反應(yīng)條件:
(I)95°C 5 min; (2) 30 cycles: 95 °C 30 sec, 55 °C 30 sec, 72 °C 40sec (3) 72°C10 min。
[0037]采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，微量核酸定量儀定量。本發(fā)明雙酚A抗原模擬表位的編碼基因序列分別對(duì)應(yīng)為:
TATCCTGCGTATACGTATAATAATCTTATGCATAATo[0038]B.外源編碼基因及表達(dá)載體的雙酶切
分別采用ACC65I和Eag I酶對(duì)外源編碼基因和表達(dá)載體(pMAl-pIII, NEB公司，可表達(dá)MBP融合蛋白)進(jìn)行雙酶切。
[0039]C.酶切后產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
將質(zhì)粒pMal-ΡΙΙΙ和目的片段以1: 10 (摩爾比)混勻，于16 °〇水浴連接12h，取10μ L連接產(chǎn)物加至100 μ L感受態(tài)細(xì)胞TBl中，充分混勻。冰浴30 min后，42 V水浴熱激90 S，立即冰浴5 min后補(bǔ)加600 μ L LB液體培養(yǎng)液，37 °C, 200 rpm培養(yǎng)I h，10000 rpm離心2 min，吸去上清留取約200 μ L，涂布于LB-A固體(Ampr)培養(yǎng)基中，37 °C過夜培養(yǎng)，得到陽性克隆。[0040]D.雙酚A抗原模擬表位-MBP融合蛋白的表達(dá)
將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 mL LB-A，0.2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物按I %接種量(v/v)接種于50 mL的LB_A，0.2 %蔗糖培養(yǎng)基中，分別接種3瓶，37°C，220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物細(xì)菌濃度0D600達(dá)到
0.6時(shí)，向三瓶培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L,220 r/min振蕩培養(yǎng)，將誘導(dǎo)物(PEG溶液)于4 0C, 4000 g，離心20 min收集菌體沉淀，棄上清。重懸細(xì)胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g細(xì)胞濕重)，加入EDTA至I mM，室溫下震蕩5-10min,8000 g,4°C,離心20 min,棄上清,沉淀重懸于400 ml預(yù)冷的5 mM MgS04,冰上震蕩10min,8000 g,4°C,離心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL I M Tris-HCl, pH 7.4,獲得雙酚A模擬表位-MBP融合蛋白。
【權(quán)利要求】
1.雙酚A的抗原模擬表位Ph3，其特征在于氨基酸序列為:YPAYTYNNLMHN。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列對(duì)應(yīng)為:TATCCTGCGTATACGTATAATAATCTTATGCATAAT。
4.如權(quán)利要求1所述抗原模擬表位的制備方法，其特征在于通過噬菌體擴(kuò)增、化學(xué)合成或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備；所述噬菌體擴(kuò)增是指將展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體，通過生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有雙酚A抗原模擬表位的噬菌體粒子；所述化學(xué)合成指依據(jù)模擬表位模擬表位氨基酸序列，通過化學(xué)合成多肽的方式進(jìn)行多肽合成；所述基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼模擬表位的基因，通過克隆至表達(dá)載體，以多肽-融合蛋白的形式進(jìn)行雙酚A抗原模擬表位的大量制備。
5.權(quán)利要求1所述抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測分析中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于雙酚A抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學(xué)檢測分析中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于雙酚A抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分 析中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K7/08GK103848898SQ201410053340
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】何慶華, 許楊, 孫澄浩, 陳靜 申請人:南昌大學(xué)