一種調(diào)控楊樹生長發(fā)育的生長素響應(yīng)因子基因PeARF17.1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種調(diào)控楊樹生長發(fā)育的生長素響應(yīng)因子基因PeARF17.1及其應(yīng)用，所述基因PeARF17.1的DNA序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明通過將PeARF17.1基因轉(zhuǎn)入楊樹，過量表達(dá)PeARF17.1的轉(zhuǎn)基因楊無明顯主干，叢生狀態(tài)，根莖結(jié)合部扁平，不定根數(shù)顯著增多，說明楊樹生長素響應(yīng)因子基因PeARF17.1是控制楊樹生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在林木基因工程領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種調(diào)控楊樹生長發(fā)育的生長素響應(yīng)因子基因/7M/?廠/7.1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種調(diào)控楊樹生長發(fā)育的生長素響應(yīng)因子基因PeARF17.1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]楊樹是我國重要的速生工業(yè)用材樹種和綠化造林樹種，加快楊樹育種的應(yīng)用基礎(chǔ)研究具有緊迫性和必要性。據(jù)第七次全國森林資源清查統(tǒng)計(jì)，截止2008年底，我國楊樹人工林總面積已超過700萬公頃，居世界第一，楊樹木材產(chǎn)量占全國木材總量的30%左右。目前國內(nèi)外楊樹育種的發(fā)展趨勢(shì)主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面繼續(xù)以常規(guī)育種為主，不斷完善育種技術(shù)，由過去的單一追求產(chǎn)量為育種目標(biāo)發(fā)展到與工業(yè)用材相結(jié)合的生長、材性、干形、資源利用等多性狀聯(lián)合改良為目標(biāo)的定向育種；另一方面加快生物技術(shù)在楊樹育種中的應(yīng)用，發(fā)展分子育種技術(shù)體系。
[0003]生長素調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個(gè)階段。生長素響應(yīng)因子(Auxin responsefactor, ARF)在生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著轉(zhuǎn)錄“開關(guān)”作用，調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，促進(jìn)或抑制植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成。ARF轉(zhuǎn)錄因子，通過識(shí)別并結(jié)合生長素響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的TGTCTC生長素響應(yīng)元件(AuxRE)來激活或抑制該基因的表達(dá)。同其它轉(zhuǎn)錄因子一樣，ARF具有一些特定結(jié)構(gòu)域，一般包括氨基端DNA結(jié)合域(DBD)、中間激活區(qū)(AD)或抑制區(qū)(RD)及羧基末端的二聚體功能域(CTD)，其中CTD區(qū)域可與Auxin/IAA形成二聚體，抑制生長素響應(yīng)基因表達(dá)。
[0004]ARF轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)以家族的形式存在，并且物種之間的^^基因存在一定的同源性。當(dāng)前，有關(guān)基因家族功能的闡釋主要來自于對(duì)擬南芥、水稻和玉米等草本植物的研究，加之基因家族成員之間存在功能冗余現(xiàn)象，因此并不是所有的基因功能都能得到很好的解析，而且草本植物中的基因家族分支不能完全代表高等植物中所有ARF的功能和特征，所以在多年生木本植物中對(duì)ARF家族進(jìn)行研究將有助于人們深入認(rèn)識(shí)和理解基因家族及其生長素信號(hào)在植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控模式。
[0005]目前，在楊樹中尚未有基因家族克隆和功能研究的相關(guān)報(bào)道。克隆和開發(fā)利用這些基因資源，不僅有助于闡明林木生長發(fā)育的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，而且還能促進(jìn)林木分子育種進(jìn)程，對(duì)農(nóng)、林與園藝業(yè)的發(fā)展具有不可估量的價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控楊樹生長發(fā)育的生長素響應(yīng)因子基因7.1。本發(fā)明的另一目的是提供一種楊樹生長素響應(yīng)因子基因I的應(yīng)用。
[0007]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種調(diào)控楊樹生長發(fā)育的生長素響應(yīng)因子基因2，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0008]含有所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因PeARFl 7.1的載體。所述載體在PeARFl 7.1基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子P35S。所述載體在I基因的3’端組裝有強(qiáng)終止子N0S。所述載體組裝HPT基因表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選標(biāo)記，可以用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選。所述載體組裝有能促使組裝于其間的7基因表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因HPT整合至楊樹受體細(xì)胞染色體中的LB和RB序列。
[0009]含有所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因7.1的宿主細(xì)胞。
[0010]所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因I在調(diào)控楊樹生長發(fā)育過程中的應(yīng)用。
[0011]所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因PeARFl 7.1的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0012]本發(fā)明以南林895楊不定根為材料，通過RACE技術(shù)克隆了7基因。同時(shí)，采用通路克隆技術(shù)構(gòu)建其楊樹過量表達(dá)載體pH35GS-PeARF17.1，該基因位于啟動(dòng)子P35S之后，在啟動(dòng)子P35S的驅(qū)動(dòng)下，I可在楊樹體內(nèi)高效表達(dá)，從而調(diào)控楊樹的生長和發(fā)育。其中，I基因是調(diào)控楊樹生長發(fā)育的關(guān)鍵基因。
[0013]有益效果:本發(fā)明通過將/^7^7 7.7基因轉(zhuǎn)入楊樹，過量表達(dá)作他朽7.1的轉(zhuǎn)基因楊無明顯主干，叢生狀態(tài)，根莖結(jié)合部扁平，不定根數(shù)顯著增多，說明7.7基因是控制楊樹生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在林木基因工程領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是植物表達(dá)載體pH5GS的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2良PeARF17.1基因在楊樹不定根發(fā)生發(fā)育過程中的表達(dá)模式圖；
圖3是過量表達(dá)7^4^27.1的轉(zhuǎn)基因楊的分子檢測(cè)圖；
圖4是過量表達(dá)I的轉(zhuǎn)基因楊與未轉(zhuǎn)基因楊的整體形態(tài)對(duì)比圖，圖中，左邊為轉(zhuǎn)基因楊，右邊為未轉(zhuǎn)基因楊；
圖5是過量表達(dá)I的轉(zhuǎn)基因楊與未轉(zhuǎn)基因楊根系比較圖，圖中，左邊為轉(zhuǎn)基因楊，右邊為未轉(zhuǎn)基因楊。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例中未進(jìn)行詳盡說明的操作可參照生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、相關(guān)試劑盒使用說明以及生物領(lǐng)域中的常規(guī)操作實(shí)現(xiàn)。
[0016]實(shí)施例1通過RACE技術(shù)克隆PeARFl 7.7基因
以南林895楊初生不定根為材料，采用常規(guī)方法提取符合使用要求的cDNA、RNA。使用Oligo 6設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增7基因短片段，其中，/^4^77.7短片段正向引物為:5’ -AGGGCAAAGTGAAGGTAGAG-3’，PeARF17.7短片段反向引物為:5’ -GTAGGAGGAAGTCAGTGAAAGT-3’。高保真 PCR 反應(yīng)體系如下:10XLA PCR Buffer(Mg2+ free) 5.0 μ I ；2.5mM dNTP Mixture 8.0 μ I ；25mM Mg2+ 5.0 μ I ；LA Taq DNAPolymerase (5U/μ I) 0.5 μ I ;正向引物(10 μ Μ) 2μ1;反向引物(10 μ Μ) 2μ1;模板(895 楊 cDNA) I μ I ;加無菌 ddH20 補(bǔ)足 50 μ I。反應(yīng)程序:預(yù)變性 94°C 3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，獲得的7基因短片段序列如SEQ ID N0.3所示。
[0017]依據(jù)上述I基因短片段序列設(shè)計(jì)3’末端的RACE引物，進(jìn)行3’ RACE,獲得3’ cDNA末端片段，克隆入T-載體，對(duì)插入片段進(jìn)行PCR篩選后進(jìn)行測(cè)序，Blast確認(rèn)上述片段與其它植物相關(guān)的基因同源。以相同的方法，根據(jù)獲得的正確的3’ cDNA末端片段序列設(shè)計(jì)5’末端的RACE引物，進(jìn)行5’ RACE，獲得5’ cDNA末端片段，克隆入T-載體，對(duì)插入片段進(jìn)行PCR篩選后進(jìn)行測(cè)序。
[0018]3，RACE 正向引物:3’ RACE gene-spec i f i c outer primer:5’-AGGGCMAGTGAAGGTAGAGGAG-3’，3’ RACE gene specific inner primer:5’-GATCTMCTAATTCAACTATGGGGCACACG-3’； 3’ RACE Outer Primer: 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’，3’ RACE Inner Primer: 5’-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3’ ； 5’ RACEOuter Primer:5’-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’，5’ RACE Inner Primer:5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3’ ； 5’ RACE gene-specific outer primer:5’-AGTAGGACATGCTTCAACAGGTG-3’，5’ RACE gene specific inner primer:5' -ACAGGTGAAGCTCTTTGGCATTGGGCAT-3’。
[0019](1)3，RACE 反應(yīng)
I)反轉(zhuǎn)錄，將以下成分加入到一個(gè)置于冰上的RNase-free的小離心管中:lyg TotalRNA,4μ L dNTP Μ?χ,2μ L 3’ RACE Adapter,2y L 10X RT Buffer, I μ L RNase Inhibitor,IuL M-MLV Reverse Transcriptase, Nuclease-free Water 補(bǔ)齊 20μL。輕輕混勻，短暫離心，42°C溫育Ih ;進(jìn)入PCR步驟，或_20°C保存反應(yīng)物。
[0020]2)3’ RACE 巢式 PCR
反應(yīng)體系:0uter 3’ RACE Component:5.0 μ L 10XLA PCR BufferCMg2+ Free), 5.0uLMgCl2C25mM), 8.0uL dNTP Mixtur`eCeach 2.5mM), 2.0 μ L 3’ RACE gene-specific outerprimer,2.0 μ L 3' RACE Outer Primer (10 μ M),I μ L RT reaction product,0.5 μ LTakaRa LA Taq (5U/ μ L), 26.5 μ L Nuclease-free Water, Total volume50liLo Inner 3’RACE Component:5.0μ L 10XLA PCR Buffer (Mg2+ Free), 5.0μ L MgCl2 (25mM),8.0μ LdNTP Mixture (each 2.5mM),2.0 μ L 3' RACE gene specific inner primer,2.0 μ L 3'RACE Inner Primer (10 μ M),I μ L Outer 3’ RACE PCR product,0.5 μ L TakaRa LA Taq(5U/ μ L), 26.5 μ L Nuclease-free Water, Total volume50uL。
[0021]反應(yīng)程序:94°C,3min;94°C，30sec，60 °C，30sec，72 °C，1.5min, 35cycles ；72°C,7min。
[0022]3)純化片段與克隆載體的連接反應(yīng):采用TaKaRa公司的pMD19_T simple Vetor克隆目的DNA分子，參考說明書，連接反應(yīng)體系與程序稍有改進(jìn)。反應(yīng)體系(5 μ L):2.2 μ L純化回收的 PCR 產(chǎn)物，0.3μ L pMD-19 Simple Vector, 2.5μ L Solution I。反應(yīng)條件:16 °C2min ;4°C 過夜。
[0023]4)大腸桿菌轉(zhuǎn)化:將新鮮制備或_70°C凍存的大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化；取5 μ L純化片段與克隆載體的連接產(chǎn)物，加入到100 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，并輕輕混勻，冰浴30min左右；42°C水浴中熱擊90sec，迅速置于冰上3_5min ;加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，370C &100rmp搖菌Ih ；4000rmp離心3min，吸掉上層800 μ L培養(yǎng)基，混勻剩余菌液；將菌液涂抹于含有Amp的LB篩選培養(yǎng)板上，37 °C倒置培養(yǎng)過夜。[0024]5)陽性克隆篩選及測(cè)序分析:從篩選培養(yǎng)板上挑選單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C&250rmp搖菌過夜；直接以培養(yǎng)過夜的菌液為模板進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(20.0μ L):2.0μ L 10XPCR BufferCMg2+ free), 1.2μ L MgCl2 (25mM), 1.6μ L dNTPMixture (each 2.5mM),1.0 μ L 3’ RACE gene specific inner primer (10 μ M),1.0 μ L3’ RACE Inner Primer (10 μ M), 1.0 μ L 菌液，0.2 μ L rTaq, 12.0 μ L Mill1-Q Water0 反應(yīng)程序:94°C,3min ;94°C，30sec，60°C，30sec，72°C，lmin，28cycles ；72°C,7min0 菌液 PCR檢測(cè)為陽性的克隆送英駿生物技術(shù)公司(上海)測(cè)序鑒定。
[0025](2)5，RACE 反應(yīng)
I) RNA 處理(RNA Processing)
CIP反應(yīng)，將如下成分加入到RNase-free的小離心管中:10 μ g Total RNA, 2 μ LIOX CIP buffer,2 μ L Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIP), Nuclease-freeWater補(bǔ)齊20 μ L。輕混勻，短暫離心；37°C溫育lh。加入以下試劑到CIP反應(yīng)離心管:15 μ L Ammonium Acetate Solution,115 μ L Nuclease-free Water,150 μ L acidphenol: chloroform。充分潤旋，室溫高速離心(蘭10000 g) 5min。轉(zhuǎn)移上層水相到一個(gè)新的離心管中，加入150yL氯仿，充分渦旋，室溫高速離心(蘭10000 g) 5min。轉(zhuǎn)移上層水相到一個(gè)新的離心管中，加入150 μ L異丙醇，充分潤旋,冰浴lOmin。最大轉(zhuǎn)速離心20min,用0.5mI預(yù)冷的70%乙醇沖洗沉淀,最大轉(zhuǎn)速離心5min,小心棄乙醇,氣干沉淀。以
11μ LNuclease-free Water重懸沉淀，即得CIP’ RNA,冰上放置進(jìn)一步用于TAP反應(yīng)，或者-20°C保存。TAP反應(yīng)，把以下成分加入到一個(gè)RNase-free的小離心管中:5 μ L CIP’ dRNA (from f above), IuL 10X TAP buffer, 2 μ L Tobacco Acid PyrophosphataseCTAP),2 μ L Nuclease-free Water。輕輕混勻，短暫離心，37°C溫育 lh,即得 CIP/TAP-treatedRNA ;進(jìn)入接頭連接步驟，或_20°C保存反應(yīng)物。5’ RACE接頭連接，把以下成分加入到一個(gè)RNase-free 的小離心管中:2 μ L CIP/TAP-treated RNA, I μ L 5，RACE Adapter, I μ L 10XRNA Ligase Buffer, 2 μ L T4 RNA Ligase (2.5U/ μ L), 4 μ L Nuclease-free Water0 輕輕混勻，短暫離心，37°C溫育Ih,即得Ligated RNA ;進(jìn)入反轉(zhuǎn)錄步驟,或_20°C保存反應(yīng)物。
[0026]2)反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription):將以下成分加入到一個(gè)置于冰上的RNase-free 的小離心管中；2 μ L Ligated RNA, 4 μ L dNTP Mix, 2 μ L Random Decamers,
2μ L 10X RT Buffer,I μ L RNase Inhibitor,I μ L M-MLV Reverse Transcriptase,Nuclease-free Water 補(bǔ)齊 20μL。輕輕混勻，短暫離心；42°C 溫育 lh,即得 RT reaction ；進(jìn)入PCR步驟，或_20°C保存反應(yīng)物。
[0027]3) 5’ RACE巢式PCR:反應(yīng)體系、反應(yīng)條件與3’ RACE的巢式PCR —致。
[0028]4) PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，操作與3’ RACE克隆一致，獲得基因序列片段。Blast確認(rèn)該片段與擬南芥基因高度同源。
[0029]采用BioEdit軟件對(duì)3’ RACE和5’ RACE序列進(jìn)行比對(duì)拼接，并使用 FGENESH (http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php7topic =fgen)予頁測(cè)其閱讀框。根據(jù)基因全長序列設(shè)計(jì)引物(擴(kuò)增子包含起始密碼子及終止密碼子)，再次進(jìn)行PeARF17.7基因的全長擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證。其中，PeARF17.1 ORF正向引物為:5’-ATGCCGCAACTGACGGAGCTCAGC-3’，PeARF17.1 ORF 反向引物為:5’ -TCAAGTAGGACATGCTTCAACAGGT-3’ ；高保真 PCR 反應(yīng)體系如下:10 X LA PCR Buffer(Mg2+ free) 5.0 μ I ；2.5mM dNTP Mixture 8.0 μ I ；25mM Mg2+ 5.0 μ I ；LA Taq DNAPolymerase (5U/μ I) 0.5 μ I ;正向引物(10 μ Μ) 2μ1;反向引物(10 μ Μ) 2μ1;模板(895 楊 cDNA) I μ I ;加無菌 ddH20 補(bǔ)足 50 μ I。反應(yīng)程序:預(yù)變性 94°C 3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0030]最終獲得基因全長cDNA序列為2178bp，包含一個(gè)1779bp的完整閱讀框，命名為PeARF17.1基因，序列如SEQ ID N0.1所示，其所編譯表達(dá)蛋白序列如SEQ ID N0.2所示。
[0031]實(shí)施例2 PeARF17.1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建
利用通路克隆技術(shù)構(gòu)建I基因的過量表達(dá)載體。使用特異PCR引物(實(shí)施例1飽PeARF17.1 ORF引物)，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將/?他？77.1基因ORF構(gòu)建到入門載體。入門載體為 pCRTM8/GW/T0P0? vector (Invitrogen)。反應(yīng)體系為:Fresh PCRproduct (purified) 80ng ；Salt solution 0.5 μ I ；pCR?8/Gff/T0P0? vector 0.5μ1;加無菌ddH20補(bǔ)足3μ I。反應(yīng)程序?yàn)?22°C反應(yīng)2h。
[0032]從篩選培養(yǎng)板上挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證，帶I基因的入門載體與植物表達(dá)載體PH35GS進(jìn)行LR反應(yīng)。載體質(zhì)粒如圖1所示。反應(yīng)體系為:linearized entry clone 50ng ；purified destination vector 75ng；LR Clonase
Π enzyme mix 0.5 μ I ;加 TE (pH 8.0)補(bǔ)足 2.5 μ I ;。反應(yīng)條件:25°C 2_3h。經(jīng) LR 反應(yīng)后PeARF17.1基因?qū)胫参锉磉_(dá)載體pH35GS中，在I基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子P35S，它能使I基因在楊樹體內(nèi)高效表達(dá)?灰PeARFl7.1基因的3’端組裝了強(qiáng)終止子NOS，可有效終止7.1基因的轉(zhuǎn)錄；在載體質(zhì)粒上組裝HPT基因表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選標(biāo)記，可以用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選；在載體質(zhì)粒組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的7.1基因表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因HPT整合至楊樹受體細(xì)胞染色體中。通過PCR檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)過量表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pH35GS-PeARF17.1，該基因位于啟動(dòng)`子P35S之后，在啟動(dòng)子P35S的驅(qū)動(dòng)下，I可在楊樹體內(nèi)高效表達(dá)。
[0033]實(shí)施例3 PeARF17.1基因的遺傳轉(zhuǎn)化
通過液氮凍融法將所構(gòu)建的pH35GS-PeARF17.1過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Invitrogen),通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將7基因轉(zhuǎn)入楊樹。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1~5所不，圖1是植物表達(dá)載體PH35GS的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 % PeARF17.1基因在楊樹不定根發(fā)生發(fā)育過程中的表達(dá)模式；圖3為過量表達(dá)I的轉(zhuǎn)基因楊的分子檢測(cè)；圖4為過量表達(dá)PeARF17.1的轉(zhuǎn)基因楊與未轉(zhuǎn)基因楊的整體形態(tài)比較，圖中，左邊為轉(zhuǎn)基因楊，右邊為未轉(zhuǎn)基因楊；圖5為過量表達(dá)I的轉(zhuǎn)基因楊與未轉(zhuǎn)基因楊根系比較，圖中，左邊為轉(zhuǎn)基因楊，右邊為未轉(zhuǎn)基因楊。從結(jié)果可以明顯得出，過量表達(dá)I的轉(zhuǎn)基因楊無明顯主干，叢生狀態(tài)，根莖結(jié)合部扁平，不定根數(shù)顯著增多，說明7.1基因是調(diào)控楊樹生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在林木基因工程領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。
【權(quán)利要求】
1.一種調(diào)控楊樹生長發(fā)育的生長素響應(yīng)因子基因7，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因7.1的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于:所述載體在7^4^27.1基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子P35S。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于:所述載體在7^4^27.1基因的3’端組裝有強(qiáng)終止子NOS。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于:所述載體組裝HPT基因表達(dá)盒，所述HPT基因表達(dá)盒作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選標(biāo)記，用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于:所述載體組裝有能促使組裝于其間的PeARF17.1基因表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因HPT整合至楊樹受體細(xì)胞染色體中的LB和RB序列。
7.含有權(quán)利要求1所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因7.1的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因2在調(diào)控楊樹生長發(fā)育過程中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的楊樹生長素響應(yīng)因子基因7.1的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。`
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK103865952SQ201410067980
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】胥猛, 楊春霞, 黃敏仁 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)