一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其應(yīng)用。本發(fā)明先設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增獲得ε毒素基因片段克隆到pMD18-T?Vector載體后，選取陽性重組子，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌株，成功構(gòu)建重組菌株BL21(DE3)-ε。最后將制取好的ε毒素蛋白與氫氧化鋁佐劑以體積比為9：1的比例進(jìn)行乳化，加入0.01%的硫柳汞，即得產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗，具有易于工業(yè)化生產(chǎn)，操作簡單，安全性好等優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗可應(yīng)用在因預(yù)防因D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羔羊、綿羊、山羊、犢牛以及灰鼠等動(dòng)物的致死性腸道疾病。
【專利說明】—種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
(二)發(fā)明背景
[0002]產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),也稱魏氏梭菌,是一種廣泛分布于自然界和動(dòng)物腸道中的條件性致病菌。根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生外毒素(主要為α、β、ε、t )的種類差別，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成A、B、C、D、E五種類型。ε毒素為B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生，可導(dǎo)致山羊、綿羊等動(dòng)物的致死性腸道疾病，對(duì)畜牧業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的編碼基因etx位于質(zhì)粒上，etx基因編碼的蛋白ε毒素前體在分泌初期是無毒性的，通過蛋白酶去除毒素前體N端的13個(gè)氨基酸和C端22個(gè)氨基酸后成為有活性的成熟肽，成熟肽分子質(zhì)量為32ku。該毒素是致死性毒素，其毒力僅次于肉毒素和破傷風(fēng)毒素，能在小鼠的任意腸段被吸收。ε毒素發(fā)揮作用時(shí)首先可以使大腦、腎臟和小腸中的血管通透性增高，多種組織器官發(fā)生充血和水腫，死于腸毒血癥的羔羊也可發(fā)生腎臟壞死。這種毒素可以通過血腦屏障在大腦中蓄積，從而提高了腦血管通透性并導(dǎo)致外周血管水腫，中毒后發(fā)生腸毒血癥的動(dòng)物末期會(huì)有一些神經(jīng)癥狀，如角弓反張、驚厥、瀕死期掙扎等。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)病機(jī)理，利用分子生物學(xué)技術(shù)，獲得ε毒素的保護(hù)性抗原基因片段，研制出ε毒素基因工程疫苗；本發(fā)明所提供的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗更加安全穩(wěn)定、`應(yīng)用方便、免疫力強(qiáng)、無毒副作用，能有效預(yù)防D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的羔羊、綿羊、山羊、牛(犢牛)以及灰鼠等動(dòng)物的致死性腸道疾病——腸毒血癥，其中綿羊的腸毒血癥也叫軟腎病，各種年齡的綿羊都可發(fā)生。
[0005]—種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗,是將產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白與氫氧化鋁佐劑以體積比為9:1的比例進(jìn)行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。
[0006]所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的制備步驟如下:
[0007]I)設(shè)計(jì)引物
[0008]根據(jù)Genebank上已經(jīng)提交的ε毒素基因序列(登錄號(hào):Μ95206)擴(kuò)增ε毒素部分特異性基因片段，設(shè)計(jì)引物:primerl和primer2,并分別加入Ecorl和Xhol酶切位點(diǎn)；
[0009]primerl:5’ -ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3’Ecorl
[0010]primer2:5’ -ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3’Xhol
[0011]2)制備模板和PCR擴(kuò)增目的基因
[0012]用接種環(huán)挑取D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種，接種于一個(gè)血平板培養(yǎng)基上，37°C厭氧培養(yǎng)36h;取單個(gè)菌落接種于一個(gè)含7-8毫升硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)菌液提取DNA模板；PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013]3)將ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector載體
[0014]將步驟2)中回收的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T Vector，將克隆產(chǎn)物與ToplO感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選重組轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒PMD18-T- ε ;經(jīng)酶切測序確定陽性重組質(zhì)粒 pMD18-T-ε ；
[0015]4)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a_ ε
[0016]將陽性重組質(zhì)粒pMD18-T- ε與表達(dá)載體pet28a雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶和pet28a線性載體；將回收產(chǎn)物與pet28a線性載體連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a_ ε ;將PET28a_ ε與BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到重組菌株BL21(DE3)_ ε ；
[0017]5) ε毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化
[0018]用0.1mM的IPTG，37°C，對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)8h，經(jīng)N1-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化柱純化得到ε毒素蛋白。
[0019]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0020]I)設(shè)計(jì)引物
[0021]根據(jù)Genebank上已經(jīng)提交的ε毒素基因序列`(登錄號(hào):Μ95206)擴(kuò)增ε毒素部分特異性基因片段，設(shè)計(jì)引物:primerl和primer2,并分別加入Ecorl和Xhol酶切位點(diǎn)；
[0022]primerl:5’ -ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3’Ecorl
[0023]primer2:5’ -ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3’Xhol
[0024]2)制備模板和PCR擴(kuò)增目的基因
[0025]用接種環(huán)挑取D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種，接種于一個(gè)血平板培養(yǎng)基上，37°C厭氧培養(yǎng)36h ;取單個(gè)菌落接種于一個(gè)含7-8毫升硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)菌液提取DNA模板；PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0026]3)將ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector載體
[0027]將步驟2)中回收的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T Vector，將克隆產(chǎn)物與ToplO感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選重組轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒PMD18-T- ε ;經(jīng)酶切測序確定陽性重組質(zhì)粒 pMD18-T-ε ；
[0028]4)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a_ ε
[0029]將陽性重組質(zhì)粒pMD18-T- ε與表達(dá)載體pet28a雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶和pet28a線性載體；將回收產(chǎn)物與pet28a線性載體連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a_ ε ;將PET28a_ ε與BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到重組菌株BL21(DE3)_ ε ；
[0030]5) ε毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化
[0031]用0.1mM的IPTG，37°C，對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)8h，經(jīng)N1-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化柱純化得到ε毒素蛋白。
[0032]6)將產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白與氫氧化鋁佐劑以體積比為9:1的比例進(jìn)行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。[0033]本發(fā)明還涉及產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的應(yīng)用在預(yù)防因D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的牛和羊腸毒血癥中的應(yīng)用。在針對(duì)羊免疫時(shí)，4ml/只，皮下注射。在針對(duì)犢牛免疫時(shí)，Iml/頭，肌肉注射。
[0034]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0035]本發(fā)明所提供的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗其更加安全穩(wěn)定、應(yīng)用方便、免疫力強(qiáng)、無毒副作用，并且能避免疫苗濃縮、誘導(dǎo)免疫持續(xù)時(shí)間短等問題，能有效預(yù)防D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的羔羊、綿羊、山羊、犢牛以及灰鼠等動(dòng)物的致死性腸道疾病——腸毒血癥，其中綿羊的腸毒血癥也叫軟腎病，各種年齡的綿羊都可發(fā)生。同時(shí)，與以往的研究相比，表達(dá)量提高了約11%，而且蛋白幾乎全部以包涵體形式存在，純度高，表達(dá)量大。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1是本發(fā)明目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，說明PCR成功擴(kuò)增出900bp左右的ε
毒素基因。
[0037]圖2是本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白SDS-PAGE電泳圖，說明ε毒素蛋白經(jīng)過純化，SDS-PAGE電泳分析在相應(yīng)位置(38kD)出現(xiàn)明顯條帶，表明蛋白成功得到了純化。
[0038]圖3是本發(fā)明ε毒素表達(dá)蛋白的Western blot檢測結(jié)果圖，結(jié)果顯示目的蛋白能與陽性抗體發(fā)生反應(yīng)，在38KD處有一明顯的蛋白印記帶，說明表達(dá)的ε毒素蛋白具有良好的特異性。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合實(shí)施例`來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。在實(shí)施例中涉及的所有培養(yǎng)基和分子生物學(xué)操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0040]實(shí)施例1:產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的表達(dá)、純化
[0041]1、設(shè)計(jì)引物
[0042]根據(jù)Genebank上已經(jīng)提父的ε毒素基因序列(登錄號(hào):Μ95206，其序列如Seq IDΝο:1所示)擴(kuò)增ε毒素部分特異性基因片段,設(shè)計(jì)引物:primerl和primer2,并分別加入Ecorl和Xhol酶切位點(diǎn)；
[0043]primerl:5，-ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3，Ecorl 其序列如 Seq ID No:3所示
[0044]primer2:5’-ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3’Xhol 其序列如 Seq ID No:4所示
[0045]2、制備模板
[0046]用接種環(huán)挑取D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于一個(gè)血平板培養(yǎng)基(100毫升蒸餾水、I克葡萄糖和3.8克豆瓊脂粉滅菌后，加入5毫升綿羊血分裝到六個(gè)血平板上)上，37°C厭氧(88% N2,7% H2,5% CO2)培養(yǎng)36h。取單個(gè)菌落接種于一個(gè)含7_8毫升硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FT)(培養(yǎng)基成分通用)的試管內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng)12h，取I~5ml的培養(yǎng)菌液用DNA提取試劑盒(大連寶生物公司)提取DNA模板。
[0047]3、PCR擴(kuò)增與回收目的基因
[0048](I)擴(kuò)增目的基因[0049]PCR 反應(yīng)體系(25ul):1.0ul 的模版 DNA，10XPCR buffer (Mg2+free) 2.5ul, MgCl2(2.5mmol/L)2ul,dNTP (2.5mmol/L) 1.3ul，上下游引物(25ymol/L)各 lul，Taq DNA 聚合酶(5U/y L) 0.2ul ;最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25ul。
[0050]PCR 反應(yīng)程序:94°C 5min,94°C lmin,54°C lmin,72°C 70s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后在72°C中延伸 lOmin。
[0051](2)回收目的基因條帶
[0052]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，DNA凝膠回收試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)回收目的基因條帶，具體步驟如下:
[0053]①在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的片段部分的凝膠，盡量減小凝膠的體積，提高DNA的回收率。
[0054]②切碎凝膠塊，以提高凝膠的回收率，稱量凝膠塊的重量，計(jì)算凝膠塊的體積，以Img=Iul 計(jì)算。
[0055]③向凝膠塊中加入與凝膠塊等體積的膠塊融化液DR-1 buffer。
[0056]④均勻混合后，75°C加熱融化膠塊，此時(shí)間斷震蕩混合，使膠塊充分融化6-10min。
[0057]⑤向上述膠塊融化液中加入步驟③DR-1 bufferl/2體積量的DR-1I buffer,均勻混合；
[0058]⑥將上述得到的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心Imin,棄去濾液。
[0059]⑦再將500ul的`RinseA加入步驟⑥處理后的吸附柱中，12000rpm離心30s,棄去濾液。
[0060]⑧再將700ulRinseB加入步驟⑦處理后的吸附柱中，12000rpm離心30s,棄去濾液。
[0061]⑨再將700ulRinseB加入步驟⑧處理后的吸附柱中，12000rpm離心30s,棄去濾液。
[0062]⑩將吸附柱安置于一個(gè)1.5ml的離心管上，在吸附柱膜的中央處加入25ul的滅菌蒸懼水，室溫靜置lmin, 12000rpm離心Imin,洗脫目的DNA。
[0063](3)將ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector載體
[0064]將步驟(2)中洗脫的目的DNA與pMD18_T Vector (購自北京天根生化科技有限公司)混合，體系為:pMD18-T Vectorlul,洗脫的目的 DNA3ul, ddH201ul, solution I5ul,混合后于16°C連接5-7h。將連接產(chǎn)物與ToplO感受態(tài)細(xì)胞(購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選重組轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒。
[0065]所述的將連接產(chǎn)物與ToplO感受態(tài)細(xì)胞混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化的具體步驟如下:
[0066]①取50ul冰浴上融化的ToplO感受態(tài)細(xì)胞置于離心管中，加入連接產(chǎn)物(洗脫的目的DNA與pMD18-T Vector的連接產(chǎn)物)10ul，輕輕混勻，在冰浴中放置30min。
[0067]②42°C水浴中熱激30s，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中2min，該過程勿搖動(dòng)離心管。
[0068]③向離心管中加入500ul無菌的LB液體培養(yǎng)基(普通液體培養(yǎng)基)(每100ml LB液體培養(yǎng)基組分為:Tryptonelml, Yeast extract0.5ml 和 Nacllml),混勻后置于 37°C，200r/min培養(yǎng)Ih。
[0069]所述的篩選重組轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒，具體步驟如下:[0070]吸取上步驟中200ul已經(jīng)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞溶液加到含有100ug/ml氨芐抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基(普通瓊脂培養(yǎng)基)(每100ml LB瓊脂培養(yǎng)基組分=Tryptonelml，Yeastextract0.5ml, Nacllml, 1.5g瓊脂粉)上,將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于37°C至液體被吸收，倒置平板，37°C過夜培養(yǎng)。37°C過夜培養(yǎng)的平板上無菌操作挑取單菌落接種于含IOOug/ml氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基增菌，37°C振蕩培養(yǎng)12_14h，按照DNA凝膠回收試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)說明書提取質(zhì)粒，具體步驟如下:
[0071]①柱平衡步驟:向吸附柱CP3中加入500 μ I的平衡液BL，12000rpm,離心I分鐘，
倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0072]②取5ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12000rpm，離心I
分鐘，盡量吸除上清。
[0073]③再向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ I溶液Ρ1，使用移液器徹底懸浮沉淀。
[0074]④再向離心管中加入250 μ I溶液Ρ2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次使其充分裂解。
[0075]⑤再向離心管中加入350 μ I溶液Ρ3，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm，離心10分鐘，此時(shí)離心管底部出現(xiàn)沉淀。
[0076]⑥將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12000rpm，離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0077]⑦再向吸附柱CP3中加入600 μ I漂洗液PW，12000rpm,離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。`
[0078]⑧重復(fù)操作步驟⑦。
[0079]⑨將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm，離心2分鐘。
[0080]⑩再將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100 μ I洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2分鐘，12000rpm,離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
[0081 ] 所述的平衡液BL、溶液P1、溶液P2、溶液P3、漂洗液PW、吸附柱CP3、洗脫緩沖液EB均為質(zhì)粒提取試劑盒中的組成內(nèi)容。
[0082]將洗脫得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶(Ecorl和Xhol) 37°C酶切3h，酶切體系IOul:限制性內(nèi)切酶各0.5ul，質(zhì)粒6ul，10Xbufferlul，ddH201ul。酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠觀察酶切片斷，確定陽性重組質(zhì)粒，送金斯特工程有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。
[0083]4、構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a_ ε
[0084]將測序結(jié)果為陽性的ε克隆重組質(zhì)粒與表達(dá)載體pET_28a(購自北京天根生化科技有限公司)均用Ecorl和Xhol雙酶切，37°C孵育3h。酶切體系50ul:限制性內(nèi)切酶(Ecorl和 Xhol)各 2.5ul,質(zhì)粒 30ul, 10Xbuffer5ul, ddH2010ul。
[0085]酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶和pET28a線性載體，具體回收步驟同DNA凝膠回收試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)說明。
[0086]將回收產(chǎn)物與pET28a線性載體連接，體系為:pET28a線性載體lul，回收產(chǎn)物3ul, ddH201ul, solution I5ul，混合后于 16°C連接 5_7h。將連接產(chǎn)物與 BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞(購自北京艾比根生物技術(shù)有限公司)(原核表達(dá)宿主)混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選重組轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒，具體步驟如下:
[0087]①取冰浴上融化BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞50ul，加入連接產(chǎn)物(回收產(chǎn)物與pET28a線性載體連接產(chǎn)物)10ul，輕輕混勻，在冰浴中放置30min。
[0088]②42°C水浴中熱激45s，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中2min，該過程不要搖動(dòng)離心管。
[0089]③向離心管中加入500ul無菌的LB液體培養(yǎng)基，混勻后置于37°C，200轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)Ih0
[0090]④吸取200ul已轉(zhuǎn)化了的感受態(tài)細(xì)胞加到含有100ug/ml Kana抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于37°C至液體被吸收，倒置平板，37°C過夜培養(yǎng)。37°C過夜培養(yǎng)的平板上無菌操作挑取單菌落接種于含100ug/ml Kana抗生素的LB液體培養(yǎng)基增菌，37 °C振蕩培養(yǎng)12-14h，得到重組菌株。
[0091]按照質(zhì)粒提取試劑盒(泰安博傲生物技術(shù)公司)說明提取質(zhì)粒。提取得到的質(zhì)粒DNA用Ecorl和Xhol限制性內(nèi)切酶37°C酶切3h，酶切體系IOul:限制性內(nèi)切酶各0.5ul，質(zhì)粒6ul，10Xbufferlul，ddH202ul。酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠觀察酶切片斷，確定陽性重組質(zhì)粒(pET28a_e )，送金斯特工程有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。Blast在線比對(duì)所測ε毒素全基因序列與GenBank已發(fā)表相應(yīng)序列的同源性在98%以上。
[0092]將上述經(jīng)酶切測序確定已轉(zhuǎn)入陽性重組質(zhì)粒pET28a_e的重組菌株命為BL21(DE3)- ε。
[0093]5、ε毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及特異性檢測
[0094]將測序結(jié)果為陽性質(zhì)粒的菌液(陽性重組菌株BL21(DE3))接種于含100ug/mlKana抗生素(泰安飛揚(yáng)生物`科技有限公司)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD值達(dá)到0.6時(shí)，添加終濃度為0.1mM的IPTG，37°C，誘導(dǎo)表達(dá)8h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心收集沉淀，加入0.01M PBS溶液重懸，超聲裂解細(xì)胞(超聲裂解程序:ls，ls，20min, 25°C )，裂解完全后菌液離心(8000rpm/min，15min，4°C )，分離上清I備用。沉淀用0.01M PBS溶液漂洗2次，離心棄上清2，用尿素溶液(北京中生瑞泰科技有限公司)重懸沉淀，重懸后的沉淀與首次分離得到的上清I分別通過N1-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)純化，純化后樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并通過Western blot檢測表達(dá)蛋白的特異性。
[0095]實(shí)施例2: ε毒素蛋白表達(dá)含量及其毒性測定
[0096]用CS29000型薄層凝膠掃描儀(上?？瀑R生化科技有限公司)在560nm波長下的吸收值，測得表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的32.53%。
[0097]將重組菌株BL21(DE3)_ ε的培養(yǎng)上清(即上清I )、菌體(重組菌株BL21 (DE3) - ε )及菌體裂解物(步驟5中裂解完全后的菌液)以及產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒D8346培養(yǎng)上清分別接種在卵黃瓊脂平板(稱取瓊脂培養(yǎng)基成品50g，加入去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，1210C滅菌15min，冷至50°C左右，每IOOmL培養(yǎng)基加入50%的無菌卵黃鹽水懸10-15mL，搖勻立即傾注六個(gè)平皿，凝固)上，36°C厭氧培養(yǎng)24h，BL21(DE3)- ε的培養(yǎng)上清、菌體及菌體裂解物均不出現(xiàn)特征性混濁環(huán)，而產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒D8346培養(yǎng)上清出現(xiàn)乳白色混濁環(huán)，說明BL21(DE3)_e已不具備ε毒素的磷脂酶C活性；經(jīng)腹腔注射BL21 (DE3) - ε的balb/c小白鼠(18_20g，10只)，3周后全部存活，每只小白鼠均無臨床癥狀。
[0098]所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒D8346培養(yǎng)上清制備方法:用接種環(huán)挑取D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種NCTC8346接種于一個(gè)血平板培養(yǎng)基(100毫升蒸餾水、I克葡萄糖和3.8克豆瓊脂粉滅菌后，加入5毫升綿羊血分裝到六個(gè)血平板上)上，37°C厭氧(88% N2,7% H2,5% CO2)培養(yǎng)36h。取單個(gè)菌落接種于一個(gè)含7-8毫升硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FT)(培養(yǎng)基成分通用)的試管內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng)12h，得到產(chǎn)氣莢膜梭菌D8346菌體培養(yǎng)液，12000rpm離心30s，取上清即得。
[0099]實(shí)施例3: ε毒素基因工程疫苗安全檢驗(yàn)
[0100](I)用體重250g_350g豚鼠3只，各皮下注射疫苗5毫升(可分兩個(gè)部位注射)，觀察十日，均健活。
[0101](2)用體重1.5-2千克的家兔4只，各肌肉注射疫苗5毫升，觀察10日，均健活，注射部位未發(fā)生壞死。
[0102]實(shí)施例4: ε毒素基因工程疫苗無菌檢驗(yàn)和硫柳汞含量測定
[0103]參照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2001年版)附錄301頁進(jìn)行，無菌生長。
[0104]參照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2001年版)附錄313頁進(jìn)行，符合《制品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定》(硫柳汞含量不超過0.01%)。
[0105]實(shí)施例5: ε毒素基因工程苗免疫劑量研究
[0106](I)取40kg左右健康易感羊18只，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各9只，實(shí)驗(yàn)組每只皮下注射2ml、4ml、6ml的ε毒素基因工程苗，每組3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組分別每只皮下注射2ml、4ml、6ml無菌生理鹽水，每組3個(gè)重復(fù)，21日`后，18只羊分別肌肉注射2ml D型產(chǎn)氣莢膜梭菌，觀察3-5日，對(duì)照組9只羊全部死亡，瀕死發(fā)生腹瀉，拉黃褐色水樣稀糞，解剖發(fā)現(xiàn)小腸充血、出血，肺臟出血、水腫。實(shí)驗(yàn)組9只羊中皮下注射2ml ε毒素基因工程疫苗的實(shí)驗(yàn)羊出現(xiàn)精神不振，日漸消瘦，約4日后死亡，皮下注射4ml、6ml ε毒素基因工程苗實(shí)驗(yàn)羊均未出現(xiàn)不良癥狀。4ml疫苗作為羊常規(guī)接種劑量。
[0107](2)取2月齡左右健康易感犢牛12頭，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各6頭，實(shí)驗(yàn)組每頭肌肉注射0.5ml、lml、2ml的ε毒素基因工程苗，每組2個(gè)重復(fù)，對(duì)照組分別每頭肌肉注射0.5ml、lml、2ml無菌生理鹽水，每組2個(gè)重復(fù)，21日后，12頭犢牛分別注射Iml D型產(chǎn)氣莢膜梭菌，觀察3-5日，對(duì)照組6頭犢牛全部死亡，剖檢表現(xiàn)急性腸炎，有深紅色腸內(nèi)容物，同時(shí)還有腸粘膜的壞死、出血和粘膜下層的充血。實(shí)驗(yàn)組6頭犢牛中肌肉注射
0.5ml ε毒素基因工程疫苗的實(shí)驗(yàn)犢牛出現(xiàn)精神不振，日漸消瘦，約7日后死亡，肌肉注射1ml,2ml ε毒素基因工程疫苗實(shí)驗(yàn)犢牛均未出現(xiàn)不良癥狀。Iml疫苗作為犢牛常規(guī)接種劑量。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗，其特征在于是將產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白與氫氧化鋁佐劑以體積比為9:1的比例進(jìn)行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到； 所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的制備步驟如下: 1)設(shè)計(jì)引物 根據(jù)Genebank上已經(jīng)提交的ε毒素基因序列(登錄號(hào):Μ95206)擴(kuò)增ε毒素部分特異性基因片段，設(shè)計(jì)引物:primerl和primer2,并分別加入Ecorl和Xhol酶切位點(diǎn)；
2.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)設(shè)計(jì)引物 根據(jù)Genebank上已經(jīng)提交的ε毒素基因序列(登錄號(hào):Μ95206)擴(kuò)增ε毒素部分特異性基因片段，設(shè)計(jì)引物:primerl和primer2,并分別加入Ecorl和Xhol酶切位點(diǎn)；
3.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因工程疫苗在預(yù)防因D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的牛和羊腸毒血癥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/33GK103830747SQ201410117381
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】柴同杰, 王葉 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)