一種偽狂犬病標準陽性血清的制備及其凍干保存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種偽狂犬病標準陽性血清的制備及其凍干保存方法。用PRV滅活病毒液免疫家兔2次后，再用PRV病毒液免疫1次家兔，采集血清；往血清中加入保護劑氯化鈉、海藻糖、谷氨酸單鈉、L-精氨酸，充分溶解后過濾除菌、分裝；將分裝好的血清裝入凍干機箱體內按1所示的凍干曲線凍干得到偽狂犬病標準陽性血清。通過本發(fā)明方法得到的偽狂犬病標準陽性血清PRV中和抗體效價在1:512以上，在2～8℃條件下保存60個月抗體效價保持不變，有很好的穩(wěn)定性，在疫苗外源病毒及特異性檢驗中能夠充分中和偽狂犬病毒，為偽狂犬病弱毒疫苗的質量檢驗提供了很好的技術支撐。
【專利說明】一種偽狂犬病標準陽性血清的制備及其凍干保存方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及動物用病毒活疫苗檢驗領域，尤其涉及一種偽狂犬病標準陽性血清的制備及其凍干保存方法。
【背景技術】
[0002]豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的一種急性傳染病，其主要臨床特征為成年豬呈隱性感染，妊娠母豬發(fā)生流產、死胎及呼吸道癥狀。低日齡仔豬感染后常出現(xiàn)發(fā)熱、拉稀，并伴隨明顯的神經(jīng)癥狀和呼吸困難。本病在豬群中傳播快、仔豬死亡率高，是豬場面臨的重大傳染病之一。我國是偽狂犬病流行廣泛的國家，目前已有多個省(市、區(qū))報道本病發(fā)生，已經(jīng)造成巨大的經(jīng)濟損失。
[0003]在豬偽狂犬病防制中，疫苗起著重要作用，由于弱毒活疫苗具有免疫劑量小、價格低廉的特點，所以使用范圍較滅活疫苗廣泛，尤其是用gE基因缺失毒株制備的活疫苗，豬群使用這種標記疫苗后，通過檢測gl或gE的抗體水平，可以區(qū)分疫苗抗體和野毒抗體，從而為豬場凈化偽狂犬病提供科學依據(jù)。保證疫苗的質量尤為重要，鑒別檢驗和外源病毒檢驗是動物活疫苗質量檢驗的重點之一，其目的是保證疫苗(或毒種)的純粹性、特異性，偽狂犬病活疫苗也不例外。《中華人民共和國生物制品規(guī)程》(2000年版)和《中華人民共和國獸藥典》(2010版3部)都要求對偽狂犬病活疫苗進行鑒別檢驗和外源病毒檢驗，但由于國內現(xiàn)有偽狂犬病標準陽性血清制備技術耗時長、成功率低、抗體效價低，導致在疫苗的鑒別檢驗和外源病毒檢驗中難以完全中和相對應的病毒，使疫苗的質量檢驗工作難以正常進行，給疫苗質量監(jiān)管留下了隱患，國外的偽狂犬病標準陽性血清采購困難且價格昂貴，加上檢驗需求量較大，所有為解決生產、檢驗需要，研發(fā)高效價偽狂犬病標準陽性血清的制備方法勢在必行。

【發(fā)明內容】
`
[0004]本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種高效價偽狂犬病標準陽性血清的制備及其凍干保存方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
[0006]一種偽狂犬病標準陽性血清的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)抗原免疫:在隔離飼養(yǎng)的清潔級家兔左側腹股溝皮下注射PRV滅活病毒液( 107 0TCID50/mL)2mL,間隔14日后在家兔左側腹股溝皮下加強免疫I次PRV滅活病毒液(107_°TCID5(l/mL)2mL，距第1次免疫28日后在家兔右側腹股溝皮下注射PRV病毒液( 105 0TCID50/mL) 2mL。
[0008]所述的清潔級家兔優(yōu)選為體重1.5~2kg的日本大耳白兔，對偽狂犬病、輪狀病毒病、豬瘟、細小病毒病、兔瘟抗原抗體呈陰性；所述的PRV優(yōu)選為保藏編號為CCTCC NO:V201114的豬偽狂犬病弱毒C株。
[0009](2)血清收獲:距第3次免疫后14日，收集血清。[0010]一種偽狂犬病標準陽性血清的凍干保存方法，包括以下步驟:
[0011](I)保護劑的配制及血清保存:按血清體積的1%、1%、0.1%、0.05%于血清中分別加入氯化鈉、海藻糖、谷氨酸單鈉、L-精氨酸，充分溶解后，用濾膜除菌，然后分裝；
[0012]所述的濾膜優(yōu)選為0.22 μ m的濾膜。
[0013](2)凍干(凍干曲線圖如圖1所示):將分裝好的血清裝入凍干機箱體內，在2~3小時內樣品由常溫降溫至_45°C，在此溫度下維持3~4個小時后，開始抽真空至10~20Pa后，再開始升溫，2小時內升至-10°C，之后以-10°C的升華溫度維持10~12小時，然后在I小時內提溫至0°C并維持2h，再在3小時內提溫至28°C并維持4~6小時后真空狀態(tài)下壓塞出箱。
[0014]一種偽狂犬病標準陽性血清的制備及其凍干保存方法，為分別使用上述方法制備偽狂犬病標準陽性血清并凍干保存。[0015]通過本發(fā)明的方法得到的偽狂犬病標準陽性血清PRV中和抗體效價在1:512以上，在2~8°C條件下保存60個月抗體效價保持不變。
[0016]本發(fā)明采用血清制備、血清凍干、抗體標定、疫苗外源病毒及特異性檢驗等一系列手段研究了標準陽性血清的制備方法、凍干保存方法，試驗結果表明，該免疫途徑及方式可以使家兔產生很高的偽狂犬抗體，并經(jīng)過凍干保存后保存時間長，有很好的穩(wěn)定性，在疫苗外源病毒及特異性檢驗中能夠充分中和偽狂犬病毒，為偽狂犬病弱毒疫苗的檢驗提供了很好的資源。
[0017]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0018](I)研究了標準陽性血清的制備方法、凍干保存方法，試驗結果表明，先免疫滅活病毒后再免疫活病毒的免疫方法和免疫途徑，能使家兔在免疫滅活病毒產生抗體保護后，在活病毒的刺激下而產生很高的偽狂犬病中和抗體效價，達到1:512。經(jīng)過凍干保存抗體效價沒有任何損失，偽狂犬病中和抗體效價依然維持在1:512，保存時間長，有很好的穩(wěn)定性。在疫苗外源病毒及特異性檢驗中能夠充分中和偽狂犬病毒，為偽狂犬病弱毒疫苗的質量檢驗提供了很好的技術支撐。
[0019](2)按血清比例將1%氯化鈉、1%海藻糖、0.1%谷氨酸單鈉、0.05%L_精氨酸溶于陽性血清中，用0.22μπι的濾膜除菌，然后采用相應的凍干曲線進行凍干；在2~8°C條件下保存60個月抗體效價保持不變。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是偽狂犬病標準陽性血清的凍干曲線圖；
[0021]圖2是偽狂犬病標準陽性血清制備工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0023]本發(fā)明偽狂犬病標準陽性血清制備工藝流程圖如圖2所示。
[0024]實施例1
[0025]1、血清的制備[0026]篩選體重1.5~2kg日本大耳白兔5只(清潔級)，經(jīng)PCR和ELISA檢測偽狂犬病、輪狀病毒病、豬瘟、細小病毒病、兔瘟抗原抗體均為陰性。每只家兔左側腹股溝皮下注射PRV(C株)滅活病毒液(107_°TCID5(l/mL) 2mL，間隔14日后每只家兔左側腹股溝皮下加強免疫I次PRV (C株)滅活病毒液(107_°TCID5(l/mL)2mL，距第1次免疫28日后每只家兔右側腹股溝皮下注射PRV (C株)病毒液(105_°TCID5(l/mL) 2mL，距第3次免疫后14日，即可將家兔頸動脈放血采血分離血清備用。其中，PRV (C株)為一株天然弱毒的豬偽狂犬病弱毒C株，保藏編號為:CCTCC NO:V201114 ;保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CHINA CENTERFOR TYPECULTURE COLLECTION (CCTCC);保藏地址:中國.武漢.武漢大學。
[0027]2、血清中和抗體效價檢測試驗
[0028]將采集到的兔血清用0.22 μ m的濾膜除菌，置56°C水浴滅活30分鐘。在細胞培養(yǎng)板各孔中加入50 μ L DMEM培養(yǎng)液，隨后在第I孔中加入待檢血清50 μ L，混合后，用微量移液器取出50 μ L，加入第2孔中，混勻后取出50 μ L再加入第3孔中，依次類推，直至第10孔，血清稀釋度即為1: 2、1:4、1:8……1:1024，每份待檢血清稀釋度作3個重復。將50 μ L含200個TCID5(i/0.1mLPRV病毒液加到不同稀釋度的血清孔中，37°C中和I小時。每血清孔中加入100 μ L經(jīng)胰酶消化分散的ΡΚ15細胞。每次試驗的每一塊板上設立病毒對照，先將200TCID50/0.1mL病毒液作10倍系列稀釋，取10°、10'10_2、10_34個稀釋度，每個稀釋度接種4孔，每孔100 μ L，然后每孔加入100 μ L細胞懸液。逐日觀察，記錄細胞病變和非病變孔數(shù)，觀察5日。病毒對照中0.2TCID50不引起細胞病變，陽性血清、陰性血清和正常細胞對照成立，測定結果有效，試驗條件成立。觀察后確定對細胞培養(yǎng)50%保護的血清最大稀釋度，計算中和抗體效價，采集到的兔血清的中和抗體效價為1:512。
[0029]3、血清的凍干
[0030]按血清體積的1%、1%、0.1%、0.05%于血清中分別加入氯化鈉、海藻糖、谷氨酸單鈉、L-精氨酸，充分溶解`后，用0.22 μ m的濾膜除菌，每瓶分裝2mL。將分裝好的血清裝入凍干機箱體內，在2小時內樣品由常溫緩慢降溫至-45°C，在此溫度下維持3個小時后，開始抽真空至18Pa后，開始升溫，2小時內升至-10°C，之后以-10°C的升華溫度維持11小時，然后在I小時內提溫至0°C并維持2h，再在3小時內提溫至28°C并維持5小時后真空狀態(tài)下壓塞出箱，凍干全程為29個小時。
[0031 ] 4、血清凍干后中和抗體效價檢測試驗
[0032]將無菌凍干待檢兔血清用不含血清的DMEM培養(yǎng)液還原至2mL，置56°C水浴滅活30分鐘。在細胞培養(yǎng)板各孔中加入50 μ L DMEM培養(yǎng)液，隨后在第I孔中加入待檢血清50 μ L，混合后，用微量移液器取出50 μ L，加入第2孔中，混勻后取出50 μ L再加入第3孔中，依次類推，直至第10孔，血清稀釋度即為1: 2、1:4、1:8……1:1024，每份待檢血清稀釋度作3個重復。將50 μ L含200個TCID5Q/0.1mLPRV病毒液加到不同稀釋度的血清孔中，37°C中和I小時。每血清孔中加入100 μ L經(jīng)胰酶消化分散的PK15細胞。每次試驗的每一塊板上設立病毒對照，先將200TCID5(i/0.1mL病毒液作10倍系列稀釋，取10°、10'10_2、10_34個稀釋度，每個稀釋度接種4孔，每孔100 μ L，然后每孔加入100 μ L細胞懸液。逐日觀察，記錄細胞病變和非病變孔數(shù)，觀察5日。病毒對照中0.2TCID50不引起細胞病變，陽性血清、陰性血清和正常細胞對照成立，測定結果有效，試驗條件成立。觀察后確定對細胞培養(yǎng)50%保護的血清最大稀釋度，計算中和抗體效價，凍干兔血清的中和抗體效價為1:512。[0033]5、鑒別檢驗試驗
[0034]將武漢中博生物股份有限公司所生產偽狂犬病活疫苗(Bartha_K61株)，用含2%的新生牛血清DMEM細胞培養(yǎng)液稀釋成200TCID5(i/0.lmL。取病毒稀釋液與陽性兔血清等量混勻，置37°C水浴中和作用I小時后，接種于已長成良好單層(棄去細胞培養(yǎng)液)的96孔ST細胞培養(yǎng)板，接種6孔，每孔0.2mL，同時設正常細胞對照和病毒對照各2孔。置37°C、含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察5日。病毒對照孔出現(xiàn)CPE，正常細胞對照孔和病毒中和孔均沒有產生CPE，說明制備的兔陽性血清可以用于偽狂犬病活疫苗的鑒別檢驗。
[0035]6、外源病毒檢驗試驗
[0036]取將武漢中博生物股份有限公司所生產偽狂犬病活疫苗(Bartha_K61株)，每瓶凍干疫苗加入無血清DMEM細胞培養(yǎng)液，稀釋成每1.0mL含10頭份，混合后與等量陽性兔血清37°C中和I小時后作為被檢檢品，用疫苗與兔血清混合液接種已長成良好單層VeiO、ST、MDBK細胞的細胞培養(yǎng)瓶各2瓶，每瓶至少1.0mL (含待檢疫苗制品至少I頭份)。接種細胞單層時，需37°C吸附lh，然后棄去接種物，用PBS洗滌細胞表面2次，再補加IOmL細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；處理的樣品同步接種ST細胞，接種瓶數(shù)、接種劑量、培養(yǎng)時間均同Vero、ST、MDBK細胞。另設I瓶ST正常細胞對照。將上述Vero、ST、MDBK細胞培養(yǎng)物凍融3次后，3000g/m離心10分鐘，分別再接種于相應的Veix)、ST、MDBK細胞單層各2瓶用于繼代，每瓶接種至少lmL，置37°C吸附Ih后，加入細胞維持液，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。ST細胞凍融后3000g/m離心10分鐘同步接種ST細胞，接種瓶數(shù)、接種劑量、培養(yǎng)時間均同Vero、ST、MDBK細胞。每次繼代均設立正常細胞對照。被檢樣品在每種細胞上的總培養(yǎng)時間應不少于14日。培養(yǎng)期間細胞培養(yǎng)物應至少繼代I次。最后一次繼代的細胞單層數(shù)量和面積、培養(yǎng)時間應符合熒光抗體檢查法、致細胞病變檢查法和紅細胞吸附性外源病毒檢驗的要求。培養(yǎng)期內，對細胞培養(yǎng)物進行常規(guī)檢查，培養(yǎng)物無細胞病變，培養(yǎng)結束時，將上述經(jīng)繼代細胞培養(yǎng)物凍融3次后按下述方法繼續(xù)檢驗。BVDV熒光抗體檢查選用MDBK細胞，PPV熒光抗體檢查選用Vero細胞，CSFV熒光抗體檢查選用ST細胞`。對每一種特定外源病毒的檢驗應包含三組細胞:(1)被檢樣品最后一次繼代細胞培養(yǎng)物；(2)被檢樣品最后一次繼代時設立的特定病毒陽性對照(BVDV Oregon C24V株接種MDBK細胞作為BVDV熒光抗體檢查的陽性對照，PPV NADL-2株同步接種ST細胞作為PPV熒光抗體檢查的陽性對照，CSFV Thiverval株接種ST細胞作為CSFV熒光抗體檢查的陽性對照)；(3)正常細胞對照。每組細胞單層(或同步接種)選擇24孔細胞培養(yǎng)板，每個樣品接種4孔，每孔接種0.5mL。以上細胞培養(yǎng)5~7日后，棄掉營養(yǎng)液，用PBS (pH7.2)洗滌2~3遍，晾干后用80%冷丙酮置2~8°C固定30分鐘，棄去固定液，自然干燥后以適宜的熒光抗體進行染色、鏡檢。檢查BVDV外源病毒時可選直接免疫熒光檢查法或間接免疫熒光檢查法，檢查PPV外源病毒時選擇間接免疫熒光檢查法，檢查CSFV外源病毒時選擇間接免疫熒光檢查法。陽性對照出現(xiàn)特異熒光，正常細胞無熒光，被檢樣品無熒光。結果顯示，試驗條件均成立，說明制備的兔陽性血清可以用于偽狂犬病活疫苗的外源病毒檢驗。
[0037]實施例2
[0038]1、血清的制備
[0039]篩選體重1.5~2kg日本大耳白兔10只(清潔級)，經(jīng)PCR和ELISA檢測偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬細小病毒病、兔瘟抗原抗體均為陰性。每只家兔左側腹股溝皮下注射PRV (C株)滅活病毒液(107_°TCID5(l/mL)2mL，間隔14日后每只家兔左側腹股溝皮下加強免疫I次PRV (C株)滅活病毒液(107_°TCID5(l/mL)2mL，距第1次免疫28日后每只家兔右側腹股溝皮下注射PRV (C株)病毒液(105_°TCID5(l/mL)2mL。距第3次免疫后15日，SP可將家兔頸動脈放血采血分離血清備用。
[0040]2、血清中和抗體效價檢測試驗
[0041]將采集到的兔血清用0.22 μ m的濾膜除菌，置56°C水浴滅活30分鐘。在細胞培養(yǎng)板各孔中加入50 μ L DMEM培養(yǎng)液，隨后在第I孔中加入待檢血清50 μ L，混合后，用微量移液器取出50 μ L，加入第2孔中，混勻后取出50 μ L再加入第3孔中，依次類推，直至第10孔，血清稀釋度即為1: 2、1:4、1:8……1:1024，每份待檢血清稀釋度作3個重復。將50 μ L含200個TCID5(i/0.1mLPRV病毒液加到不同稀釋度的血清孔中，37°C中和I小時。每血清孔中加入100 μ L經(jīng)胰酶消化分散的ΡΚ15細胞。每次試驗的每一塊板上設立病毒對照，先將200TCID50/0.1mL病毒液作10倍系列稀釋，取10°、10'10_2、10_34個稀釋度，每個稀釋度接種4孔，每孔100 μ L，然后每孔加入100 μ L細胞懸液。逐日觀察，記錄細胞病變和非病變孔數(shù)，觀察5日。病毒對照中0.2TCID50不引起細胞病變，陽性血清、陰性血清和正常細胞對照成立，測定結果有效，試驗條件成立。觀察后確定對細胞培養(yǎng)50%保護的血清最大稀釋度，計算中和抗體效價，采集到的兔血清的中和抗體效價為1:512。
[0042]3、血清的凍干
[0043]按血清體積比例將1%氯化鈉、1%海藻糖、0.1%谷氨酸單鈉、0.05%L_精氨酸溶于陽性血清中，用0.22 μ m的濾膜除菌，每瓶分裝2mL，將分裝好的血清裝入凍干機箱體內，在3小時內樣品由常溫緩慢降溫至_45°C，在此溫度下維持4個小時后，開始抽真空至15Pa后，在開始升溫，2小時內升至-10°C，之后以-10°C的升華溫度維持10小時，然后在I小時內提溫至(TC并維持2h，再在3小時內提溫至28°C并維持5小時后真空狀態(tài)下壓塞出箱，凍干全程為30個小時。`
[0044]4、凍干后的血清中和抗體效價檢測試驗
[0045]將無菌凍干待檢兔血清用不含血清的DMEM培養(yǎng)液還原至2mL，置56°C水浴滅活30分鐘。在細胞培養(yǎng)板各孔中加入50 μ L DMEM培養(yǎng)液，隨后在第I孔中加入待檢血清50 μ L，混合后，用微量移液器取出50 μ L，加入第2孔中，混勻后取出50 μ L再加入第3孔中，依次類推，直至第10孔(將混合液50 μ L)，血清稀釋度即為1:2、1:4、1:8……1:1024,每份待檢血清稀釋度作3個重復。將50 μ L含200個TCID5(l/0.1mLPRV病毒液加到不同稀釋度的血清孔中，37°C中和I小時。每血清孔中加入100 μ L經(jīng)胰酶消化分散的PK15細胞。每次試驗的每一塊板上設立病毒對照，先將200TCID5(i/0.1mL病毒液作10倍系列稀釋，取10°、10'10_2、10_34稀釋度，每個稀釋度接種4孔，每孔100 μ L，然后每孔加入100 μ L細胞懸液。逐日觀察，記錄細胞病變和非病變孔數(shù)，觀察5日。病毒對照中0.2TCID5(I不引起細胞病變，陽性血清、陰性血清和正常細胞對照成立，測定結果有效，試驗條件成立。觀察后確定對細胞培養(yǎng)50%保護的血清最大稀釋度，計算中和抗體效價，凍干兔血清的中和抗體效價為1:512。
[0046]5、鑒別檢驗試驗
[0047]將武漢中博生物股份有限公司所生產偽狂犬病活疫苗(Bartha_K61株)，用含2%的新生牛血清DMEM細胞培養(yǎng)液稀釋成200TCID5(i/0.lmL。取病毒稀釋液與陽性兔血清等量混勻，置37°C水浴中和作用I小時后，接種于已長成良好單層(棄去細胞培養(yǎng)液)的96孔ST細胞培養(yǎng)板，接種6孔，每孔0.2mL，同時設正常細胞對照和病毒對照各2孔。置37°C、含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察5日。病毒對照孔出現(xiàn)CPE，正常細胞對照孔和病毒中和孔均沒有產生CPE，說明制備的兔陽性血清可以用于偽狂犬病活疫苗的鑒別檢驗。
[0048]6、凍干血清的測試
[0049]將實施案例1、2凍干的血清、常規(guī)凍干的血清(將實施例1采集的血清定量分裝于中性玻璃瓶中，密封瓶口，貼上瓶簽用常溫進凍干機箱體內，I小時內將制品降至-42 V并維持2小時。I小時將制品從-42 °C升至-5 V并維持10小時。I小時將制品從_5 °C升至10°C并維持2小時；1小時將制品從10°C升至28°C并維持6小時，凍干結束)及未凍干的血清，置于2~8°C條件下保存，不同時間取樣，測定抗體效價及其物理性狀，檢測結果見表1。
[0050]表1.凍干后血清于2~8°C保存不同時間的抗體效價
[0051]
【權利要求】
1.一種偽狂犬病標準陽性血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)抗原免疫:在隔離飼養(yǎng)的清潔級家兔左側腹股溝皮下注射2mL107 0TCID50/mL PRV滅活病毒液，間隔14日后在家兔左側腹股溝皮下加強免疫I次2mL 107 0TCID50/mL PRV滅活病毒液，距第1次免疫28日后在家兔右側腹股溝皮下注射2mL 105 0TCID50/mL PRV病毒液； (2)血清收獲:距第3次免疫后14日，收集血清。
2.根據(jù)權利要求1所述的偽狂犬病標準陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述的清潔級家兔為體重1.5~2kg的日本大耳白兔，對偽狂犬病、輪狀病毒病、豬瘟、細小病毒病、兔瘟抗原抗體呈陰性。
3.根據(jù)權利要求1所述的偽狂 犬病標準陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述的PRV為保藏編號為CCTCC NO:V201114的豬偽狂犬病弱毒C株。
4.一種偽狂犬病標準陽性血清的凍干保存方法，其特征在于包括以下步驟: (1)保護劑的配制及血清保存:按血清體積的1%、1%、0.1%、0.05%于血清中分別加入氯化鈉、海藻糖、谷氨酸單鈉、L-精氨酸，充分溶解后，用濾膜除菌，然后分裝； (2)凍干:將分裝好的血清裝入凍干機箱體內，在2~3小時內樣品由常溫降溫至-45°C，在此溫度下維持3~4個小時后，開始抽真空至10~20Pa后，再開始升溫，2小時內升至-10°C，之后以-10°C的升華溫度維持10~12小時，然后在I小時內提溫至0°C并維持2h，再在3小時內提溫至28°C并維持4~6小時后真空狀態(tài)下壓塞出箱。
5.根據(jù)權利要求4所述的偽狂犬病標準陽性血清的凍干保存方法，其特征在于:步驟(O中所述的濾膜為0.22 μ m的濾膜。
6.一種偽狂犬病標準陽性血清的制備及其凍干保存方法，其特征在于:使用權利要求1~3任一項所述的方法制備得到偽狂犬病標準陽性血清，再使用權利要求4或5所述的方法進行凍干保存。
【文檔編號】C07K16/18GK103864931SQ201410126929
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權日:2014年3月31日
【發(fā)明者】鄭良益, 舒銀輝, 漆世華, 楊思誼, 祝春花, 李玉萍, 謝紅玲, 溫文生, 李淑鈺, 郝敬侃, 饒清宜, 王桂桂, 王治江 申請人:武漢中博生物股份有限公司