一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，通過將試驗動物的褐色脂肪組織用提取液A混合研磨，離心去上層脂肪，取一次上清液；將所述一次上清液離心去沉淀，取二次上清液；將二次上清液離心取一次沉淀，將一次沉淀與提取液B混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液離心取二次沉淀；將二次沉淀與提取液B混勻，加入TritonX-100混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液在離心取三次上清液；將三次上清液裝柱、洗脫純化，得到解偶聯(lián)蛋白-1。本發(fā)明的純化效果較好，成本低，非常適合實驗室采用。
【專利說明】一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白分離純化【技術領域】，尤其涉及一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法。
【背景技術】 [0002]研究指出解偶聯(lián)蛋白-1(UCPl)的一級結構由306個氨基酸殘基構成，具有6個由α -螺旋構成的疏水環(huán)的過渡區(qū)域。UCPl分子的末端位于線粒體內膜的外表面，并且具有一個核苷酸結合位點。后來，有人深入地研究了 UCPl分子上核苷酸結合位點的結構狀況，結果表明，UCPl的核苷酸結合位點可能位于由UCPl分子構成的一個親水通道上。通過核磁共振(NMR)和圓二色性分析，發(fā)現(xiàn)殘基263~268位置正好具有一個α -螺旋結構，它是第六跨膜域的N-末端。若在結構或區(qū)域定向上發(fā)生改變，則會導致核苷酸或脂肪酸調節(jié)以及轉運活性功能改變。有研究報道BAT線粒體UCPl的261~269區(qū)域在控制質子轉移活動中具有重要作用，若殘基Phe257-Lys268-Gly269缺失則導致蛋白質的核苷酸調節(jié)功能喪失，而且如果這個片斷完全缺失，則會導致膜穿孔。用單鏈構象多態(tài)性檢測(SSCP)和序列分析檢測UCPl基因中的突變，結果表明有四個預期的氨基酸突變被檢測到，即Arg40Trp (外顯子l)，Lys257Arg (外顯子5)，它們的發(fā)生頻率較低，而Ala64Thr (外顯子2)與Met229Leu(外顯子5)突變發(fā)生頻率則較高。采用2-疊氮ATP分解結果則顯示出ATP的結合位點位于UCPl分子C-末端的第三個氨基酸殘基上；核苷酸(GDP)結合位點位于第258和279號氨基酸殘基。這四個突變在瘦人中的出現(xiàn)頻率普遍比肥胖人低，因而這些UCPl基因突變可能與肥胖發(fā)生有關。另外，冷刺激能使褐色脂肪細胞膜上的腎上腺素受體被神經突觸釋放的兒茶酚胺類物質激活，造成脂肪動員，激活UCP1。UCPl引起線粒體氧化呼吸的電子傳遞和ATP產生解偶聯(lián)作用，從而降低脂肪酸氧化代謝的產能效率，大量能量以熱能的形式散發(fā)，經過BAT豐富的血管被輸送到身體的各個部分。
[0003]國內現(xiàn)有的蛋白純化技術多為使用蛋白純化試劑盒，該方法方便快捷，但對試劑要求較高，且成本高。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，旨在解決解偶聯(lián)蛋白-1分離純化過程比較繁瑣，每次純化的量較小的問題。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，包括以下步驟:
[0006]( I)采集試驗動物的褐色脂肪組織，將所述褐色脂肪組織與提取液A按質量體積比為Ig:5ml混合研磨，在1500g、4°C條件下離心10min,去掉上層脂肪,取一次上清液；將所述一次上清液在500g、4°C條件下離心5min去掉沉淀,取二次上清液；
[0007](2)將所述二次上清液在10000g、4°C條件下離心10min，取一次沉淀，將所述一次沉淀與提取液B按質量體積比為Ig:5ml混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液在10000g、4°C條件下離心30min，取二次沉淀；
[0008](3)將所述二次沉淀與提取液B按質量體積比為Ig:2.5ml混勻，加入與步驟(2)所述提取液B等體積的體積濃度為5%的TritonX-1OO混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液在10000g、4°C條件下離心30min離心，取三次上清液；
[0009](4)將所述三次上清液裝柱、洗脫純化，得到解偶聯(lián)蛋白-1 ；
[0010] 在上述步驟中，所述提取液A的ρΗ7.4,包括10mmol/LTrisbase、250mmol/L鹿糖以及 2mmol/LEDTA ;所述提取液 B 的 pH6.7，包括 20mmoI/LMOPS、20mmoI/LNa2SO4 以及 2mmol/LEDTA。
[0011]優(yōu)選地，在步驟(2)以及(3)中，所述20kHz條件下超聲處理為在20kHz條件下超聲兩次，每次25s。
[0012]優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述采集試驗動物的褐色脂肪組織包括以下步驟:
[0013]A、將中緬樹駒斷頸處死，用75%的酒精棉球擦拭肩胛間及頸部兩側的毛發(fā)，用解剖剪和鑷子迅速剪下肩胛間及頸部兩側的褐色脂肪組織，去除上面的白色脂肪組織；
[0014]B、將所述褐色脂肪組織用提取液A按質量體積比為Ig:3ml混勻清洗組織，去除組織上的毛發(fā)。
[0015]優(yōu)選地，在步驟(4)中，所述將所述三次上清液裝柱、洗脫純化包括以下步驟:
[0016]A、取0.1~0.3g羥磷灰石溶于雙蒸水中，裝層析柱，保持柱面平整，靜置30~40min ；
[0017]B、取I~1.5ml所述三次上清液上樣，用提取液B進行洗脫；
[0018]C、用收集器收集柱不吸附成分，得到解偶聯(lián)蛋白-1。
[0019]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，通過將試驗動物的褐色脂肪組織用提取液A混合研磨，離心去上層脂肪，取一次上清液；將所述一次上清液離心去沉淀，取二次上清液；將二次上清液離心取一次沉淀，將一次沉淀與提取液B混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液離心取二次沉淀；將二次沉淀與提取液B混勻，加入TritonX-1OO混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液在離心取三次上清液；將三次上清液裝柱、洗脫純化，得到解偶聯(lián)蛋白-1。本發(fā)明的的純化效果較好，成本低，非常適合實驗室采用。
【具體實施方式】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021 ] 實施例1褐色脂肪組織中線粒體粗蛋白的分離
[0022](I)將實驗動物(中緬樹駒)斷頸處死，用75%的酒精棉球擦拭肩胛間及頸部兩側的毛發(fā)，用解剖剪和鑷子迅速剪下肩胛間及頸部兩側的褐色脂肪組織，小心去除上面帶有的白色脂肪組并稱重；
[0023](2)將組織放入研缽中，用3倍體積(W:V)的提取液A (包含lOmmol/LTrisbase、250mmol/L蔗糖以及2mmol/LEDTA，pH7.4)清洗組織，仔細去除組織上的毛發(fā)(此步驟可重復I~2次)；[0024](3)在冰上快速剪碎組織，以褐色脂肪組織:提取液A=l:5 (W:V)加入5倍體積的提取液A，混勻后迅速勻漿(研磨一定要充分，提取液A可分作2~3次加入研缽)；
[0025](4)將勻漿液轉移到1.5ml離心管中，在1500g、4°C條件下離心10min，用移液器小心去掉上層脂肪，取一次上清液；然后在500g、4°C條件下離心5min，去掉沉淀，取二次上清液；
[0026](5)將二次上清液進一步在10000g、4°C條件下離心10min,去掉上清液,取一次沉淀，將所得的一次沉淀用提取液 B (W: V=1: 5)(包含:20mmol/LM0PS，20mmol/LNa2S04, 2mmol/LEDTA, pH6.7)懸浮，充分混勻。
[0027](6)用超聲波儀在20kHz條件下超聲兩次，每次25s ；
[0028](7)超聲后的溶液在10000g、4°C條件下離心30min，去掉上清液，取二次沉淀；
[0029](8)用1/2初始體積的提取液B懸浮二次沉定，同時加入等體積5%的TritonX-100，充分混勻， 20kHz條件下超聲兩次，每次30s。
[0030](9)將超聲后的溶液于10000g，4°C條件下離心30min，取三次上清液，此三次上清液為褐色脂肪組織中線粒體粗蛋白。
[0031 ] 實施例2褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1的純化
[0032](I)取0.1~0.3g的羥磷灰石溶于雙蒸水中，裝層析柱，柱面一定要平整，然后靜置 30 ~40min ；
[0033](2)用上述上清液粗蛋白上樣(上樣量為I~1.5ml)，用適量體積的提取液B進行洗脫；
[0034](3)用DBS2100電腦全自動部分收集器(上?？等A生化儀器制造廠)收集柱不吸附成分，每管收集時間為IOOs (大約0.4ml)；
[0035](4)根據(jù)HD9721型紫外檢測儀(上?？等A生化儀器制造廠)和LM17型記錄儀(永青示波器廠)記錄柱不吸附成分的洗脫峰線，(吸收波長為280nm，蛋白質在此波長下均有吸收)，根據(jù)吸收峰線來確定解偶聯(lián)蛋白-1所在管號及含量最高管。
[0036](5)將確定含量最高管內的蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(最好能在冰浴條件下進行)，分離膠和濃縮膠的濃度分別為12%和3.5%，先恒壓90v，樣品進入分離膠后調至恒壓120v，直到溴酚藍指示劑走至前沿為止。
[0037](6)小心取下膠片，銀染色后，將蛋白樣品條帶與標準蛋白質Marker比較，根據(jù)其分子量是否在32000kDa處，進一步確定是否純化出解偶聯(lián)蛋白-1。
[0038](7)將純化得到的解偶聯(lián)蛋白-1做好標記，然后置于_20°C條件下保存。
[0039]相比與現(xiàn)有技術的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明的純化效果較好，成本低，非常適合實驗室采用。
[0040]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)采集試驗動物的褐色脂肪組織，將所述褐色脂肪組織與提取液A按質量體積比為Ig:5ml混合研磨,在1500g、4°C條件下離心10min,去掉上層脂肪,取一次上清液；將所述一次上清液在500g、4°C條件下離心5min去掉沉淀，取二次上清液； (2)將所述二次上清液在10000g、4°C條件下離心10min,取一次沉淀,將所述一次沉淀與提取液B按質量濃度為1:5混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液在10000g、4°C條件下離心30min，取二次沉淀； (3)將所述二次沉淀與提取液B按質量體積比為Ig:2.5ml混勻，加入與步驟(2)所述提取液B等體積的體積濃度為5%的TritonX-1OO混勻，20kHz條件下超聲處理，將超聲后的溶液在10000g、4°C條件下離心30min離心，取三次上清液； (4)將所述三次上清液裝柱、洗脫純化，得到解偶聯(lián)蛋白-1； 在上述步驟中，所述提取液A的pH7.4,包括10mmol/LTrisbase、250mmol/L鹿糖以及 2mmol/LEDTA ;所述提取液 B 的 pH6.7，包括 20mmoI/LMOPS、20mmoI/LNa2SO4 以及 2mmol/LEDTA。
2.如權利要求1所述的褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述采集試驗動物的褐色脂肪組織包括以下步驟: A、將中緬樹駒斷頸處 死，用75%的酒精棉球擦拭肩胛間及頸部兩側的毛發(fā)，用解剖剪和鑷子迅速剪下肩胛間及頸部兩側的褐色脂肪組織，去除上面的白色脂肪組織； B、將所述褐色脂肪組織用提取液A按質量體積比為Ig:3ml混勻清洗組織，去除組織上的毛發(fā)。
3.如權利要求2所述的褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，其特征在于，在步驟(2)以及(3)中，所述20kHz條件下超聲處理為在20kHz條件下超聲兩次，每次25s。
4.如權利要求3所述的褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白-1分離純化的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述將所述三次上清液裝柱、洗脫純化包括以下步驟: A、取0.1~0.3g羥磷灰石溶于雙蒸水中，裝層析柱，保持柱面平整，靜置30~40min ； B、取I~1.5ml所述三次上清液上樣，用提取液B進行洗脫； C、用收集器收集柱不吸附成分，得到解偶聯(lián)蛋白-1。
【文檔編號】C07K1/14GK103923205SQ201410142806
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月8日 優(yōu)先權日:2014年4月8日
【發(fā)明者】朱萬龍, 王政昆, 張 浩, 高文榮, 鄭佳, 孫舒然 申請人:云南師范大學