一種用于改變牛乳過(guò)敏蛋白潛在致敏性的方法
【專利摘要】一種用于改變牛乳過(guò)敏蛋白潛在致敏性的方法，按以下步驟：（1）制備蛋白溶液：用0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β-乳球蛋白稀釋成0.4mg/ml的均勻蛋白溶液；（2）將步驟（1）配制好的β-乳球蛋白溶液分裝于密封于錫箔袋中，于室溫下進(jìn)行高壓處理，壓力水平設(shè)置為200MPa，處理時(shí)間為30min。本發(fā)明見(jiàn)效快且操作簡(jiǎn)便，只需將分離純化的蛋白溶液，經(jīng)過(guò)固定壓力的高壓處理即可達(dá)到改變潛在致敏性的目的；所需試劑都是常規(guī)試劑，且使用常規(guī)的靜高壓滅菌裝置就可以進(jìn)行操作；較低壓力的高壓處理不僅能降低蛋白的致敏性，還能維持蛋白質(zhì)的感官特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種用于改變牛乳過(guò)敏蛋白潛在致敏性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種通過(guò)非熱加工技術(shù)改變牛乳過(guò)敏蛋白β-乳球蛋白潛在致敏性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛乳乳清蛋白中的β_乳球蛋白是牛乳中主要的過(guò)敏原之一。由于β_乳球蛋白具有耐酸和耐蛋白酶水解等特性，因此該蛋白經(jīng)過(guò)消化后，還會(huì)有部分完整的β_乳球蛋白或其肽段殘存于人體內(nèi)，導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)。因此利用各種加工手段降低β_乳球蛋白的過(guò)敏原性具有深遠(yuǎn)的意義。
[0003]食物過(guò)敏原不是通過(guò)完整的蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，這些引起食物過(guò)敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)就是過(guò)敏原表位。而表位包括線性表位和構(gòu)象性表位，是其過(guò)敏原性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[0004] 目前已有用于降低牛乳過(guò)敏原蛋白β-乳球蛋白的加工方法包括生物加工、化學(xué)加工、物理加工等技術(shù)。其中，生物加工是利用基因工程技術(shù)改變過(guò)敏蛋白的基因序列；化學(xué)加工則通過(guò)酶改性和糖基化等方式改變過(guò)敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到降低其致敏性的目的。然而這些技術(shù)均存在一定的局限性:β_乳球蛋白主要是以構(gòu)象性表位為主，難以通過(guò)序列變化大幅度改變構(gòu)象性表位；而β_乳球蛋白具有耐酶解特性，導(dǎo)致酶改性的效果不佳，且糖基化過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，會(huì)引起人們對(duì)食物安全性的考量。
[0005]物理加工又可分為熱加工和非熱加工。熱加工是牛乳及其乳制品生產(chǎn)過(guò)程中常用的滅菌技術(shù)，加熱過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致牛乳過(guò)敏蛋白產(chǎn)生去折疊或聚合等結(jié)構(gòu)變化，從而誘導(dǎo)牛乳過(guò)敏蛋白的潛在致敏性的改變。但是，熱加工也會(huì)致使牛乳中部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。而非熱加工技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)熱加工預(yù)期的加工效果，并能降低食品中有害微生物菌群的數(shù)量，同時(shí)可維持食品原有的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，保留其中的熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分。在非熱加工處理中，同時(shí)改變牛乳的潛在致敏性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用于改變牛乳過(guò)敏蛋白潛在致敏性的方法。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0008](I)制備蛋白溶液:用0.05Μ，ρΗ6.8的磷酸鹽緩沖液將乳球蛋白稀釋成
0.4mg/ml的均勻蛋白溶液。
[0009](2)將步驟(1)配制好的乳球蛋白溶液分裝于密封于錫箔袋中，于室溫下進(jìn)行高壓處理。壓力水平設(shè)置為200MPa，處理時(shí)間為30min。
[0010]對(duì)照未處理蛋白，采用競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA可以判斷出過(guò)敏蛋白的致敏性變化，及其變化的程度。
[0011]靜高壓技術(shù)是一種作用強(qiáng)度較大的非熱加工技術(shù)。該技術(shù)能殺菌和使蛋白質(zhì)變性，高壓對(duì)蛋白大分子的作用主要是通過(guò)壓力的增加使物質(zhì)體積發(fā)生變化，從而引起分子間結(jié)合方式的變化，導(dǎo)致其化學(xué)鍵的破壞或重聚，最終影響蛋白大分子的功能特性。大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)受到壓力的影響，然而小分子物質(zhì)，比如氨基酸，維他命，芳香成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不會(huì)被壓力所破壞。該過(guò)程引起過(guò)敏蛋白的線性和構(gòu)象性表位發(fā)生破壞，從而改變其潛在致敏性。
[0012]本發(fā)明采用常規(guī)的靜高壓滅菌技術(shù)，并通過(guò)控制蛋白濃度以及高壓壓力，以改變過(guò)敏蛋白的潛在致敏性。該過(guò)程中需要注意高壓處理時(shí)必須排盡錫箔袋內(nèi)空氣，不能將蛋白溶液直接進(jìn)行處理，這是影響靜高壓處理結(jié)果的關(guān)鍵之處。
[0013]本發(fā)明建立的靜高壓處理方法，具有如下優(yōu)點(diǎn):見(jiàn)效快且操作簡(jiǎn)便，只需將分離純化的蛋白溶液，經(jīng)過(guò)固定壓力的高壓處理即可達(dá)到改變潛在致敏性的目的；所需試劑都是常規(guī)試劑，且使用常規(guī)的靜高壓滅菌裝置就可以進(jìn)行操作；較低壓力的高壓處理不僅能降低蛋白的致敏性，還能維持蛋白質(zhì)的感官特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明靜高壓處理對(duì)β -乳球蛋白IgE結(jié)合能力的影響。
【具體實(shí)施方式】[0015]本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不受其限制。
[0016]實(shí)施例1。
[0017]1、靜高壓技術(shù)處理乳球蛋白。
[0018]具體實(shí)施過(guò)程包括如下步驟。
[0019]I)樣品制備:對(duì)牛乳進(jìn)行分離純化得到β -乳球蛋白，測(cè)定的蛋白濃度為0.4mg/mL，純度大于99%。
[0020]2)靜高壓處理:將分離純化的β -乳球蛋白溶液密封于錫箔袋中，于室溫下進(jìn)行高壓處理。壓力水平分別設(shè)置為100，200，300，400，50010^，處理時(shí)間均為3011^11。
[0021]2、乳球蛋白致敏性變化的定量分析。
[0022]靜高壓處理后的β_乳球蛋白溶液作為被分析的蛋白樣品，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA檢測(cè)其潛在致敏性的變化。對(duì)照未處理蛋白，可以判斷出該過(guò)敏蛋白潛在致敏性的改變程度。具體實(shí)施過(guò)程包括如下步驟。
[0023]I)構(gòu)建牛乳過(guò)敏患者血清池:選定11位符合既定條件的牛乳過(guò)敏患者的血清混合制備而成。這些患者的血清符合以下條件:對(duì)牛乳過(guò)敏呈陽(yáng)性；總的IgE水平均>100 IU/mL ;特異性IgE水平均>1 IU/mL。
[0024]2)抗原包被:將10(T500MPa處理后的各個(gè)β -乳球蛋白溶液稀釋至2.5 μ g /mL,在一塊酶標(biāo)板上分別包被上100 μ L，以未處理β -乳球蛋白溶液為對(duì)照。4°C過(guò)夜后PBST洗板三次，每次5min。
[0025]3)明膠封阻:每孔加入250 μ L 3%明膠，37°C封阻lh。洗板三次。
[0026]4) 一抗反應(yīng):另準(zhǔn)備一塊酶標(biāo)板以同樣的方式進(jìn)行封阻，洗滌之后，每孔加入1:20稀釋度的人血清100 μ L，37°C反應(yīng)Ih。反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后，每孔吸取100 μ L轉(zhuǎn)移至第一塊板內(nèi)，37 °C孵育Ih，PBST洗板三次。
[0027]5)二抗反應(yīng):每孔加入1:5000稀釋度的生物素標(biāo)記羊抗人IgE 二抗100 μ L，37°C反應(yīng)lh。PBST洗板。
[0028]6)親和素反應(yīng):每孔加入1:60稀釋的HRP-鏈霉素標(biāo)記的親和素100μ L，37°C反應(yīng)，洗板。
[0029]7)0PD顯色和檢測(cè):每孔加入100 μ L現(xiàn)配制的OPD顯色液，37°C避光反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后每孔50 μ L加入2Μ H2SO4終止液，在490nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。
[0030]8)結(jié)果的計(jì)算-.1gE結(jié)合能力(％) = (1-B/B。)X 100%, B0:無(wú)競(jìng)爭(zhēng)蛋白時(shí)的OD值；B:各加工條件下競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的OD值。
[0031]經(jīng)過(guò)靜高壓處理后β -乳球蛋白的潛在致敏性變化如附圖1所示，靜高壓技術(shù)處理牛乳過(guò)敏原β -乳球 蛋白后，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA方法分析其IgE結(jié)合能力的變化。壓力分別設(shè)置為100，200，300，400，500MPa，處理時(shí)間均為30min。隨著壓力的增加，其致敏性先大幅度降低后緩慢升高，其中壓力為200 MPa時(shí)，致敏性降低程度最大。
【權(quán)利要求】
1.一種用于改變牛乳過(guò)敏蛋白潛在致敏性的方法，其特征是按以下步驟: (O制備蛋白溶液:用0.05M, pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β _乳球蛋白稀釋成0.4mg/ml的均勻蛋白溶液； (2)將步驟(1)配制好的β_乳球蛋白溶液分裝于密封于錫箔袋中，于室溫下進(jìn)行高壓處理，壓力水平 設(shè)置為200MPa，處理時(shí)間為30min。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103910791SQ201410148114
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】李欣, 陳紅兵, 白雨鑫, 高金燕, 孟軒夷, 楊安樹(shù), 吳志華, 佟平 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)