巴利森苷對(duì)照品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種巴利森苷對(duì)照品的制備方法，從天麻中提取分離巴利森苷粗品，再經(jīng)制備液相色譜純化制得巴利森苷對(duì)照品。本發(fā)明制備的巴利森苷對(duì)照品純度符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，路線相對(duì)簡(jiǎn)單、可靠、易得。對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行考察，對(duì)照品易吸潮分解，室溫干燥儲(chǔ)存含量變化不大，可作為對(duì)照品的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)臈l件。本發(fā)明為巴利森苷對(duì)照品的制備提供了一種新的技術(shù)，為天麻質(zhì)量控制的深入研究提供了技術(shù)支撐。
【專利說明】巴利森苷對(duì)照品的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離純化技術(shù)，尤其是一種巴利森苷對(duì)照品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]夭露(Gastrodia」為蘭科多年生草本植物,分布于全國(guó)大部分地區(qū),主產(chǎn)于云南、貴州、四川、陜西及河南等地，在日本、韓國(guó)也有廣泛分布。其干燥塊莖亦稱天麻，是一味常用而較名貴的中藥。天麻性平，味甘，有平肝息風(fēng)止痙的功能。主治頭痛眩暈，肢體麻木，小兒驚風(fēng)，癲癇抽搐，破傷風(fēng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)天麻還具有增智、健腦、延緩衰老的作用，對(duì)老年性癡呆癥有一定的療效。
[0003]目前一般認(rèn)為天麻素是天麻重要的活性成分，“2010年版中國(guó)藥典附錄”中天麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，也是以天麻素作為重要的參考指標(biāo)。多項(xiàng)有關(guān)天麻素的藥理研究報(bào)道，天麻素并沒有表現(xiàn)出與其傳統(tǒng)藥效相關(guān)的藥理活性。雖然用幾個(gè)化學(xué)成分作為指標(biāo)控制天麻的質(zhì)量有失偏頗，但是目前天麻對(duì)照品只能購買到天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香蘭素等結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單、價(jià)廉的合成品，用其評(píng)價(jià)名貴中藥天麻局限性明顯。而天麻成分中較具特征的巴利森苷類化合物及多芳環(huán)化合物沒有對(duì)照品，很難再深入開展研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種巴利森苷對(duì)照品的制備方法，采用本發(fā)明技術(shù)能從天麻中分離獲得純度極高的巴利森苷對(duì)照品。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:巴利森苷對(duì)照品的制備方法，包括以下步驟
I)將天麻粉加入質(zhì)量百分比為70%的乙醇中，回流提取溫度75°C~80°C，過濾提取液；將提取液進(jìn)行減壓濃縮回收酒精，向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂，萃取至萃取液無色透明，分離的水層用大孔吸附樹脂層析柱分離，用乙醇-水梯度洗脫，洗脫梯度為純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿:甲醇為50:1~1: 1，V:V，在氯仿與甲醇的體積比為3:1的洗脫部分獲得巴利森苷粗品。
[0006]2)將巴利森苷粗品用色譜甲醇溶解后，經(jīng)制備液相色譜分離純化，流動(dòng)相為乙腈-7K，乙腈與水的體積比為15:85(色譜柱為C18反相硅膠柱，流速15mL/min，柱溫25°C)，收集液經(jīng)冷凍干燥后，獲得白色粉末狀結(jié)晶，即為巴利森苷對(duì)照品。
[0007]天麻與乙醇的料液比為1:10到1:20。
[0008]回流提取為3次，3次提取的時(shí)間依次為3小時(shí)、3小時(shí)及2小時(shí)，合并3次提取液。
[0009]減壓濃縮的壓力為0.05MPa，溫度為75°C，濃縮時(shí)間為45min。
[0010]向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂時(shí)，濃縮液與石油醚的體積比為1:3，反復(fù)萃取5~8次。
[0011]為了證明本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)效果，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):
I材料與儀器1.1材料
1.1.1供試材料
天麻(Gastrodia elata B1.)購于貴陽藥材公司，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為蘭科植物天麻。
[0012]1.1.2試劑與儀器
柱色譜硅膠(青島海洋化工產(chǎn))；柱色譜大孔樹脂(日本三菱公司)；薄層色譜硅膠(青島海洋化工產(chǎn))；乙腈為色譜純級(jí)，其它試劑均為分析純級(jí)。FW100型高速萬能粉碎機(jī)(泰斯特儀器有限公司):HZT-B5000電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鎘(上海浦東物理光學(xué)儀器產(chǎn));RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器產(chǎn))；SHB-1IIS循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工有限公司)；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；1200型高效液相色譜儀(安捷倫):1200型制備液相色譜儀(安捷倫)；WRS-1B型數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精科)。
[0013]2方法與結(jié)果
2.1巴利森苷的提取分離
取天麻粉2 Kg用20 L質(zhì)量百分比為70%的乙醇回流提取3次，回流提取溫度75°C~80°C，提取時(shí)間分別為3 h、3 h、2 h，合并3次提取液，向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂，萃取至萃取液無色透明，分離的水層用大孔吸附樹脂層析柱分離，用乙醇-水梯度洗脫，洗脫梯度為純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿:甲醇為50:1~1:1，V:V，在氯仿與甲醇的體積比為3:1的洗脫部分獲得巴利森苷粗品。
[0014]2.1.2巴利森苷的純化
將巴利森苷粗品用色譜甲醇溶解后，經(jīng)制備液相色譜分離純化，流動(dòng)相為乙腈-水，乙腈與水的體積比為15:85 (色譜柱為C18反相硅膠柱，流速15mL/min，柱溫25°C)，收集液經(jīng)冷凍干燥后，獲得白色粉末狀結(jié)晶，即為巴利森苷對(duì)照品。
[0015]巴利森苷對(duì)照品的提取、分離、純化工藝流程圖如圖1所示。
[0016]2.2純度檢測(cè)
2.2.1巴利森苷的TLC純度檢測(cè)
取巴利森苷對(duì)照品，加甲醇配制成I mL含I mg的對(duì)照品溶液，按薄層色譜法試驗(yàn)，取上述溶液2、5、10、15、20、25 μ L點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以氯仿:甲醇:冰乙酸(2:1:0.05)薄層色譜圖見圖2 ;丙酮:甲醇:冰乙酸(6:1:0.02)薄層色譜圖見圖3 ;乙酸乙酯:丙酮:甲醇:冰乙酸(4:2:1:0.03)為展開劑，薄層色譜圖見圖4 ;展開、取出、晾干，分別在紫外燈下觀察(254 nm)、鵬顯、硫酸顯色劑顯色后觀察記錄結(jié)果。由圖2、圖3、圖4可知，在3種展開劑和3種不同的顯色劑中，對(duì)照品斑點(diǎn)清晰除對(duì)照品顯色單一斑點(diǎn)外，不應(yīng)有其它斑點(diǎn)，自制的巴利森苷對(duì)照品溶液隨著濃度增加，仍呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)且圓整性好，說明對(duì)照品純度較高。
[0017]2.3 HPLC 含量測(cè)定
2.3.1供試品溶液的制備
分別精密稱取巴利森苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每ImL含Img的溶液，即得。
[0018]2.3.2 測(cè)定法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，巴利森苷以乙腈-水(15:85，K: K)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為222 nm ;流速:1.0 mL/min ;柱溫:30°C;進(jìn)樣量:5 μ L。色譜條件下測(cè)定，面積歸一化法計(jì)算其純度。巴利森苷對(duì)照品的含量為99.37%。理論塔板數(shù)按巴利森苷峰計(jì)算不低于8000，對(duì)稱因子均大于0.9，HPLC色譜圖見圖4。
[0019]2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)
將巴利森苷對(duì)照品置棕色玻璃瓶中，分別對(duì)其的溫度、光照、進(jìn)行穩(wěn)定性考察，量測(cè)定方法分別在0、3、5、7、10天測(cè)定含量。
[0020]2.4.1溫度考察
由于前期工作總結(jié)得出，巴利森苷對(duì)溫度比較敏感，容易分解，所以條件選擇為室溫、冷藏、冷凍。結(jié)果見表1
2.4.2光照考察
光照考察條件為照度4500 lx、25°C條件下按含量測(cè)定方法，結(jié)果見表1。對(duì)照品的儲(chǔ)存條件為干燥、室溫10天內(nèi)含量變化不大，巴利森苷對(duì)照品含量穩(wěn)定。
【權(quán)利要求】
1.一種巴利森苷對(duì)照品的制備方法，其特征在于:包括以下步驟 1)將天麻粉加入質(zhì)量百分比為70%的乙醇中，回流提取溫度75°C~80°C，過濾提取液；將提取液進(jìn)行減壓濃縮回收酒精，向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂，萃取至萃取液無色透明，分離的水層用大孔吸附樹脂層析柱分離，用乙醇-水梯度洗脫，洗脫梯度為純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿:甲醇為50:1~1: 1，V:V，在氯仿與甲醇的體積比為3:1的洗脫部分獲得巴利森苷粗品； 2)將巴利森苷粗品用色譜甲醇溶解后，經(jīng)制備液相色譜分離純化，流動(dòng)相為乙腈-水，乙腈與水的體積比為15:85，色譜柱為C18反相硅膠柱，流速15mL/min，柱溫25°C，收集液經(jīng)冷凍干燥后，獲得白色粉末狀結(jié)晶，即為巴利森苷對(duì)照品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴利森苷對(duì)照品的制備方法，其特征在于:天麻粉與乙醇的料液比為1:10~20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴利森苷對(duì)照品的制備方法，其特征在于:回流提取為3次，3次提取的時(shí)間依次為3小時(shí)、3小時(shí)及2小時(shí)，合并3次提取液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴利森苷對(duì)照品的制備方法，其特征在于:減壓濃縮的壓力為0.05MPa，溫度為75°C，濃縮時(shí)間為45min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴利森苷對(duì)照品的制備方法，其特征在于:向濃縮液中加入石油醚萃取脫脂時(shí)，濃縮液與石油醚的體積比為1:3，反復(fù)萃取5~8次。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK103896999SQ201410150002
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】周英, 陳琳, 郭豐敏, 聶昌平, 彭禮軍 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)