一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1的制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于免疫用抗體制備【技術(shù)領(lǐng)域】的一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1。本發(fā)明從制備的eLtaS中和性單克隆抗體E4-1雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，所得輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。基于上述單克隆抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)多種生物活性分子，用于制備抗金黃色葡萄球菌感染的藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫用抗體制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1及其制備方法以及其在制備抗金黃色葡萄球菌感染的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]金黃色葡萄球菌(金黃色葡萄球菌，Staphylococcus aureus)屬葡萄球菌屬，是人類的一種重要病原菌，能夠引起肺炎、心內(nèi)膜炎、燒傷及戰(zhàn)傷感染、敗血癥、中毒性休克等多種嚴(yán)重感染(Lowy FD.New Engl J Med.1998 ;339，520-532)，它是革蘭氏陽性菌膿毒血癥的主要致病菌，也是燒傷創(chuàng)面感染、急性肝衰竭的重要病原菌(姚詠明等，膿毒癥研究的若干新動(dòng)態(tài)2000 ;13，517-519)。其能夠在人群密集的區(qū)域通過飛沫、接觸進(jìn)行大規(guī)模傳播。更為嚴(yán)重的是，金黃色葡萄球菌耐藥性不斷增強(qiáng)，如1961年發(fā)現(xiàn)的對(duì)β -內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，2002年10月又發(fā)現(xiàn)了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(VRSA)。2007年10月，Klevens R M等調(diào)查表明美國2005年感染MRSA的人數(shù)超過9萬人，感染MRSA的病人死亡率為19.8%，死亡人數(shù)超過HIV感染的死亡人數(shù)(KlevensRM, et al.JAMA.2007 ；298:1763-1771)。更為嚴(yán)重的是，臨床已經(jīng)沒有有效的抗生素應(yīng)對(duì)多重耐藥的MRSA，抗金黃色葡萄球菌感染亟需新的更有效的治療策略。
[0003]LtaS(LTA合成酶)是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜蛋白之一，全長646aa，N端位于胞內(nèi)，C端位于胞外，有5個(gè)跨膜區(qū)，其功能區(qū)位于胞外，與金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁主要成分LTA的合成密切相關(guān)。I型多肽酶SpsB可以水解全長LtaS并將其胞外區(qū)eLtaS (218-646aa)釋放于細(xì)菌生長上清中。 申請(qǐng)人:在實(shí)驗(yàn)過程中證實(shí)在小鼠急性腹膜炎模型和肺炎模型中eLtaS可以顯著加重金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠的感染，從而證實(shí)其為金黃色葡萄球菌重要毒力因子之一；進(jìn)一步還證實(shí)針對(duì)eLtaS蛋白的中和性單克隆抗體可以在小鼠腹膜炎模型和肺炎模型中顯著減緩金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠的感染，且證實(shí)其抗感染功能的發(fā)揮依賴于其對(duì)金黃色葡萄球菌LTA合成的抑制。目前關(guān)于利用抗細(xì)菌毒力蛋白的特異性抗體進(jìn)行抗細(xì)菌感染治療的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1。
[0005]本發(fā)明的目的還在于提供上述單克隆中和性抗體E4-1的制備方法以及其在制備抗金黃色葡萄球菌感染的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的抗eLtaS的單克隆抗體E4_l的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子，其可變區(qū)氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4所示，其編碼基因分別如序列表中SEQ IDN0:1, SEQ ID N0:2所示。該單克隆抗體的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。該單克隆抗體的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 所示。
[0007] 上述單克隆抗體E4-1的制備方法，主要內(nèi)容如下:
[0008]1.抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建
[0009]首先利用eLtaS蛋白免疫Balb/c小鼠，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。用ELISA法篩選，陽性細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100%陽性。
[0010]2.抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株E4_l的篩選
[0011]通過檢測(cè)抗eLtaS單克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌LTA合成能力的影響篩選eLtaS中和性抗體。利用腦心浸液培養(yǎng)基常規(guī)條件培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，分別在培養(yǎng)體系中加入抗eLtaS單克隆抗體及對(duì)照IgG至100 μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后收集細(xì)菌，利用玻璃珠研磨獲得細(xì)菌細(xì)胞壁LTA，SDS-PAGE分離所獲LTA并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，使用LTA特異性抗體檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌LTA水平。結(jié)果表明抗eLtaS單克隆抗體E4-1可以有效抑制金黃色葡萄球菌LTA合成。
[0012]3.抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株E4-1的鑒定
[0013]用雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)證明E4-1雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0014]4.抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株E4_l的親和力和特異性檢測(cè)
[0015]親和柱純化Balb/c小鼠雜交瘤細(xì)胞腹水，紫外分光光度計(jì)測(cè)量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。利用ELISA方法檢測(cè)E4-1與eLtaS親和力，結(jié)果顯示EC50 = 31ng/ml。利用western-blot對(duì)E4-1特異性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示E4-1可特異性識(shí)別eLtaS線性表位。
[0016]5.抗eLtaS單克隆抗體E4-1對(duì)感染金黃色葡萄球菌的BALB/C小鼠保護(hù)作用的檢測(cè)
[0017]利用腹腔注射金黃色葡萄球菌制備小鼠急性腹膜炎模型并注射單克隆抗體E4-1，記錄小鼠存活情況，結(jié)果顯示單克隆抗體E4-1可以顯著降低金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠的致死率。利用金黃色葡萄球菌灌注小鼠氣管制備肺炎模型并注射單克隆抗體E4-l，72小時(shí)后制備肺部病理切片并進(jìn)行HE染色，結(jié)果表明E4-1可以顯著降低金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠肺部的感染。
[0018]6.抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞E4_l輕、重鏈基因的釣取
[0019]取對(duì)數(shù)生長期的中和性單克隆抗體E4-1細(xì)胞，提取RNA，經(jīng)RT-PCR，用兩對(duì)特異性引物MuLC4(如序列表SEQ ID N0:11所示)MuC κ (如序列表SEQ ID Ν0:12所示)，MuHCl (如序列表SEQ ID NO: 13所示)和MuIgGl (如序列表SEQ ID NO: 14所示)釣取抗體的輕重鏈基因。常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。通過本部分實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了抗eLtaS單克隆抗體E4-1輕、重鏈基因的載體，經(jīng)序列分析、比對(duì)，編碼序列為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(序列表中SEQ IDNO:1和 SEQ ID NO:2)。
[0020]7.單克隆抗體E4-1輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定
[0021]用www.expasy.0rg在線軟件將編碼eLtaS單克隆抗體E4_l輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體E4-1輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID N0:4 所不。根據(jù) Kabat 數(shù)據(jù)庫(ElvinA.Kabat.《Sequencesof Proteins of Immunological Interest).1991)確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示。重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示。
[0022] 上述抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1在制備抗金黃色葡萄球菌感染的藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明應(yīng)用一套設(shè)計(jì)的引物成功地從培養(yǎng)的抗eLtaS單克隆抗體E4-1雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。所得輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。本發(fā)明的單克隆抗體基于上述已克隆到的抗eLtaS單克隆抗體E4-1輕、重鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等，用于抗金黃色葡萄球菌感染的治療藥物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為eLtaS基因釣取產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析圖；其中泳道I為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為eltaS基因PCR釣取產(chǎn)物。
[0025]圖2為免疫用eLtaS的SDS-PAGE結(jié)果圖譜；其中泳道I為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為純化的eLtaS蛋白。
[0026]圖3單克隆抗體經(jīng)Protein G純化后的SDS-PAGE結(jié)果圖譜；其中泳道I為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為經(jīng)Protein G純化的中和性單克隆抗體，A為重鏈，B為輕鏈。
[0027]圖4Western-blot檢測(cè)E4-1對(duì)金黃色葡萄球菌LTA合成影響的檢測(cè)；其中泳道1，2，3為細(xì)菌培養(yǎng)過程中分別加入PBS、E4-1和對(duì)照IgG。
[0028]圖5ELISA鑒定單克隆抗體E4-1親和力線形圖。
[0029]圖6單克隆抗體E4-1結(jié)合特性的Western-blot鑒定圖譜；其中泳道I為單克隆抗體E4-1檢測(cè)結(jié)果，泳道2為對(duì)照小鼠IgG檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示中和性單克隆抗體E4-1可識(shí)別eLtaS線性表位。
[0030]圖7急性腹膜炎模型檢測(cè)E4-1抗金黃色葡萄球菌感染效果圖；結(jié)果顯示中和性單克隆抗體E4-1可以有效抵抗金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠的感染。
[0031]圖8肺炎模型檢測(cè)E4-1抗金黃色葡萄球菌感染效果圖；結(jié)果顯示中和性單克隆抗體E4-1可以有效抵抗金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠的感染。
[0032]圖9抗eLtaS單克隆抗體E4_l雜交瘤細(xì)胞RNA提取結(jié)果電泳圖。
[0033]圖10為eLtaS中和性單克隆抗體E4_l雜交瘤細(xì)胞輕重鏈基因的PCR結(jié)果圖譜；其中泳道I為DL2000，泳道2為輕鏈基因，為泳道3為重鏈基因，基因大小分別約為690bp和 780bp。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面通過附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，通過參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說明，并不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]實(shí)施例1抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建[0036]材料:福氏完全佐劑及不完全佐劑，TMB為Sigma公司產(chǎn)品，20%胎牛血清為北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，無血清RPMI1640為Gibco公司產(chǎn)品，SP2/0細(xì)胞從ATCC引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存，Balb/c小鼠、昆明小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其余試劑均為市購。
[0037]方法結(jié)果:
[0038]1，eLtaS蛋白表達(dá)及純化。利用eLtaS編碼區(qū)特異性引物釣取金黃色葡萄球菌8325-4基因組中eLtaS基因(其電泳檢測(cè)如圖1所示)，并克隆入pET_28a載體誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得eLtaS蛋白(其SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖2所示)。
[0039]2，Balb/c小鼠免疫。選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠6只，用100 μ geLtaS蛋白腹股溝皮下免疫，第一針加福氏完全佐劑，第2針加福氏不完全佐劑，每3周免疫I次，共免疫3次。第3次免疫后尾靜脈采血，ELISA檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況，融合前3天，以100 μ geLtaS蛋白腹腔加強(qiáng)免疫一次，第3天融合。[0040]3，細(xì)胞融合。將免疫的小鼠摘眼球后脫頸處死，無菌摘取小鼠脾細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。具體方法:①將免疫的小鼠摘眼球放血后脫頸處死，75%酒精浸泡3min，無菌取出脾臟，用200目鋼網(wǎng)研磨單個(gè)細(xì)胞懸液，無血清RPMI1640洗兩次并記數(shù)；②收集對(duì)數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞，用無血清RPMI1640洗兩次并記數(shù)；③按SP2/0細(xì)胞:脾細(xì)胞=I: 5的比例混合兩種細(xì)胞，用RPMI1640洗I次，棄盡上清，輕輕將細(xì)胞打散；④在Imin時(shí)間里緩慢加入 Iml50% PEG(MWl500)溶液，置 37°C水浴 Imin ;⑤在 lmin、2min、2min、5min 時(shí)間內(nèi)加無血清RPMI1640lml、5ml、10ml、IOml ;?800r/min離心7min,棄上清,盡可能輕輕將細(xì)胞懸起；⑦加含20% FCS的HAT (Sigma)-RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 106/ml，混勻后，滴加在鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞(1X104細(xì)胞/孔)96孔培養(yǎng)板(Gibco)中，100 μ I/孔，37。。5%CO2孵箱中培養(yǎng)。
[0041]4, ELISA篩選抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。用10 μ g/ml eLtaS包被ELISA板，于4°C過夜并封閉。依次加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液(37°C lh，PBST洗板4次)，及1: 40000稀釋的50 μ I HRP-GAM(37°C 45min，PBST洗板4次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長測(cè)定吸光值。
[0042]5，雜交瘤細(xì)胞克隆化。篩選獲得中和性抗體細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100%陽性。雜交瘤細(xì)胞的克隆化用有限稀釋法:(I)在克隆化的當(dāng)天或前I天制備滋養(yǎng)細(xì)胞:脫頸處理昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒皮膚，無菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5mll640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，反復(fù)沖洗后吸出腹腔洗液，用20%胎牛血清1640培養(yǎng)液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1ml0 (2)取少許待作克隆化的雜交瘤細(xì)胞移至另一無菌試管中，并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。(3)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。(4)將培養(yǎng)板置于5%C02，37°C孵箱中培養(yǎng)，5天左右在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞克隆。適時(shí)換液，檢測(cè)，取陽性單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存細(xì)胞株。
[0043]通過本部分工作，構(gòu)建了 8株抗eLtaS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0044]實(shí)施例2抗eLtaS中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選和鑒定
[0045]材料:ProteinG Sepharose CL4B 柱:GE healthcare 公司產(chǎn)品；余同上。
[0046]方法結(jié)果:
[0047]1，eLtaS單克隆抗體純化。在2毫升小鼠腹水中加入I毫升PH8.0, 0.1moL/L磷酸緩沖液并用PH9.0, ImoL/L TRIS-HCL調(diào)整PH為9。把小鼠腹水加入已經(jīng)用0.1moL/L磷酸緩沖液PH8.0平衡好的Protein G Sepharose CL4B柱蛋白柱中，用上述緩沖液洗柱子，直到流出液中測(cè)不到雜蛋白為止。用PH3.0的檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液，并立即用ImoL/L TRIS-HCL PH8.5 緩沖液中和，用 PH7.2,0.01M PBS 透析 72h。取樣進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)(圖3)。
[0048]2，中和性抗體的篩選。使用腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌8325-4，37°C，200rpm,在Iml培養(yǎng)上清中分別加入1640培養(yǎng)基和不同細(xì)胞株上清IOOul，培養(yǎng)細(xì)菌6小時(shí)后離心收集菌體，加入4倍體積玻璃珠震蕩破碎細(xì)菌，離心收集上清并使用15% SDA-PAGE分離所獲裂解產(chǎn)物，使用半干轉(zhuǎn)移法將分離產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入PVDF膜(20V，30min)，使用LTA特異性抗體檢測(cè)不同處理方式后細(xì)菌LTA水平的差異，其中E4-1具有阻斷細(xì)菌LTA生成活性(圖 4)。
[0049]3，雜交瘤細(xì)胞E4-1免疫球蛋白亞型的確定。用羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細(xì)胞濃縮后的培養(yǎng)上清作雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，證明E4-1雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0050]43，eLtaS單克隆抗體在2毫升小鼠腹水中加入I毫升PH8.0，0.1moL/L磷酸緩沖液并用PH9.0, ImoL/L TRIS-HCL調(diào)整PH為9。把小鼠腹水加入已經(jīng)用0.1moL/L磷酸緩沖液PH8.0平衡好的Protein G Sepharose CL4B柱蛋白柱中，用上述緩沖液洗柱子，直到流出液中測(cè)不到雜蛋白為止。用PH3.0的檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液，并立即用ImoL/L TRIS-HCL PH8.5緩沖液中和，用PH7.2，0.01M PBS透析72h。取樣在紫外分光光度計(jì)上測(cè)0D260，0D280，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，凍干。
[0051]5, eLtaS單克隆抗體E4-1親和力鑒定。用10μg/ml eLtaS包被ELISA板,于4°C過夜并封閉。加入待測(cè)不同 濃度E4-1(37°C lh，PBST洗板4次)，及1: 40000稀釋的50 μ IHRP-GAM (37°C 45min,PBST洗板4次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長測(cè)定吸光值(圖5)。
[0052]6，eLtaS單克隆抗體E4-1特異性鑒定。SDS-PAGE分離eLtaS蛋白(圖5)并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，滴加含5%奶粉的PBS于4°C封閉過夜，用含0.5ml/L Tween-20的PBS洗膜3次。將膜剪成相同寬度，依次滴加eLtaS單克隆抗體E4_l (37°C結(jié)合lh，PBST洗膜3次，再用含0.5ml/L Tween-20的TBS洗滌3次)及HRP-GAM IgG(37°C結(jié)合lh，洗膜3次)以DAB顯色后，觀察結(jié)果。結(jié)果顯不E4_l為eLtaS特異性單克隆抗體(圖6)。
[0053]通過本部分工作，篩選到抗eLtaS中和性單克隆抗體E4_l，所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。單克隆抗體E4-1與eLtaS蛋白具有極高親和力，且單克隆抗體E4-1可特異性識(shí)別eLtaS線性表位。
[0054]實(shí)施例3單克隆抗體E4-1對(duì)⑶I小鼠的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)
[0055]材料:同上實(shí)施例1和2。
[0056]方法結(jié)果:
[0057]1，急性腹膜炎模型檢測(cè)抗eLtaS單克隆抗體E4_l抵抗金黃色葡萄球菌感染效果。以6周齡雌性⑶I小鼠為處理對(duì)象，分別腹腔注射PBS、對(duì)照IgG (100 μ g)和Ε4-1(100μ g)；挑取金黃色葡萄球菌8325-4單克隆培養(yǎng)于腦心浸液培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)12hr。收集細(xì)菌后使用PBS洗滌細(xì)菌一次，并將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至0D600 = 1.5，吸取500 μ I腹腔注射入小鼠，觀察不同時(shí)間點(diǎn)小鼠存活數(shù)量(圖7)。
[0058]2，肺炎模型檢測(cè)抗eLtaS單克隆抗體E4-1抵抗金黃色葡萄球菌感染效果。以6周齡雌性⑶I小鼠為處理對(duì)象，分別腹腔注射PBS、對(duì)照IgG(100 μ g)和E4-1 (100 μ g);挑取金黃色葡萄球菌8325-4單克隆培養(yǎng)于腦心浸液培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)12hr。收集細(xì)菌后使用PBS洗滌細(xì)菌一次，并將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至0D600 = 1，吸取100 μ I經(jīng)氣管注射入小鼠肺部，72小時(shí)后短頸處死小鼠，取肺部組織制備切片，HE染色觀察炎癥反應(yīng)水平(圖8)。
[0059]實(shí)施例4eLtaS中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞E4_l輕、重鏈基因的釣取
[0060]材料:弓丨物:MuIX4:見序列表中序列11 ；MuC κ:見序列表中序列12 ；MuHC1:見序列表中序列13 ；MuIgGl:見序列表中序列14。DNA片段純化試劑盒=OMEGA生物科技公司產(chǎn)品；T4DNA 連接酶:New England Biolabs 產(chǎn)品；載體 PGEM Teasy:Promega 公司產(chǎn)品；TRIzol Jnvitrogen公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)菌JM109:購自Promega公司。余同上。
[0061]方法結(jié)果:
[0062]取對(duì)數(shù)生長期的中和性單克隆抗體E4-1細(xì)胞5 X 106-107個(gè)，離心去除上清，將細(xì)胞均勻彈起。加lmlTRIzol反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，振蕩5分鐘后，加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘，2-80C 12000r/min,離心15分鐘，取上清于另一新管中，加500 μ I異丙醇混勻后室溫放置10分鐘，2-80C 12000r/min離心10分鐘。75%乙醇洗滌沉淀，干燥后，用20 μ I無RNA酶的去離子水溶解沉淀(圖9)。
[0063]取含I μ g總RNA的溶液，依次加入AMV5 X緩沖液4 μ I，01 igo (dT) (500ng/μ 1)0.5μ 1,2.5mmol/L dNTP2 μ 1，Rnasin (50U/μ 1)0.5 μ I，去離子水補(bǔ)至 20 μ 1、反轉(zhuǎn)錄酶2-5U，42°C延伸I小時(shí)。95°C變性5分鐘，置冰浴中，產(chǎn)物為cDNA第一鏈。用2對(duì)特異性引物MuLC4和MuCk，MuHCl和MuIgGl，在20 μ I PCR反應(yīng)體系中，分別加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μ 1，丁&9酶10父1311打6『2 4 1，上下游引物各 1μ 1,2.5mmol/L dNTPl μ 1，加 Taq 酶 1-2U，去離子水補(bǔ)至20 μ I。95°C變性2分鐘，循環(huán)參數(shù)為:94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C I分鐘，共30個(gè)循環(huán)，72°C后延伸10分鐘(圖10)。
[0064]用分離出欲回收的DNA片段，在長波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55°C水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒回收DNA片段并將純化的DNA片段在水溶液里，將回收的PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶緩沖液中按2:1的比例(摩爾比)和載體PGEM Teasy混合后，加入0.5U的T4DNA連接酶于16°C連接過夜，連接反應(yīng)的總體積為10 μ L。
[0065]取連接液10μ 1，加入200μ I感受態(tài)細(xì)菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴熱休克90秒，迅速轉(zhuǎn)入冰浴2分鐘，加800 μ I LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入37°C恒溫?fù)u床，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖動(dòng)45分鐘，4000r/min離心I分鐘，棄去800 μ I上清，取沉淀涂布于含Amp (終濃度為100 μ g/ml)的固體LB平板，將平板倒置于37°C孵箱12~18小時(shí)。
[0066]在上述平板中挑取單個(gè)克隆，接種于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中。37°C恒溫?fù)u床170rpm,震蕩培養(yǎng)過夜。取3ml菌液加入1.5ml Eppendorf管中，1000Orpm離心lmin，棄上清。將沉淀菌體重懸于100 μ L溶液I中，加新鮮配制的溶液ΙΙ200 μ L，輕緩地上下顛倒數(shù)次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150 μ L溶液III，輕柔地上下顛倒數(shù)次使液體混勻，此時(shí)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀。4°C，12000rpm離心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酹,劇烈震蕩后，12000rpm離心5min,將上層水相移至一新管中。再加入500 μ L氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無水乙醇混勻，于-20°c放置3h。4°C，12000rpm離心10min，棄上清，用70 %乙醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40 μ L無菌雙蒸水溶解，進(jìn)行PCR鑒定及DNA測(cè)序分析。
[0067]構(gòu)建了含有eLtaS中和抗體Ε4-1輕、重鏈基因的載體，經(jīng)測(cè)序分析、序列比對(duì)為小鼠免疫球蛋 白輕、重鏈基因(序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4_l,其特征在于,所述單克隆中和性抗體E4-1的輕，重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)編碼基因如序列表中SEQ ID N0:1,SEQID NO:2所示；其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1，其特征在于，所述輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1，其特征在于，所述重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10 所示。
4.權(quán)利要求1所述一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行: (1)利用eLtaS蛋白免疫Balb/c小鼠，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，用ELISA法篩選，陽性細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100%陽性； (2)通過檢測(cè)抗eLtaS單 克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌LTA合成能力的影響篩選eLtaS中和性抗體，利用腦心浸液培養(yǎng)基常規(guī)條件培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，分別在培養(yǎng)體系中加入抗eLtaS單克隆抗體及對(duì)照IgG至100 μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后收集細(xì)菌； (3)取對(duì)數(shù)生長期的中和性單克隆抗體E4-1細(xì)胞，提取RNA，經(jīng)RT-PCR，用兩對(duì)特異性引物MuLC4和MuC K，MuHCl和MuIgGl釣取抗體的輕重鏈基因，常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序分析，構(gòu)建抗eLtaS單克隆抗體E4-1輕、重鏈基因的載體，經(jīng)序列分析、比對(duì)，編碼序列為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因，其基因序列如序列表中SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2所不； (4)用www.expasy.0rg在線軟件將編碼eLtaS單克隆抗體E4-1輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為編碼的氨基酸序列，單克隆抗體E4-1輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 所不，根據(jù) Kabat 數(shù)據(jù)庫(ElvinA.Kabat.《Sequencesof Proteins of Immunological Interest).1991)確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示，重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1的制備方法，其特征在于，所述特異性引物MuLC4和MuCk的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示；所述特異性引物MuHCl和MuIgGl的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:14 所示。
6.權(quán)利要求1所述抗金黃色葡萄球菌eLtaS蛋白的單克隆中和性抗體E4-1在制備抗金黃色葡萄球菌感染的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/12GK103951748SQ201410156042
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】楊光, 劉玉, 高亞萍, 董潔, 馮健男 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所