一種潛在的高效重組HIV-1 CRF07-BC gp140免疫原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種潛在的高效重組HIV-1?CRF07-BC?gp140免疫原的制備方法。該免疫原基于國(guó)際上已經(jīng)發(fā)表和本實(shí)驗(yàn)室獲得的HIV-1包膜蛋白晶體結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)，具體方法為運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)，獲得gp140的基因片段，將目的基因克隆入真核表達(dá)載體pMT，經(jīng)質(zhì)粒大提去除內(nèi)毒素后，與抗性篩選質(zhì)粒pCoBlast一起共轉(zhuǎn)染黑腹果蠅Schneider2(S2)細(xì)胞，用殺稻瘟菌素(Blasticidin?S)進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，篩選出穩(wěn)定高效分泌表達(dá)gp140的S2細(xì)胞系。擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)鎳柱親和層析和凝膠過(guò)濾層析兩步純化，即可獲得純度很高的gp140。經(jīng)一系列生物化學(xué)和生物物理技術(shù)證明該gp140聚合狀態(tài)均一，抗原反應(yīng)性高，非常適合作為免疫原用于艾滋病亞單位疫苗或多價(jià)聯(lián)合疫苗的研發(fā)。
【專利說(shuō)明】—種潛在的高效重組HIV-1 CRF07-BC gp140免疫原的制備
方法
所屬【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及到基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的免疫原設(shè)計(jì)，分子克隆，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，蛋白質(zhì)表達(dá)純化，分析型超速離心(SV-AUC)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)等技術(shù)。
【背景技術(shù)】:
[0002]艾滋病(accquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染所導(dǎo)致的一種病死率極高的正在全球肆虐的慢性傳染病。HIV分為兩種:HIV-1和HIV-2，HIV-1的毒性與傳染性均高于HIV-2，在全球范圍內(nèi)引發(fā)AIDS的流行，HIV-2則基本只存在于西部非洲部分地區(qū)。世界衛(wèi)生組織網(wǎng)站的數(shù)據(jù)顯示，截止2013年10月，全球艾滋病病毒感染者人數(shù)為3600萬(wàn)，累計(jì)死亡超3600萬(wàn)，2012年新增艾滋病病毒感染者230萬(wàn)，160萬(wàn)人因艾滋病而死亡。到2012年我國(guó)實(shí)際HIV感染人數(shù)已超過(guò)100萬(wàn)，中國(guó)成人流行率為0.1%~0.5%,防控形勢(shì)比較嚴(yán)峻。
[0003]艾滋病的流行已成為嚴(yán)重影響人類健康和全球社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前仍沒(méi)有針對(duì)HIV的特效治療方法，雖然高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療方法(highly activeantiretroviral therapy, HAART)已經(jīng)在減輕患者痛苦、延長(zhǎng)患者壽命等方面取得了一定的效果，但用于治療HIV感染的藥物只能控制病毒復(fù)制，不能徹底清除病毒，而且抗HIV藥物價(jià)格昂貴，具有較嚴(yán)重的副作用，藥物使用不當(dāng)，也會(huì)誘發(fā)耐藥株的產(chǎn)生。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV傳播的重要手段之一，被認(rèn)為是預(yù)防艾滋病的最有效工具。
[0004]流行病學(xué)調(diào)查顯示，HIV-1不同亞型或流行重組型在不同地域的感染者中所占比例有很大差異。而不同型別間免疫原性和抗原性的差異也導(dǎo)致針對(duì)某一亞型病毒的疫苗對(duì)另一亞型的病毒并無(wú)很好的交叉保護(hù)效果。這一情況給HIV疫苗的研發(fā)帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。在我國(guó)，HIV-1最主要的流行亞型或流行重組型是CRF07-BC，CRF08-BC, B’(泰國(guó)B)和CRF01-AE，其中B’ /C重組毒株(CRF07_BC、CRF08_BC)感染比例在全部感染者中逐年上升，所占比已超過(guò)50 %，表明該重組病毒可能獲得了某種傳播優(yōu)勢(shì)而有加速流行的趨勢(shì)，并在傳播過(guò)程中逐漸取代了親代B’和C亞型HIV-1毒株。無(wú)論從B’/C重組株在我國(guó)感染者中所占的比例還是該毒株表現(xiàn)出的傳播優(yōu)勢(shì)來(lái)看，選擇B’ /C重組毒株主要抗原作為疫苗的免疫原都有利于迅速遏制我國(guó)艾滋病的蔓延。
[0005]有效的疫苗通常需要高效的抗體反應(yīng)來(lái)阻斷感染和清除抗原，因此廣譜高效中和抗體的產(chǎn)生對(duì)艾滋病疫苗的成功至關(guān)重要。HIV-1包膜糖蛋白(Env)的前體蛋白gpl60在靶細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起始合成、折疊并伴隨著寡聚化和部分糖基化，隨后被輸送到高爾基體中，經(jīng)furin蛋白酶家族剪切形成成熟的表面糖蛋白gpl20(SU)和跨膜蛋白gp41 (TM)，酶切后gpl20和gp41仍然非共價(jià)地聯(lián)系在一起形成異二聚體并進(jìn)一步糖基化，最終定位于病毒表面，形成由三個(gè)gpl20分子和三個(gè)gp41分子構(gòu)成的三聚體(trimer)刺突(spike)。因?yàn)榘ぬ堑鞍?Env)是病毒唯一暴露于外部環(huán)境中的結(jié)構(gòu)，所以是人體中和抗體識(shí)別并中和的最主要的病毒成分，這樣就使得Env —直以來(lái)都是HIV疫苗研發(fā)的焦點(diǎn)。如何進(jìn)一步提高Env的免疫原性就成了擺在廣大研究者面前的一個(gè)至關(guān)重要的難題。起初，大家的興趣主要集中在單體Env組分一gpl20和gp41上面，結(jié)果卻很不理想。隨后，大家的目光就逐漸轉(zhuǎn)到了類似于天然構(gòu)象的可溶的三聚體Env胞外結(jié)構(gòu)域gpl40上面。研究發(fā)現(xiàn)三聚體的gpl40確實(shí)可以比單體的gpl20觸發(fā)更強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)，并且具有幾乎和完整病毒刺突一樣的全部抗原性質(zhì)，所以三聚體gpl40就成了以誘導(dǎo)中和抗體為主要目標(biāo)的艾滋病疫苗的一個(gè)重要發(fā)展方向。目前效果最好的是BG505S0SIP.664gpl40三聚體，它在野生型序列的基礎(chǔ)上做了許多改變，包括1)A501C和T605C(參照HIV-1HXB2標(biāo)準(zhǔn)株gpl60編號(hào)，下同)替換以在gpl20和gp41胞外域形成二硫鍵，2) I559P替換以增強(qiáng)三聚體的穩(wěn)定性，3)膜近外側(cè)區(qū)(MPER)的刪除以增強(qiáng)三聚體的可溶性和減少高聚體的形成，4)T332N的替換以產(chǎn)生依賴于該糖苷的多個(gè)廣譜中和抗體的表位利于純化，furin的自然位點(diǎn)(REKE)替換為最適位點(diǎn)(RRRRRR，R6)以利于切割完全。但是該三聚體有一個(gè)缺點(diǎn)，二硫鍵的引入雖然在穩(wěn)定gpl20和gp41胞外域相互作用的過(guò)程中起了十分重要的作用，但也有可能將此gpl40鎖定在融合前的構(gòu)象(該gpl40的晶體和電鏡的結(jié)構(gòu)支持此觀點(diǎn))，作為免疫原并不一定利于廣譜中和抗體的產(chǎn)生。
[0006]我們?cè)谧畛Ｒ?guī)的突變掉furin的酶切位點(diǎn)(K/R-X-K/R-R，REKR)以獲得未切割的gpl40 (uncleaved gpl40, gpl40unc)的基礎(chǔ)上,通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計(jì),用柔性linker將向FPPR延長(zhǎng)多個(gè)氨基酸的gp41胞外核心結(jié)構(gòu)域與兩端做了截短的gpl20共價(jià)連接,獲得了高表達(dá)的抗原反應(yīng)性(antigenicity)有較大提高的，生物化學(xué)和生物物理性質(zhì)可以媲美BG505S0SIP.664gpl40的中國(guó)流行株HIV-1CRF07-BC gpl40，為艾滋病病毒疫苗特別是中國(guó)優(yōu)勢(shì)流行病毒疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]本發(fā)明公開了一種潛在的高效重組HIV-1CRF07-BC gpl40免疫原的制備方法，其特征在于我們參照本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的HIV-lCRF07gp41胞外核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)(PDB號(hào):3WFV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)跨膜糖蛋白gp45胞外核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)(PDB號(hào):3WP2和3WMI)以及國(guó)際同行解析的HIV-lgpl20的核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)和HIV-1Env胞外結(jié)構(gòu)域gpl40的晶體結(jié)構(gòu)(PDB號(hào):3TGS、3TIH和4NC0)，通過(guò)向近融合肽區(qū)(fusionpeptide proximal region, FPPR)延長(zhǎng)gp41胞外核心結(jié)構(gòu)域氨基末端七肽重復(fù)NHR(HRl)的多個(gè)氨基酸，再通過(guò)柔性linker與gpl20共價(jià)連接,獲得了 gp41的六股螺旋束(six-helixbundle)閉合程度增加，穩(wěn)定性提高的三聚體gpl40。具體為用GGSGG將gp41的氨基末端七肽重復(fù)NHR(HRl)和羧基末端七肽重復(fù)CHR(HR2)連接起來(lái)，運(yùn)用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(overlap extension PCR)技術(shù)獲得了 gp41胞外核心區(qū)的DNA片段，然后用GSGAG將gp41和gpl20共價(jià)連接起來(lái),運(yùn)用overlap extension PCR技術(shù)獲得了包膜糖蛋白Env胞外結(jié)構(gòu)域的基因片段gpl40，將目的基因克隆入真核表達(dá)載體pMT，經(jīng)質(zhì)粒大提去除內(nèi)毒素后，與抗性篩選質(zhì)粒PCoBlast —起共轉(zhuǎn)染黑腹果蠅Schneiderf (S2)細(xì)胞，用殺稻瘟菌素(Blasticidin S)進(jìn)行陽(yáng)性篩選，篩選出穩(wěn)定高效分泌表達(dá)gpl40的S2細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)后，用鎳柱結(jié)合緩沖液(50mM/LTris-HCl，500mM/LNaCl，pH8.0)替換SFX-1nsect昆蟲培養(yǎng)基，經(jīng)鎳柱親和層析和凝膠過(guò)濾層析(Gelfiltration chromatography,GF)純化，即可獲得目的蛋白gpl40。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)并結(jié)合凝膠過(guò)濾色譜的峰圖初步判定純化得到的三體gpl40的純度和均一性都非常好，且表達(dá)量較大。進(jìn)一步利用分析型超速離心沉降速率法(SV-AUC)測(cè)定該gpl40的絕對(duì)分子量以獲得蛋白在溶液中的聚集狀態(tài)信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液中的gpl40絕大部分都以三聚體形式存在，其它聚合形式包括單體的含量較少，大大優(yōu)于gpl40unc。最后利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)gpl40的抗原反應(yīng)性(antigenicity),發(fā)現(xiàn)該gpl40三體的抗原反應(yīng)性至少比gpl40unc三體高四倍。
[0008]本發(fā)明與gpl40unc三體相比,均一'丨生好,抗原反應(yīng)性(antigenicity)高,生化和物理性質(zhì)可以媲美BG505S0SIP.664gpl40,且針對(duì)目前中國(guó)流行株，非常適合作為免疫原用于艾滋病亞單位疫苗或多價(jià)聯(lián)合疫苗的研發(fā)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1是gpl40構(gòu)建的原理圖。
[0010]圖2 是 BG505S0SIP.664gpl40 的凝膠過(guò)濾圖譜(引用自 Rogier ff.Sanders 等人，2013PLoS Pathog:e1003618)。圖 2A 是 BG505S0SIP.664gpl40 經(jīng) Hiload26/60Superdex200分了篩層析柱純化的圖譜，圖 2B 是經(jīng) BG505S0SIP.664gpl40 經(jīng) Hiload26/60Superdex200分子篩層析柱純化后再重過(guò)SUpeix)Se610/30COlUmn分子篩層析柱的分析圖譜。
[0011]圖3是目的蛋白的凝膠過(guò)濾圖譜與鑒定。圖3A是重組蛋gpl40經(jīng)Hiloadl6/60Superdex200 分子篩層析柱純化的圖譜，圖 3B 是經(jīng) Hiloadl6/60Superdex200分子篩層析柱純化純化后重組蛋白gpl40的SDS-PAGE檢測(cè)，圖3C是gpl40蛋白經(jīng)Hiloadl6/60Superdex200分子篩層析柱純化后再重過(guò)Superdex20010/300分子篩層析柱的分析圖譜。
[0012]圖4是純化后的gpl40蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果。
[0013]圖5是純化的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的gpl40unc的藍(lán)綠非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(BN-PAGE)檢測(cè)(引用自 Norbert Schulke 等人，2002J Virol76:7760-7776)。
[0014]圖6是純化的gpl40的分析型超速離心沉降速率法分析。
[0015]圖7是純化的重組蛋白gpl40與多位艾滋病長(zhǎng)期不進(jìn)展者雪清的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。
[0016]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)敘述。
【具體實(shí)施方式】:
[0017]實(shí)施例1.重組gpl40真核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0018]以CRF07-BC gpl60cDNA 為模板，經(jīng)兩次 overlap extension PCR,獲得了用兩個(gè)不同linker連接的包膜糖蛋白Env胞外結(jié)構(gòu)域(見圖1)的DNA片段gpl40,通過(guò)雙酶切連接的方法將目的基因片段克隆入經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改造過(guò)的pMT/Bip/TEV-HisA載體。通過(guò)將V5表位替換為煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV酶)的酶切位點(diǎn)，使我們能夠用TEV酶除去目的蛋白羧基末端的組氨酸標(biāo)簽^XHis-tag)，使目的蛋白羧基末端盡可能少地帶有不必要的寡肽。經(jīng)過(guò)雙酶切和測(cè)序鑒定正確后(氨基酸和核苷酸序列見序列表)，通過(guò)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行目的質(zhì)粒的大提以提聞質(zhì)粒濃度和去除內(nèi)毒素。
[0019]載體構(gòu)建過(guò)程中用到的引物為，[0020]引物 1: 5，CATGCCATGG GTGTGGAAGGGCGCCACC3，
[0021 ]引物 2:5，TCCTGCCCCTGAGCCGGGCTTGATCTCCACCAC3，
[0022]引物3:5，GGCTCAGGGGCAGGAAGCATCACCCTGACCGTGCAG3，
[0023]引物4:5，ACCGCCTGACCCTCCCTGCTGGTCCTTCAGG3，
[0024]引物5:5，GGAGGGTCAGGCGGTTGGGACAACATGACCTGG3 ’
[0025]引物6:5，CTAGTCTAGAGGCCAGCAGGTCCTTCTC3 ’
[0026]實(shí)施例2.S2細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的S2細(xì)胞系的篩選
[0027]提前一天將細(xì)胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞的匯合度(conf Iuency)達(dá)到60-70%時(shí)用脂質(zhì)體法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin II的說(shuō)明書進(jìn)行，注意重組質(zhì)粒和抗性篩選質(zhì)粒PCoBlast的質(zhì)量比為19: I。細(xì)胞于27°C孵育5小時(shí)后吸出轉(zhuǎn)染液，加入4mL新鮮的SFX-1nsect培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48h，棄去原培養(yǎng)基，加入含有殺稻瘟菌素(終濃度為25ug/mL)的SFX-1nsect培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在加入殺稻瘟菌素篩選后的一周內(nèi)會(huì)大量死亡，少量的貼壁細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長(zhǎng)，大約3周左右，當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到100%時(shí)，即可獲得穩(wěn)定高效分泌表達(dá)重組gpl40的S2細(xì)胞系。
[0028]實(shí)施例3.重組gpl40的表達(dá)純化
[0029]將篩選出的T25S2細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)至T75 培養(yǎng)瓶中(體積比1:5)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)到500mL轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(體積比1: 10)，27°C，120rpm，培養(yǎng)2-3天，當(dāng)細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)，加入硫酸銅誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(終濃度為0.5mmol/L)，3天后收集。將S2細(xì)胞收集到300mL的離心桶中，4000rpm，4°C離心15min。收集細(xì)胞上清，經(jīng)0.22 μ m的濾膜過(guò)濾后，放至Amicon Stirred Cell8003型超濾杯中濃縮蛋白，壓縮50mL時(shí),用鎳柱結(jié)合緩沖液(50mM/L Tris-HCl, 500mM/L NaCl, pH8.0)稀釋10倍后，將蛋白液收集至50mL離心管中，20000rpm，4°C離心20min，收集上清，經(jīng)0.22 μ m的濾膜過(guò)濾后，將上清液進(jìn)行鎳柱親和層析純化，用鎳柱洗滌緩沖液(50mM/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl，20mM咪唑，pH8.0)沖洗三個(gè)柱長(zhǎng)，洗去非特異性吸附的雜蛋白，最后用鎳柱洗脫緩沖液(50mM Tris-HCL, 500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)進(jìn)行洗脫，收集洗脫組分，用10%的SDS-PAGE結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)分析。用Amicon Ultra超濾管將洗脫組分用鎳柱結(jié)合緩沖液稀釋至咪唑(imidazole)濃度小于50mM，并濃縮至3mL，加入200uL預(yù)先純化好的TEV蛋白酶，20°C酶切過(guò)夜，用Westernblot檢驗(yàn)酶切效率至100%。因該蛋白無(wú)法用離子交換層析純化，所以將酶切完全后的樣品濃縮至1.5mL,上樣至Hiloadl6/60Superdex200分子篩層析柱純化,緩沖液同鎳柱結(jié)合緩沖液，需預(yù)先平衡一個(gè)柱體積，流速lmL/min，柱壓設(shè)為0.3MPa，收集洗脫組分，用10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的純度。將收集的洗脫組分濃縮至0.5mL，再上樣至分析型SuperdeX20010/300分子篩層析柱，緩沖液同鎳柱結(jié)合緩沖液，需預(yù)先平衡一個(gè)柱體積，流速0.5mL/min,柱壓設(shè)為1.5MPa。結(jié)果見圖3。
[0030]實(shí)施例4.HIV-lgpl40 蛋白的 Western blot 分析
[0031]將2ug純化的去除6XHis標(biāo)簽的gpl40蛋白進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以羊抗gpl20多克隆抗體作為第一抗體(NIH惠贈(zèng)，I: 10000稀釋)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG為第二抗體(I: 10000稀釋)，進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果見圖4。
[0032]實(shí)施例5.分析型超速離心實(shí)驗(yàn)[0033]沉降速率(Sedimentationvelocity, SV)實(shí)驗(yàn)在 Beckman/Coulter XL-1 分析型超速離心機(jī)上進(jìn)行。將待測(cè)的純化后的gpl40樣品用Superdex20010/300分子篩換至超速離心緩沖液(50mMTris，pH8.0，IOOmM NaCl,ImMEDTA)中，超濾濃縮。SV實(shí)驗(yàn)選用雙通道樣品池和藍(lán)寶石窗口進(jìn)行。約14.9 4 11純化的8?140蛋白在41:42000印111進(jìn)行離心沉降。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用280 nm紫外檢測(cè)器收集。蛋白質(zhì)比重和緩沖液黏度、密度用SEDNTERP (http://www.rasmb.bbr1.0rg/)軟件計(jì)算，SV數(shù)據(jù)用Sedfit軟件處理。結(jié)果見圖6。
[0034]實(shí)施例6.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELASA)檢測(cè)gpl40的抗原反應(yīng)性(antigenicity)
[0035]將4ug gpl40unc和gpl40分別進(jìn)行一系列4倍倍比稀釋(3200倍起)，包被96孔酶標(biāo)板，用中國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)提供的艾滋病長(zhǎng)期不進(jìn)展者的血清(I: 100稀釋)作為第一抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG為第二抗體(I: 1000稀釋)，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(3, 3’，5, 5’ -Tetramethylbenzidine, TMB)顯色完成后，加入2M硫酸終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)下讀板，制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖7。
【權(quán)利要求】
1.一種針對(duì)HIV-ι中國(guó)流行株CRF07的高效重組gpl40免疫原的制備方法。其特征在于針對(duì)中國(guó)最廣泛的流行株CRF07，并且是在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)的。獲得的gpl40均一性好，抗原反應(yīng)性高，非常適合作為免疫原用于艾滋病亞單位疫苗或者是多價(jià)聯(lián)合疫苗的研發(fā)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于載取的gpl20的片段為44-493位氨基酸(參照HIV-1HXB2標(biāo)準(zhǔn)株gpl60編號(hào)，下同)，截取的gp41的NHR片段為534-591位氨基酸，截取的CHR片段為623-662位氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于連接gp41NHR和 CHR 的 linker 為 GGSGG 連接，連接 gpl20 與 gp41 的 linker 為 GSGAG0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于通過(guò)將pMT載體的V5表位替換為煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV酶)的酶切位點(diǎn)，使我們能夠用TEV酶除去目的蛋白羧基末端的組氨酸標(biāo)簽^XHis-tag)，使目的蛋白羧基末端盡可能少地帶有非必要的氨基酸殘基，更適合用作免疫原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于用重疊延伸PCR技術(shù)獲得該gpl40的基因片段，將目的基因克隆入真核表達(dá)載體pMT，經(jīng)質(zhì)粒大提去除內(nèi)毒素后，與抗性篩選質(zhì)粒PCoBlast —起共轉(zhuǎn)染黑腹果蜆Schneider2 (S2)細(xì)胞,用殺稻痕菌素(Blasticidin S)進(jìn)行陽(yáng)性篩選，篩選出穩(wěn)定高效分泌表達(dá)gpl40的S2細(xì)胞系。擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)鎳柱親和 層析和凝膠過(guò)濾層析兩步純化，即可獲得高純度的gpl40。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK103992396SQ201410160156
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】劉新奇, 段良偉 申請(qǐng)人:南開大學(xué)