一種海洋微藻來源的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種新型的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，即從球等鞭金藻中制備得到的一種ACE酶抑制肽，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。本發(fā)明提供了一種海洋微藻來源的高活性血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備方法。目前血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的來源主要是食品，以及紫菜等大型海藻，從餌料微藻中未見報(bào)道。本發(fā)明獲得的一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的活性多肽，其結(jié)構(gòu)為Tyr--Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys。該結(jié)構(gòu)新穎，具有分子量小，易被人體吸收的特點(diǎn)。
【專利說明】一種海洋微藻來源的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于活性多肽篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，SP一種從海洋微藻球等鞭金藻中分離得到的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽。
【背景技術(shù)】
[0002]血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin converting enzyme, ACE)是一種鋅金屬蛋白酶，是羧基二肽酶，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中重要的蛋白酶之一。對(duì)人體血壓調(diào)節(jié)有著重要的作用，通過作用于血管緊張素I的末端去掉His-Leu生成血管緊張素II，它能夠使動(dòng)脈血管平滑肌收縮，迅速引起血壓上升。抑制ACE活性是一種使血壓下降的有效的方法。當(dāng)前治療高血壓的藥物大多是化學(xué)合成品，存在一些不良反應(yīng)，如咳嗽、味覺功能紊亂及皮疹等副作用。食源性蛋白為原料制得的ACE抑制肽由于具有安全性高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，是降壓藥物研發(fā)的重要方向。[0003]食品來源的ACE抑制劑由于其原料易得，一直受到人們的關(guān)注。如高冬芳等(食品科學(xué)，2011,32 (7):7)利用螺旋藻制備ACE抑制肽其IC5tl值為74.6 μ g/mL,但具體結(jié)構(gòu)未知。劉淑集等(食品科學(xué)，2011，32(2):213)利用壇紫菜制備ACE抑制肽，其IC5tl值為
0.67mg/mL，其氨基酸結(jié)構(gòu)也不確定。但是針對(duì)海洋微藻，特別是餌料微藻來源的ACE抑制肽方面的研究還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種新型的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，即從球等鞭金藻中制備得到的一種ACE酶抑制肽，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明首先提供一種多肽，其氨基酸序列為Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys (SEQID NO:1)；
[0006]上述多肽作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的應(yīng)用，包括用于制備治療高血壓的制品;
[0007]所述的制品為包含有藥理有效濃度的上述多肽的食品或藥品；
[0008]本發(fā)明的多肽是從球等鞭金藻中分離的，具體分離步驟如下:
[0009](I)球等鞭金藻蛋白的制備:
[0010]將球等鞭金藻按照1:15加入到1.5%氯化鈉溶液中，調(diào)整為pH為6.0-8.0，超聲波提取，破碎后4°C、5000r/min離心15min,分離上清液；沉淀的藻泥加入氯化鈉溶液超聲波再提取2次，合并上述提取的上清液，冷凍干燥即為粗蛋白；
[0011]⑵酶解:
[0012]將步驟(1)中粗蛋白，按照酶和粗蛋白比為6:100加入酶，溶液pH調(diào)整為8.0，在溫度為50°C的條件下進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為3-6h ;酶解完成后在90°C下滅活酶lOmin，然后取上清液；
[0013](3)分離:[0014]取步驟(2)中酶解得到得上清液，用0.45μπι微孔濾膜過濾，將樣品上樣于平衡好的S印hadex G-25凝膠色譜柱(:φ2.6Χ 70 em )，用醋酸-醋酸鈉緩沖液洗柱至220nm處吸收峰回到基線，用醋酸-醋酸鈉緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，洗脫的流速是0.5mL/min。收集各個(gè)成分進(jìn)行冷凍干燥并檢測(cè)活性，在-20°C條件下保存；
[0015]⑷純化:
[0016]取步驟(3)冷凍干燥的粉末，進(jìn)過AKTA purifier純化。流動(dòng)相A相:純水；B相:甲醇，從0-100%梯度洗脫，流速為l.0ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，收集各個(gè)組分，冷凍干燥并檢測(cè)活性。收集保留時(shí)間約為24min的色譜峰，冷凍干燥，得到氨基酸序列為Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。
[0017]本發(fā)明所述的一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn):(I)本發(fā)明提供了一種海洋微藻來源的高活性血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備方法。目前血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的來源主要是食品，以及紫菜等大型海藻，從餌料微藻中未見報(bào)道。(2)本發(fā)明獲得的一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的活性多肽，其結(jié)構(gòu)為Tyr--Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys。該結(jié)構(gòu)新穎,具有分子量小，易被人體吸收的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】[0018]圖1:本發(fā)明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的治療效果比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
[0020]實(shí)施例1血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的分離純化
[0021](I)球等鞭金藻蛋白的制備:
[0022]將球等鞭金藻按照1:15(1克藻粉加入15毫升氯化鈉溶液中)加入到1.5% (w/V)氯化鈉溶液中，調(diào)整pH為7.0，超聲波提取，破碎后高速冷凍離心41:、50001'/1^11離心15min，離心分離上清液，沉淀的藻泥加入氯化鈉溶液超聲波再進(jìn)行破碎2次間隔時(shí)間為ls，合并上述破碎后所得的全部上清液，冷凍干燥即為粗蛋白。
[0023](2)酶解:
[0024]將步驟⑴中粗蛋白，按照酶和粗蛋白比為6:100加入酶活性為10000U/g的trypsin，溶液pH調(diào)整為8.0，底物蛋白的濃度為5.5g/100ml，在溫度為50°C的條件下進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為3h。酶解完成后在90°C下滅酶活lOmin，然后取上清液。
[0025](3)分離:
[0026]取步驟(2)中酶解得到得上清液，用0.45μπι微孔濾膜過濾，將樣品上樣于平衡好的Sephadex G-25凝膠色譜柱(φ2.6Χ70 cm ),用醋酸-醋酸鈉緩沖液洗柱至220nm處吸收峰回到基線，用醋酸-醋酸鈉緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，洗脫的流速是0.5mL/min。收集保留時(shí)間約為24min的色譜峰，冷凍干燥，得到血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。
[0027](4)純化:
[0028]取步驟(3)冷凍干燥的粉末,經(jīng)過AKTA purifier純化。流動(dòng)相,A相:純水；B相:甲醇，從0-100%梯度洗脫，流速為1.0ml/mino檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，收集各個(gè)組分，冷凍干燥并檢測(cè)活性。
[0029](5)活性檢測(cè):
[0030]將ACE 底物 Hip-His-Leu 溶于 0.lmol/L 的硼酸鹽緩沖液(含 0.3M NaCl, pH8.3)，配置成5mM的濃度。取50 μ L上述溶液與20 μ L ACE抑制肽混合，在37 °C恒溫水浴中預(yù)熱5min。隨后加入10μ L上述ACE溶液，37°C反應(yīng)30min。加入100 μ LlM HCl溶液終止反應(yīng)，并加入硼酸鹽緩沖液至0.5mL。所有測(cè)定都重復(fù)三次。ACE的抑制程度按如下公式計(jì)算:[0031 ] ACE 抑制活性 ％ = (Ab-Aa) / (Ab-Ac) X 100 %
[0032]式中:Aa:ACE及ACE抑制肽都存在的條件下的吸光度；Ab:ACE抑制肽不參與反應(yīng)的條件下測(cè)得的吸光度'K =ACE不參與反應(yīng)的條件下的吸光度。最終測(cè)定得到血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的體外ACE抑制IC5tl為36.1 μ M0
[0033]實(shí)施例2血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的序列分析
[0034]取實(shí)施例1制備得到的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，首先進(jìn)行了該活性多肽的氨基酸成分分析，結(jié)果表明其主要氨基酸為Met、Lys> Leu三種氨基酸，也含有Tyr、Gly、Asp等。采用MALD1-T0F/T0F-MS/MS分析多肽的氨基酸序列，分析得到活性多肽分子量為839.4061Da,測(cè)定氛基酸序列為:Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu_Lys。對(duì)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行了 De novo測(cè)序分析，結(jié)果與以上數(shù)據(jù)吻合，確認(rèn)該多肽為Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys (SEQ IDNO:1)，為新型的活性多肽結(jié)構(gòu)。
[0035]實(shí)施例3血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的效果
[0036]將實(shí)施例1中所獲得的海洋微藻來源的降壓肽直接灌胃到原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，檢測(cè)其對(duì)SHR血壓的影響。實(shí)驗(yàn)選用大鼠24只，體重240 ± 20克，大鼠隨機(jī)分成3個(gè)組，每組8只，其中設(shè)空白對(duì)照組(注射同樣體積的生理鹽水)、ACE酶抑制組和合成降壓藥卡托普利的陽性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)溫度20°C，相對(duì)濕度70%，預(yù)飼養(yǎng)I周。給藥劑量為IOmg/kg，時(shí)間24天，在第0、2、4、6、8h測(cè)定一次尾動(dòng)脈收縮壓。結(jié)果表明，ACE抑制肽組和空白對(duì)照組相比效果顯著(P〈0.05)。對(duì)照組的大鼠血壓基本穩(wěn)定在180-190mmHg,而在實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組大鼠的血壓降低到165mmHg和155mHg ;結(jié)果表明本發(fā)明制備的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽具有治療高血壓的效果。而且，采用人工合成方式合成的多肽(氨基酸序列為SEQ ID NO:1)對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)也具有明顯的治療效果(圖1)。
[0037]因此，本發(fā)明從球等鞭金藻中提取純化制備得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的多肽，具有很好的抗血壓活性，并且安全性能高，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種多肽，其特征在于，所述的多肽的其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2.權(quán)利要求1所述的多肽作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的多肽在制備治療或預(yù)防高血壓的制品中的應(yīng)用。
4.一種治療或預(yù)防高血壓的制品，其特征在于，所述的制品為包含有藥理有效濃度的權(quán)利要求1所述的多肽的食品或藥品。
5.權(quán)利要求1所述的多肽是從球等鞭金藻中分離的。
6.權(quán)利要求1所述的多肽的制備方法，其步驟如下: 1)球等鞭金藻蛋白的制備: 將球等鞭金藻按照1:15加入到1.5%氯化鈉溶液中，調(diào)整為pH為6.0-8.0，超聲波提取，破碎后4°C、5000r/min離心15min,分離上清液；沉淀的藻泥加入氯化鈉溶液超聲波再提取2次，合并上清液，冷凍干燥即為粗蛋白； 2)酶解: 將步驟I)中粗蛋白，按照酶和粗蛋白比為6:100加入酶，溶液pH調(diào)整為8.0，在溫度為50°C的條件下進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為3-6h ;酶解完成后在90°C下滅活酶lOmin，然后取上清液； 3)分離: 取步驟2)中酶解得到得上清液，用0.45 μ m微孔濾膜過濾，將樣品上樣于平衡好的Sephadex G-25凝膠色譜柱,用醋酸-醋酸鈉緩沖液洗柱至220nm處吸收峰回到基線,用醋酸-醋酸鈉緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，洗脫的流速是0.5mL/min ;收集各個(gè)成分進(jìn)行冷凍干燥并檢測(cè)活性，在-20°C條件下保存； 4)純化: 取步驟3)冷凍干燥的粉末,進(jìn)過AKTA purifier純化,流動(dòng)相A相:純水；B相:甲醇，從0-100%梯度洗脫，流速為l.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，收集各個(gè)組分，收集保留時(shí)間約為24min的色譜峰，冷 凍干燥完成制備。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK103923177SQ201410172674
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月26日
【發(fā)明者】徐年軍, 吳昊, 孫雪, 余虹 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)