黃鱔雌激素受體α基因、編碼蛋白及酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明采用RT-PCR方法獲得黃鱔性腺中ERα序列，選擇其抗原性較強(qiáng)的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的cDNA序列作為模板克隆到長(zhǎng)約945bp的序列，并將其克隆到pMAL-c2x表達(dá)載體中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，Amylose-sepharose柱的純化，獲得了較純的具有免疫活性的重組蛋白，采用FactorXa蛋白酶切、進(jìn)一步純化后，獲得了可作為免疫原的ERα表達(dá)蛋白。免疫小鼠后，獲得較高滴度的抗血清，并初步進(jìn)行了免疫組化研究，表明該抗血清能特異與黃鱔性腺中的ERα蛋白結(jié)合，在卵母細(xì)胞膜上呈陽(yáng)性反應(yīng)，為進(jìn)一步研究黃鱔性別發(fā)展中雌激素及其ERα等作用打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明還以此抗體為基礎(chǔ)制備了ELISA檢測(cè)試劑盒。
【專利說(shuō)明】黃鱔雌激素受體α基因、編碼蛋白及酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及黃鱔雌激素受體α基因、編碼蛋白及酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]黃鱔，又名鱔魚,主要生活在亞洲地區(qū)，目前中國(guó)只有I種，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。自從七十年代開(kāi)始人工養(yǎng)殖以來(lái)，野生黃鱔苗種便被大量捕捉，同時(shí)環(huán)境污染等造成黃鱔野生資源日漸減少，養(yǎng)殖苗種嚴(yán)重短缺。黃鱔發(fā)育周期中存在性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，開(kāi)始發(fā)育時(shí)黃鱔為雌性，性成熟產(chǎn)卵后，雄性生殖細(xì)胞開(kāi)始發(fā)育，形成間性階段，逐漸發(fā)育成雄性黃鱔。
[0005]黃鱔發(fā)育周期中性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象是劉健康等首先發(fā)現(xiàn)的(劉健康，顧國(guó)彥.鱔魚性逆轉(zhuǎn)時(shí)生殖腺組織的改變，水生生物學(xué)報(bào)，1951，2 (1-2):85-109)，而后肖亞梅(肖亞梅，劉筠.黃鱔由間性發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌园l(fā)育的細(xì)胞生物學(xué)研究.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1995，19(4):297-301 ;肖亞梅.黃鱔繁殖生物學(xué)研究:1.黃鱔的雌性發(fā)育.湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào).1995，18(4):45-52)等詳細(xì)的研究了黃鱔性腺發(fā)生與分化的過(guò)程，從而表明黃鱔開(kāi)始發(fā)育時(shí)為雌性，雌性性成熟產(chǎn)卵后，性腺內(nèi)卵細(xì)胞逐步敗育，卵巢結(jié)構(gòu)退化，同時(shí)雄性生殖細(xì)胞開(kāi)始發(fā)育，形成間性階段，通過(guò)這一階段黃鱔過(guò)渡到雄性發(fā)育，最后形成雄性的黃鱔。黃鱔性別決定基因或在基因水平上調(diào)控黃鱔性逆轉(zhuǎn)一直以來(lái)都是研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)，而性別決定又是一個(gè)涉及多基因不同時(shí)空的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程。
[0006]性類固醇激素(sex steroid hormone)是調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸的發(fā)育成熟及維持各項(xiàng)功能的重要激素。動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性類固醇激素主要有雄激素、雌激素和孕激素三種，它們的生理功能主要都是通過(guò)經(jīng)典的雌激素核受體介導(dǎo)的。雌激素受體與雌激素特異性地結(jié)合后介導(dǎo)雌激素應(yīng)答元件(estrogen respond elements,EREs)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。硬骨魚類的ER種類和生理功能等似乎比高等脊椎動(dòng)物更為復(fù)雜。首個(gè)魚類ER α是由Pakdel等從虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腦中分離得到的,迄今為止,有10余種魚類的ERa已進(jìn)行了研究報(bào)道。
[0007]激素的酶聯(lián)免疫測(cè)定具有無(wú)放射性污染，標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記酶來(lái)源廣泛、經(jīng)濟(jì)，靈敏度、特異性與放免測(cè)定相當(dāng)?shù)忍攸c(diǎn)，使得激素的酶免測(cè)定方法有望替代放免測(cè)定技術(shù)。但酶聯(lián)免疫測(cè)定需要較多的激素標(biāo)準(zhǔn)品，用常規(guī)的垂體抽提技術(shù)需要大量的垂體。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了黃鱔雌激素受體α蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。[0010]編碼上述蛋白質(zhì)的黃鱔雌激素受體α基因。
[0011]所述的黃鱔雌激素受體α基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]本發(fā)明還提供了含有上述黃鱔雌激素受體α基因的載體。
[0013]上述的載體，是指在EcoR I和Hind III位點(diǎn)之間插入上述黃鱔雌激素受體α基因的 pMAL。
[0014]本發(fā)明還提供了用于黃鱔雌激素受體α基因的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(1)抗原的制備:將黃鱔雌激素受體α基因插入載體中，并在大腸桿菌中表達(dá)，得到的ERa重組蛋白，經(jīng)純化后作為抗原；
(2)抗體的制備:將(I)中所得到的抗原免疫鼠制備得到抗黃鱔雌激素受體α抗體；
(3)抗體的純化:對(duì)(2)中所得的抗體經(jīng)離心、沉淀、脫鹽，得純化抗體；
(4)純化抗體的標(biāo)記:用酶標(biāo)記(3)中所得的純化抗體，得到酶標(biāo)抗體；
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:用不同濃度的抗原包被在固相載體上，通過(guò)與(4)中所獲得的酶標(biāo)抗體結(jié)合后，進(jìn)行測(cè)定，繪制抗原濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)樣本測(cè)定:對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)樣本中抗原的含量。
[0015]進(jìn)一步地，步驟(1)中是通過(guò)將黃鱔雌激素受體α基因插入至pMAL_c2x的EcoR
1、Hind III的位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBl，獲得融合蛋白；再對(duì)融合蛋白的MBP蛋白酶切后，得到ER α重組蛋白。
[0016]進(jìn)一步地，所述的步驟(4)中，所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶。
[0017]本發(fā)明還提供了黃鱔雌激素受體α的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括有上述的黃鱔雌激素受體α蛋白質(zhì)及其對(duì)應(yīng)的抗體，所述的抗體是通過(guò)黃鱔雌激素受體α蛋白質(zhì)在小鼠免疫反應(yīng)制備得到。
[0018]本發(fā)明還提供了黃鱔雌激素受體α基因在黃鱔ERa受體檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0019]有益效果
本試驗(yàn)采用RT-PCR方法獲得黃鱔性腺中ERa序列，選擇其抗原性較強(qiáng)的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的cDNA序列作為模板克隆到長(zhǎng)約945 bp的序列，并將其克隆到pMAL_c2x表達(dá)載體中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，Amylose-sepharose柱的純化,獲得了較純的具有免疫活性的重組蛋白，采用Factor Xa蛋白酶切、進(jìn)一步純化后，獲得了可作為免疫原的ER α表達(dá)蛋白。免疫小鼠后，獲得較高滴度的抗血清，并初步進(jìn)行了免疫組化研究，表明該抗血清能特異與黃鱔性腺中的ERa蛋白結(jié)合，在卵母細(xì)胞膜上呈陽(yáng)性反應(yīng)，為進(jìn)一步研究黃鱔性別發(fā)展中雌激素及其ERa等作用打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明還以此抗體為基礎(chǔ)制備了 ELISA檢測(cè)試劑盒。
[0020]
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021 ] 圖1是RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖，M泳道是marker，I泳道是RT-PCR產(chǎn)物；
圖2是重組質(zhì)粒pMAL-ER α的限制性酶切分析中的電泳圖，M泳道是marker，I泳道是PMD18-T-ER α 經(jīng) EcoRI 和 Hind III雙酶切產(chǎn)物；
圖3是鑒定大腸桿菌中ERa融合蛋白的SDS-PAGE分析的電泳圖，I泳道是E.coliTBl; 2-3 泳道:TBl/pMAL 分別經(jīng)(λ 3M、IM IPTG 誘導(dǎo) 4h ； 4 泳道:TBl/pMAL-ER α 經(jīng) 0.3MIPTG 誘導(dǎo) 4h。
[0022]圖4是蛋白免疫印跡試驗(yàn)中的電泳圖，M泳道是marker ；1泳道是TBl/pMAL誘導(dǎo)表達(dá)的MBP蛋白2泳道是TBl/pMAL-ER α誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白；3泳道誘導(dǎo)的TBl裂解物。
[0023]圖5是小鼠免疫ER α和生理鹽水后的抗體滴度分布
圖6Α~圖6D是鼠抗ERa多克隆抗體進(jìn)行黃鱔性腺免疫組化分析，其中，圖6Α:卵巢、圖6Β:卵巢對(duì)照、圖6C:精巢、圖6D:精巢對(duì)照(圖中，O:卵，GF:生殖褶，SP:精小囊)
圖7Α是ERa在黃鱔性腺組織中的基因蛋白水平表達(dá)的western blot分析結(jié)果；橫坐標(biāo):1卵巢.2.精巢；縱坐標(biāo):基因與對(duì)應(yīng)β -actin的灰度比值
圖7B是ERa在黃鱔性腺組織中的蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果；I卵巢.2.精巢；
圖8是試劑盒線性驗(yàn)證的線性關(guān)系圖。
[0024]
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例 僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0026]實(shí)施例1黃錯(cuò)雌激素受:體Ct序列的克隆、蛋白的表達(dá)
1.材料
1.1實(shí)驗(yàn)材料:
實(shí)驗(yàn)魚:黃鱔購(gòu)自無(wú)錫中橋菜市場(chǎng)，組織為性腺。小鼠:購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的ICR小鼠。
[0027]1.2試劑:T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、凝膠回收試劑盒、EcoR 1、Hind III等購(gòu)自大連寶生物公司，聚丙烯酰胺、RNase抑制劑等購(gòu)自上海申能博彩生物工程公司，Amylose-sepharose柱、Factor Xa、抗麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)單抗均購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)(北京)公司，其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。弗氏完全、不完全佐劑，ELISA反應(yīng)板等均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。
[0028]1.3儀器:PCR儀購(gòu)自BioRad公司，實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄和蛋白分析使用的是柯達(dá)公司的凝膠成像系統(tǒng)，DNA序列分析使用DNAstar軟件，全自動(dòng)測(cè)序工作由上海博尚生物工程公司完成。酶標(biāo)測(cè)定儀購(gòu)自TECAN公司。
[0029]1.4質(zhì)粒與菌株:pMD18_T載體購(gòu)自大連寶生物公司，表達(dá)質(zhì)粒pMAL_c2x、受體細(xì)菌TBl和JM109為本室保存。
[0030]2 方法
類固醇激素17-β雌二醇(estradiol，E2)是介導(dǎo)生殖、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥、代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種生理功能的重要調(diào)節(jié)因子。介導(dǎo)E2參與這些功能的就是雌激素受體。雌激素受體a (ERa )是1986年Green等從人乳腺癌細(xì)胞中純化分享得到的，是最先被研究的一種雌激素受體。而在硬骨魚中，首個(gè)魚類ERa是hkM篤{Oncorhynchus mykiss)中分離得到的。至今為止已經(jīng)在虹鱒{Oncorhynchus mykiss)、金MXGareissius auratus)>斑馬魚rerio)、金頭鯛atfraiiAs)、日本獲鱺 C4^§ui77a j'a/7o/?ica )、歐鰨(.Solea solea)、舌鬼皆U)icentrarchus 7a^rar)和奧利亞羅非魚等魚中進(jìn)行了 ERa基因的分離、克隆和組織表達(dá)等方面的研究和報(bào)道。目前黃鱔的ERa還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道，因此我們根據(jù)其他魚類ER α基因的序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物。
[0031]2.1引物設(shè)計(jì)與RT.PCR反應(yīng):采用Primer 5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)引物:
上游引物:5，- gactacatgtgccctgctacaaaycartgyac _3，(SEQ ID N0.1)
下游引物:5，- catgctgtacaggtgctccatnccytt-3，(SEQ ID N0.2)
y是t或者c
反轉(zhuǎn)錄引物AP購(gòu)自上海生工生物工程公司。
[0032]模板為提取自黃鱔性腺總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板及合成的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94 °C預(yù)變性30s，59°C退火 45s，72 °C延伸 1.5min，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 7min。
[0033]2.2PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定:
PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，回收符合預(yù)期目的的片段，將回收產(chǎn)物與PMD18-T載體4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機(jī)挑取細(xì)菌提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR
1、Hind III雙酶切鑒定后，將陽(yáng)性克隆送交上海博尚生物公司進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAstar、CLUSTAL X等軟件進(jìn)行分析。
[0034]RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳表明擴(kuò)增到約945bp的目的片段，電泳圖如圖1所示，這與預(yù)期大小相符。將回收產(chǎn)物連接PMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，隨機(jī)挑取10個(gè)克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRI和Hind III雙酶切，酶切結(jié)果表明pMD18_T_ER α酶切后有一條約945bp的條帶，表明ERa成功克隆入T載體中，將重組質(zhì)粒pMD18_T- ERa送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID N0.3所示，測(cè)序結(jié)果同樣表明RT-PCR擴(kuò)增到的片段為ER α。
[0035]通過(guò)從黃鱔的卵巢中克隆到ERa基因的部分比較保守的序列，同源比對(duì)表明該序列與其他魚類的ERa基因具有較高的同源性，因此可確認(rèn)該基因就是黃鱔的ERa基因。
[0036]2.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建
將正向連接的pMD18-T-ERa克隆和原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL_c2x分別用EcoR 1、Hind III37°C雙酶切，電泳回收ER片段和線性化pMAL-c2x質(zhì)粒，按照T4 DNA連接酶的說(shuō)明書設(shè)計(jì)連接反應(yīng)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pMAL- ER a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機(jī)挑取5個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定:提取質(zhì)粒后再用上述酶進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)有大小約為945bp的目的片段，表明成功的構(gòu)建了表達(dá)載體pMAL-ER α。
[0037]2.4目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)、鑒定
將表達(dá)質(zhì)粒pMAL-ER α和空載體質(zhì)粒pMAL_c2X分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBl，轉(zhuǎn)化菌在含氨芐青霉素(lOOμg/ml)的2XYT培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。第二天按1:100接種擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C振蕩培養(yǎng)至0D 600值達(dá)到0.6左右，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度分別為0.3或Immol/L，繼續(xù)37°C輕度振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，4°C離心(5000rpm，5min)收集菌體。采用IXPBS洗滌沉淀兩次，最后加入適量的IXPBS將菌體重新懸浮。在菌體的懸浮物中加入等體積的
2X SDS凝膠加樣緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH6.8 ；200mM 二硫蘇糖醇；4%SDS ；0.2%溴酚藍(lán)；20%甘油)。將樣品置于沸水中煮沸5分鐘，破碎細(xì)胞，使蛋白質(zhì)完全變性，再進(jìn)行12%濃度的SDS-PAGE電泳，電泳后在考馬斯亮藍(lán)R-250中染色。電泳結(jié)果如圖3所示。
[0038]由圖3可知，加入IPTG誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)入載體pMAL的細(xì)菌總蛋白提取物中表達(dá)了分子量約為42.5kD的蛋白條帶(圖3泳道2、3)，而轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌總蛋白提取物中出現(xiàn)了分子量約為78.1kD (圖3泳道4)新的蛋白質(zhì)。由于pMAL表達(dá)質(zhì)粒本身編碼的MBP分子量為42.5kD，而ERa分子量約為35.6kD，因此理論上融合蛋白的分子量應(yīng)約為78.1kD0這與電泳結(jié)果相一致，表明重組表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，目的蛋白得到表達(dá)，而大腸桿菌TBl中沒(méi)有相應(yīng)的蛋白表達(dá)。目的蛋白表達(dá)量經(jīng)軟件分析，約達(dá)到了細(xì)菌表達(dá)蛋白總量的42.3%。以抗MBP蛋白的抗血清進(jìn)行的Western blot試驗(yàn)表明在大小為42.5和78.1KD處可見(jiàn)兩條清楚的蛋白條帶(見(jiàn)圖4中泳道2、3)。SEQ ID N0.3推導(dǎo)出的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0039]2.5融合蛋白的獲得、純化及裂解 將表達(dá)質(zhì)粒pMAL-ER α和空載體質(zhì)粒pMAL_c2X分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBl，轉(zhuǎn)化菌在含氨芐青霉素(100μ g/ml)的2XYT培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。再取過(guò)夜培養(yǎng)的IOml細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)于IL LB (含葡萄糖)中，37°C搖振培養(yǎng)3h后，加入IPTG至終濃度為0.3mM，再繼續(xù)培養(yǎng)2h，4000g離心20min收集菌體，重懸于50ml柱緩沖液中。加入終濃度為lmg/mL溶菌酶，冰浴30min。最后加入終濃度為5 μ g/mL DNA酶和RNA酶，4°C孵育lOmin。9000g離心30min，轉(zhuǎn)移上清備用，上清中含有表達(dá)的重組蛋白。
[0040]將上清上樣于平衡好的Amylose-sepharose親和柱,平衡緩沖液為IX PBS (140mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.3)，平衡至基線后，用洗脫緩沖液(50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0)洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE電泳檢測(cè)，只有分子量為78.1kD左右的單一條帶，比MBP蛋白的分子量明顯偏大，表明純化得到的融合蛋白效果較好。
[0041]取純化好的重組蛋白中加入Factor Xa至終濃度為200 μ g / mL,室溫作用4h，去除BMP蛋白，同上過(guò)Amylose-sepharose親和柱,用平衡緩沖液洗脫，同樣作SDS-PAGE電泳檢測(cè)，呈單一的分子量為35.6kD條帶。
[0042]相關(guān)研究表明大腸桿菌中外源基因表達(dá)的蛋白主要以包涵體形式存在，為了得到活性較強(qiáng)表達(dá)量高的可溶性蛋白，需要對(duì)包涵體進(jìn)行一系列的變性和復(fù)性的過(guò)程才能獲得有一定活性的目的蛋白，本研究采用的原核表達(dá)系統(tǒng)為商品化的pMAL-c2x載體，該載體帶有利于純化的MBP蛋白，該標(biāo)簽蛋白很容易被蛋白酶切割從而分離掉，同時(shí)其商品化的Amylose-sepharose純化柱子純化效率很高，因此我們得到了較純的重組表達(dá)蛋白。
[0043]實(shí)施例2 ERa受體蛋白檢測(cè)試劑盒的制備
2.1表達(dá)產(chǎn)物抗血清的制備
將回收的ERa重組蛋白與適量的I XPBS混合后，取0.2ml (約20 μ g的抗原)腹腔注射6只雌性BALB/c小鼠(4-5周齡)，在免疫小鼠之前，先采集部分血樣，作為陰性血清。每?jī)芍苊庖咭淮?，第一次免疫后開(kāi)始采血(小鼠在采血前數(shù)小時(shí)應(yīng)予以禁食)。采集血樣收集于經(jīng)滅菌的、不含抗凝劑的離心管中放置于4°C冰箱中過(guò)夜，使之凝固，析出淡黃色抗血清。將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500g離心10min，吸出上清液合并于收集到的抗血清管中。抗血清部分保持于_70°C冰箱中備用。[0044]2.2抗血清的測(cè)定
2.2.1 直接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
將ER α重組蛋白(抗原)稀釋于包被緩沖液(0.1M Na2CO3，PH9.6)中，終濃度為5ng/口1，每孔加5(^1。并設(shè)立空白對(duì)照組(只加包被緩沖液)。4°C包被過(guò)夜后。用IXPBST(I XPBS+(0.1%) Tween 20)于室溫下洗滌三次，每次5min。然后每孔加200 μ I封閉液(10%的小牛血清溶于IXPBS中)，4°C冰箱中封閉過(guò)夜。I X PBST洗滌三次后，加入一抗(血清樣品按1:100或1:200倍比稀釋于IXPBS中)，每孔100 μ 1，陰性孔加入100 μ I 1:200陰性血清，空白孔加入100μ I 1:100樣品血清。37°C孵育2小時(shí)。采用I XPBST洗滌三次。加入酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗按說(shuō)明書作1:1000稀釋于IXPBS中，每孔50μ l，37°C，2h。顯色，顯色液(5mg OPD (鄰苯二胺)；4μ I 30% H2O2 ; IOml 底物緩沖液(0.2Μ Na2HPO4,0.1M 檸檬酸鈉))，每孔10(^1，371:，顯色10分鐘后，加入5(^1 2Μ H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上判讀結(jié)果。
[0045]對(duì)ICR小鼠免疫原性試驗(yàn)結(jié)果:初免I周后，在免疫組小鼠的血清中就可以檢測(cè)到ERa蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異抗體，在加強(qiáng)免疫后第7周抗體滴度上升到1.158±0.232(圖5)，達(dá)到最高值，而空白對(duì)照組(注射生理鹽水組)不能產(chǎn)生特異抗體，且免疫組與空白對(duì)照組抗體效價(jià)差異顯著(Ρ〈0.05)。
[0046]以常規(guī)直接ELISA法檢測(cè)制備的重組抗原與抗體的交叉反應(yīng)。以本研究獲得的重組表達(dá)蛋白以PH 9.5碳酸鹽緩沖液稀釋包被固相酶標(biāo)板，充分洗滌后，以市售人、鼠、鱖魚及上述純化的抗體作為一抗,進(jìn)行ELISA反應(yīng)，37°C反應(yīng)I小時(shí)后，以相應(yīng)的酶標(biāo)二抗進(jìn)行反應(yīng)，100 μ I/孔，37°C反應(yīng)I小時(shí)后，自動(dòng)洗板機(jī)洗板三次，5分鐘/次，進(jìn)行顯色反應(yīng)。結(jié)果表明人、鼠、鱖魚雌激素受體抗體不能與制備的重組抗原反應(yīng)，測(cè)定的ELISA值為0，制備的重組抗體能與重組 抗原反應(yīng)，其結(jié)果與陰性對(duì)照差異顯著。
[0047]2.2.2免疫組化分析
采用SuperPicTureTM法(DAB棕色反應(yīng)法)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)，鼠抗黃鱔雌激素受體抗體為通過(guò)步驟2.1中制備得到，稀釋度為1:100，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)的稀釋度為1:150。DAB顯色試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物試劑公司，對(duì)照實(shí)驗(yàn)片用正常鼠血清替代第一抗體進(jìn)行孵育，并進(jìn)行蘇木素復(fù)染。
[0048]應(yīng)用免疫組化SuperPicTure?法(DAB棕色反應(yīng)法)染色的切片，背景無(wú)色或淺棕色。ERa免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)呈深淺不等的棕色和棕黃色顆粒(圖6A、C中所示)，主要定位于細(xì)胞膜上，細(xì)顆粒狀，而在對(duì)照組中，細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成淡藍(lán)紫色(圖6B),未出現(xiàn)棕色顆粒陽(yáng)性信號(hào)，與預(yù)想結(jié)果一致.再次說(shuō)明ERa抗體是特異性的。
[0049]采用制備的多克隆抗體進(jìn)行的免疫組化定位初步研究，結(jié)果表明ERa在黃鱔卵巢精巢組織切片中均呈陽(yáng)性反應(yīng)，因此表明制備的多克隆抗血清可以與黃鱔ERa蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，進(jìn)一步觀察可以發(fā)現(xiàn)卵巢中卵母細(xì)胞膜、卵母細(xì)胞核等各期中均呈免疫陽(yáng)性反應(yīng)。
[0050]2.2.3 Western blot 分析
分別提取黃鱔精巢、卵巢組織的總蛋白(精巢和卵巢各取6個(gè)樣本)，按照Bradford法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳時(shí)采用IOOyg的上樣量。一抗按1: 500稀釋，4°C雜交過(guò)夜，購(gòu)自Sigma公司的β-actin —抗按1: 3000 4°C雜交過(guò)夜，購(gòu)自SantaCruz公司的抗鼠的二抗按1: 1000在4V雜交lh。Western blot的具體方法見(jiàn)分子克隆。利用灰度分析軟件UnScanIt gel 6.1對(duì)圖7A進(jìn)行半定量分析，通過(guò)計(jì)算得到泳道中特定基因與對(duì)應(yīng)β-actin的灰度比值，并據(jù)此繪出基因表達(dá)的柱型圖(圖7B)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERa基因在黃鱔精巢和卵巢中均有表達(dá)，精巢中的表達(dá)比卵巢中強(qiáng)，精巢中的平均比值是0.507±0.03，卵巢中的平均比值是0.394±0.02，具有顯著性差異(Ρ〈0.05)。
[0051]在本研究中使用帶有該表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白免疫小鼠后可以得到效價(jià)較高的多克隆抗血清，經(jīng)western blot檢測(cè)該抗血清能夠很好的識(shí)別ER α蛋白，表明其具有較好的免疫特異性。當(dāng)然在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)真核基因也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，如轉(zhuǎn)錄后不會(huì)進(jìn)行糖基化、甲基化等修飾作用，從而造成很多真核生物的基因不表達(dá)或者表達(dá)后沒(méi)有活性，如對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP28其野生型蛋白分子量為28kDa，原核表達(dá)的VP28蛋白的分子量為22kDa，造成差異的原因可能是野生型具有糖基化修飾等作用，而原核表達(dá)的VP28蛋白的翻譯后修飾卻是不完全的(Madhabananda S，F(xiàn)rank W.Differential expression of estrogen receptor-β and estrogen receptor-a in therat ovary [J].Endocrinology, 1999, 140 (2):963 971.)。其次是不同的表達(dá)系統(tǒng)有選擇不同密碼子的偏愛(ài)性，從而導(dǎo)致許多基因在原核系統(tǒng)中不能表達(dá)，難以獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但在本試驗(yàn)的進(jìn)行過(guò)程中卻沒(méi)有受到這些不利因素的影響，重組蛋白具有很好的抗原性，最終獲得了抗血清。
[0052]2.3抗體的純化
取4.2ml步驟2.1中得到的血清，加入等體積4.2 ml PBS (0.01M, pH7.8)，混勻。邊攪邊加入硫酸銨飽和溶液8.4 ml，使成50%飽和度，4°C放60分鐘。4000 rpm離心20分鐘，棄上清，用體積比是飽和硫酸銨:PBS= 4.2:4.2混合后的溶液清洗沉淀二次，去上清。將沉淀溶于4.2 ml PBS中，滴加 飽和硫酸銨溶液2.1 ml,使成30%飽和度，4°C放30分鐘，離心去上清，重復(fù)該步一次。脫鹽:沉淀溶于0.84 ml生理鹽水，移入透析袋中，于生理鹽水中透析至析出液中沒(méi)有3042_，用1% BaCl2溶液滴定檢測(cè)S042_。再換一次透析液，制得純化抗體粗品1.5ml。
[0053]2.4純化抗體的標(biāo)記
將10 mg辣根過(guò)氧化物酶溶于0.2 ml 1.25%戊二醛-0.1 M PBS (pH 6.8)，室溫作用18小時(shí)，透析去戊二醛。加生理鹽水至I ml，加5 mg步驟2.3中制備得到的純化抗體，加入0.1 ml IM碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)，4°C放24小時(shí)。加入0.1 ml 0.2M賴氨酸，室溫作用2小時(shí)，于0.15 M PBS (pH7.2)中，充分透析。離心去沉淀，上清即為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體。
[0054]2.5試劑盒的制備
2.5.1包被:用pH 9.5碳酸鹽緩沖液稀釋前述純化標(biāo)記抗體(1:800),包被96孔板，100μ I/孔，4°C包被過(guò)夜，陰性對(duì)照孔設(shè)4個(gè)/板，用正常鼠血清包被?？瞻讓?duì)照孔設(shè)4孔/板，加入包被液100 μ I。包被液:0.1 M Na2CO3緩沖溶液(pH 9.6)。
[0055]2.5.2洗板，用自動(dòng)洗板機(jī)洗板三次，5分鐘/次，洗滌液為TTBS (20 mMTris-0.8% NaCl-0.1% Tween 20，(pH 7.5 )。
[0056]2.5.3封閉:用1% BSA封閉酶標(biāo)板上沒(méi)有結(jié)合上抗體的位點(diǎn)。200 μ I/孔，室溫作用I小時(shí)，洗板。[0057]2.5.4加入ER α重組蛋白或標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液樣品稀釋液:1%BSA_TTBS，室溫作用I小時(shí)。陰性對(duì)照孔分別加入100、11.Ul.235 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。洗板；再在每孔中加入酶標(biāo)抗體(1: 600 )，100 μ I/孔。
[0058]2.5.5加底物:底物中含:0.1 M-檸檬酸鹽緩沖液-0.05%(wt/v鄰苯二胺-0.025% (V/V) H2O2暗處反應(yīng)20分鐘，加入2 N H2SO4終止反應(yīng)，50 μ I/孔，10分鐘后讀取0D490，
空白管調(diào)零。
[0059]利用不同的ERa重組蛋白濃度的樣本測(cè)出0D490后，繪制抗原樣本濃度與0D490值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行同法測(cè)定，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣本中抗原的濃度。
[0060]以制備的試劑盒檢測(cè)不同魚體的雌激素受體α蛋白。取5g羅非魚、建鯉、鱖魚、異育銀鯽、黃鱔等性腺、肝、腎等加入5mL預(yù)冷的勻漿緩沖液(勻漿緩沖液:I mol/LTris-HCK pH = 7.6) IOmL,NaCl 2.925 g; EDTA: 0.05 g 和 100 mmol/L PMSF 0.5 mL,用蒸餾水定容至500 mL;)冰浴勻漿，在4°C下離心(離心力=12 OOOXg) 30 min后取上清液作為ELISA的檢測(cè)液，檢測(cè)結(jié)果表明試劑盒只能檢測(cè)到黃鱔性腺、肝、腎組織的中的雌激素受體α，不能檢測(cè)到羅非魚、建鯉、鱖魚、異育銀鯽中的雌激素受體α，表明試劑盒特異性較強(qiáng)，不能與其他魚類產(chǎn)生交叉反應(yīng)，同時(shí)表明本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA試劑盒具有較高的可靠性和穩(wěn)定性。
[0061 ] 2.6試劑盒檢測(cè)性能驗(yàn)證
2.6.1重復(fù)性
分別提取3份同一條黃鱔5g的性腺組織中ER α蛋白和實(shí)施例1中得到的純化后的ERa重組蛋白分別按照步驟2.5的方法進(jìn)行檢測(cè)，OD值結(jié)果如表1，統(tǒng)計(jì)分析表明各組值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于2%，表明制備的試劑盒具有較好的重復(fù)性。
[0062]表1試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.黃鱔雌激素受體α蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID N0.4所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的黃鱔雌激素受體α基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。
3.含有權(quán)利要求2所述的黃鱔雌激素受體α基因的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，是指在EcoRI和Hind III位點(diǎn)之間插入上述黃鱔雌激素受體α基因的pMAL。
5.用于黃鱔雌激素受體α基因的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)抗原的制備:將黃鱔雌激素受體α基因插入載體中，并在大腸桿菌中表達(dá)，得到的ERa重組蛋白，經(jīng)純化后作為抗原； (2)抗體的制備:將(I)中所得到的抗原免疫鼠制備得到抗黃鱔雌激素受體a抗體； (3)抗體的純化: 對(duì)(2)中所得的抗體經(jīng)離心、沉淀、脫鹽，得純化抗體； (4)純化抗體的標(biāo)記:用酶標(biāo)記(3)中所得的純化抗體，得到酶標(biāo)抗體； (5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:用不同濃度的抗原包被在固相載體上，通過(guò)與(4)中所獲得的酶標(biāo)抗體結(jié)合后，進(jìn)行測(cè)定，繪制抗原濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (6)樣本測(cè)定:對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)樣本中抗原的含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于黃鱔雌激素受體a基因的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于:步驟⑴中是通過(guò)將黃鱔雌激素受體a基因插入至pMAL_c2x的EcoR 1、HindIII的位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBl，獲得融合蛋白；再對(duì)融合蛋白的MBP蛋白酶切后，得到ERa重組蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于黃鱔雌激素受體a基因的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于:所述的步驟(4)中，所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶。
8.權(quán)利要求2所述的黃鱔雌激素受體a基因在黃鱔ERa受體檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.黃鱔雌激素受體a的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括有權(quán)利要求1所述的黃鱔雌激素受體a蛋白質(zhì)及其對(duì)應(yīng)的抗體，所述的抗體是通過(guò)黃鱔雌激素受體a蛋白質(zhì)在小鼠免疫反應(yīng)制備得到。
【文檔編號(hào)】C07K14/72GK103965348SQ201410180865
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】丁煒東, 邴旭文, 曹麗萍, 曹哲明 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心