一種混菌固態(tài)發(fā)酵谷朊粉制備小麥活性肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以市售谷朊粉為原料制備小麥活性肽的方法，該方法采用枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌的復(fù)配發(fā)酵劑，進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵；再經(jīng)加水提取、離心分離、膜精制后，將得到的濾液經(jīng)噴霧干燥而成。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，制備方法操作簡單，活性肽得率高，成本低，反應(yīng)溫和，有利于環(huán)境友好保護(hù)，并充分發(fā)揮微生物去除肽類苦味的作用，是一種適合工業(yè)化生產(chǎn)小麥活性肽的方法。
【專利說明】一種混菌固態(tài)發(fā)酵谷朊粉制備小麥活性肽的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物蛋白肽的制備方法，具體涉及一種采用兩種微生物混合培 養(yǎng)，固態(tài)發(fā)酵谷朊粉制備小麥活性肽的生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肽是蛋白質(zhì)的一種特殊存在形式，一般為蛋白質(zhì)降解過程中的中間產(chǎn)物?，F(xiàn)代營 養(yǎng)研究成果表明，蛋白質(zhì)被動物所攝入后，主要以肽的形式被吸收利用，并可在體內(nèi)發(fā)揮提 高免疫、抗疲勞、降血壓和降血脂等多種生物功能。美國、日本等國家以活性肽為研究對象 已開發(fā)出低抗原食品、嬰兒食品、運(yùn)動食品、促鈣吸收食品、降壓食品、醒酒食品等一系列產(chǎn) 品，取得了良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。我國擁有相對豐富的蛋白質(zhì)資源，因此利用不同蛋白資 源開發(fā)活性肽是目前食品和飼料工業(yè)研究的重點(diǎn)。
[0003] 谷朊粉是一類從小麥中提取的優(yōu)質(zhì)的植物蛋白原料，其蛋白質(zhì)含量高 (75% -85% )且含有豐富的必需氨基酸，在食品和飼料工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用。研究表明， 谷朊粉經(jīng)過水解后可產(chǎn)生具有抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、鎮(zhèn)痛等多種功能活性的小麥肽，并大大提 高其蛋白體外消化率；體內(nèi)試驗(yàn)表明，小麥活性肽可顯著提高飼喂實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫功能。因 此，谷朊粉水解成小麥肽后，具備更優(yōu)的生物活性和廣闊的市場開發(fā)應(yīng)用前景。
[0004] 目前，由谷朊粉出發(fā)制備活性肽的主要方法為酶解法。如中國發(fā)明專利（CN 102326664B)公開了"一種谷朊粉肽的提取方法"，主要包括將蒸煮過的谷朊粉加水混合后， 分別加入堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶并調(diào)控pH穩(wěn)定進(jìn)行酶解反應(yīng)，再經(jīng)過分離、濃縮和干燥 制成小麥肽產(chǎn)品。但由于液體酶解法生產(chǎn)小麥活性肽的苦味明顯，口感較差，因而嚴(yán)重影響 了產(chǎn)品品質(zhì)。同時，由于酶解反應(yīng)使用的酶量大，且多為進(jìn)口酶，加大了制備小麥肽的成 本，減少了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。此外，為了保證酶解反應(yīng)的效果，往往需要實(shí)時調(diào)節(jié)pH、溫度等 反應(yīng)條件，進(jìn)一步加深了酶解工藝的復(fù)雜性，不利于小麥活性肽產(chǎn)業(yè)化的推廣。因此，目前 急需要一種新的生產(chǎn)工藝來實(shí)現(xiàn)有效消除小麥活性肽苦味的同時，降低其生產(chǎn)成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種工藝簡單、無需酸堿調(diào)節(jié)， 成本低的小麥活性肽制備方法，該制備方法所獲得的小麥活性肽苦味可達(dá)到有效去除。
[0006] 本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種混菌固態(tài)發(fā)酵谷朊粉制備小麥活性肽的方法，其特征在于：該方法包括：以 市售谷朊粉為原料，直接加入含有枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌的復(fù)配發(fā)酵劑，進(jìn)行固態(tài)發(fā) 酵；再經(jīng)提取分離、精制、干燥而成，其中，枯草芽孢桿菌為保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心保藏號為CGMCC No. 1. 4255的菌株，嗜酸乳桿菌為保藏在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 1. 3342的菌株。
[0008] 優(yōu)選的，制備所述的枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌復(fù)配發(fā)酵劑的方法包括：1)、配制 發(fā)酵培養(yǎng)液，成分為葡萄糖50g，酵母粉15g，蛋白胨20g，無菌水lOOOmL，pH為7. 0 ;2)、將從 斜面經(jīng)過活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌菌種分別用上述發(fā)酵培養(yǎng)的菌體 液稀釋為1-5X 1〇8個/mL的懸濁液，并按照等比例混合即得復(fù)配發(fā)酵劑。較優(yōu)選的，懸濁 液中枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的菌體濃度為1X 1〇8個/mL。
[0009] 優(yōu)選的，所述的固態(tài)發(fā)酵的步驟包括：按照谷朊粉與復(fù)配發(fā)酵劑固液質(zhì)量比 1:1-2:1加入發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)為28-42°C，發(fā)酵時間為24-72小時。
[0010] 優(yōu)選的，所述的提取步驟包括：按谷朊粉與蒸餾水的比1:10-1:20加入蒸餾水， 每次提取的時間為10-30分鐘，提取次數(shù)為1-3次。
[0011] 較優(yōu)選的，在經(jīng)過水提取過程后，還包括分離步驟，其中分離步驟包括：離心轉(zhuǎn)速 為3000-6000轉(zhuǎn)/分鐘以去除殘渣。
[0012] 優(yōu)選的，在經(jīng)過分離步驟后，采用超濾膜過濾分離小麥活性肽粗提液并分離成不 同分子量的小麥活性肽。
[0013] 一種混菌固態(tài)發(fā)酵谷朊粉制備小麥活性肽的方法，其特征在于：以市售谷朊粉為 原料，直接加入含有芽孢桿菌與乳酸菌的復(fù)配發(fā)酵劑，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；再經(jīng)提取分離、精制、 干燥而成。
[0014] 優(yōu)選的，混菌固態(tài)發(fā)酵谷朊粉制備小麥活性肽的方法，其特征在于：其工藝步驟包 括：1)、制備芽孢桿菌與乳酸菌復(fù)配發(fā)酵劑；2)、固態(tài)發(fā)酵：向谷朊粉中加入步驟1)所述芽 孢桿菌與乳酸菌的復(fù)配發(fā)酵劑，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；3)、加水提取步驟2)所述固態(tài)發(fā)酵后的培 養(yǎng)基，離心去除殘渣，超濾膜過濾分離得到小麥活性肽的粗提液；4)精制：將步驟3)所述制 得的小麥肽粗提液采用凝膠色譜方法進(jìn)行脫鹽、脫色處理；5)將步驟4)所述精制后的小麥 肽組分噴霧干燥即得生物活性小麥肽。優(yōu)選的，在步驟1)中所述的制備芽孢桿菌與乳酸菌 復(fù)配發(fā)酵劑的工序?yàn)椋?)配制發(fā)酵培養(yǎng)液，成分為葡萄糖50g，酵母粉15g，蛋白胨20g，無菌 水lOOOmL，pH為7. 0 ;2)將從斜面經(jīng)過活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌菌種 分別用上述發(fā)酵培養(yǎng)液稀釋為1-5 X 108個/mL的懸濁液，并按照等比例混合即得復(fù)配發(fā)酵 劑。
[0015] 優(yōu)選的，在步驟2)中所述的固態(tài)發(fā)酵步驟中，具體方法為：按照谷朊粉與復(fù)配發(fā) 酵劑固液質(zhì)量比1:1-2:1加入發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)為28-42°C，發(fā)酵時間為24-72小時。
[0016] 更優(yōu)選的，在步驟3)中所述的加水提取步驟中，按固液質(zhì)量比1:10-1:20加入蒸 餾水，每次提取時間為10-30分鐘，提取次數(shù)為1-3次。更優(yōu)選的，步驟3)中所述的離心 分離去除殘渣的方法中，離心轉(zhuǎn)速為3000-6000轉(zhuǎn)/分鐘。優(yōu)選的，在步驟3)中所述的超 濾膜過濾分離是將小麥活性肽粗提液采用不同截留分子量的超濾膜（3kDa，5kDa和10kDa) 進(jìn)行分級分離，得到三種不同分子量大小的小麥活性肽濾液。
[0017] 優(yōu)選的，在步驟4)中，所述的凝膠層析精制過程采用的填料為葡聚糖凝膠G-15或 G-25。
[0018] 優(yōu)選的，在步驟5)中，所述的噴霧干燥在以下條件下進(jìn)行：進(jìn)口溫度130-180°C， 干燥器內(nèi)溫度90-1KTC，出口溫度65-90°C。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1)本發(fā)明制備方法操作簡單，直接以市售谷朊粉為原料直接進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)小 麥肽，無需對原料進(jìn)行蒸煮或酸堿處理，有效降低成本，因此適合工業(yè)化生產(chǎn)并有效避開了 酸堿處理所帶來的環(huán)境污染和安全隱患；
[0022] 2)利用芽孢桿菌和乳酸菌混合發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶和多種代謝產(chǎn)物，大大簡化了谷 朊粉降解過程，節(jié)省了昂貴生物酶制劑的使用，有效降低了工業(yè)化生產(chǎn)成本；
[0023] 3)本發(fā)明采用不同截留量的超濾膜對小麥肽進(jìn)行分級分離，可有針對性的根據(jù)實(shí) 際需要獲得不同品質(zhì)的小麥活性肽產(chǎn)品，大大優(yōu)化了產(chǎn)品分級過程；
[0024] 4)經(jīng)感官苦味評定檢測，本發(fā)明方法有效降低了所制備小麥活性肽的苦味，同時 所制備的活性肽含量（以干基計）高達(dá)90.0%以上，更利于動物吸收利用；同時還具有免 疫調(diào)節(jié)、抗氧化和降壓等功能。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面具體結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的方法及其產(chǎn)品性能。但以下實(shí)施例僅 是范例性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
[0026] 實(shí)施例1固杰發(fā)酵谷朊粉制各小耒活件狀的菌種的篩詵
[0027] 本發(fā)明對所使用的芽孢桿菌與乳酸菌的復(fù)配發(fā)酵劑進(jìn)行了菌種篩選，篩選對象 包括從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)中國科學(xué) 院微生物研究所）商業(yè)途徑購買的枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、短小芽孢桿菌、干酪乳 桿菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌（保藏編號分別為：枯草芽孢桿菌，CGMCC No. 1. 4255 ;地 衣芽胞桿菌，CGMCC No. 1. 10314 ;短小芽孢桿菌，CGMCC No. 1. 8112 ;干酪乳桿菌，CGMCC No. 1. 3921 ;乳酸乳球菌，CGMCC No. 1. 24710 ;嗜酸乳桿菌，CGMCC No. 1. 3342)，具體篩選 方法是先制備發(fā)酵菌劑：芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌和短小芽孢桿菌）和乳 酸菌（干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌）菌種接一環(huán)進(jìn)入活化培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)基 配方為：1)枯草芽孢桿菌活化培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，自來水 1000mL，pH 7. 2 ;2)乳酸菌的活化培養(yǎng)基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，自來 水1000mL，pH 7. 2。進(jìn)行活化培養(yǎng)后，分別用發(fā)酵培養(yǎng)液（葡萄糖50g，酵母粉15g，蛋白胨 20g，無菌水1000mL，pH為7. 0)稀釋成菌體濃度達(dá)到1 X 108個/mL ;然后在固態(tài)發(fā)酵罐內(nèi) 按照固液質(zhì)量比1:1的比例加入谷朊粉，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵48小時后，按固液質(zhì)量比 1:20加入無菌蒸餾水，采用6000轉(zhuǎn)/分鐘離心去除雜質(zhì)，得到小麥活性肽粗提液；通過比 較不同菌種發(fā)酵后的1、谷朊粉蛋白的水解度、2、小麥肽得率和3、微生物蛋白酶活力產(chǎn)量 及4、粗提液中小麥肽的分子量分布，得到枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的蛋 白水解度和蛋白酶活較高，但地衣芽孢桿菌的肽得率較低，推測其發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶可能為外 切酶，產(chǎn)生的游離氨基酸較多，不能作為生產(chǎn)肽的出發(fā)菌種。因此枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿 菌的發(fā)酵效果較好（見下表）。
[0028] 表1不同微生物菌種對發(fā)酵后小麥活性肽品質(zhì)的影響
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種混菌固態(tài)發(fā)酵谷朊粉制備小麥活性肽的方法，其特征在于：該方法包括：以市 售谷朊粉為原料，直接加入含有枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌的復(fù)配發(fā)酵劑，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵； 再經(jīng)提取分離、精制、干燥而成，其中，枯草芽孢桿菌為保藏在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 1.4255的菌株，嗜酸乳桿菌為保藏在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 1. 3342的菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：制備所述的枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌 復(fù)配發(fā)酵劑的方法包括：1)、配制發(fā)酵培養(yǎng)液，成分為葡萄糖50g，酵母粉15g，蛋白胨20g， 無菌水lOOOmL，pH為7. 0 ;2)、將從斜面經(jīng)過活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿 菌菌種分別用上述發(fā)酵培養(yǎng)的菌體液稀釋為1-5X 108個/mL的懸濁液，并按照等比例混合 即得復(fù)配發(fā)酵劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的固態(tài)發(fā)酵的步驟包括：按照谷朊 粉與復(fù)配發(fā)酵劑固液質(zhì)量比1:1-2:1加入發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)為28-42°C，發(fā)酵時間為 24-72小時。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取步驟包括：按谷朊粉與蒸餾水 的比1:10-1:20加入蒸餾水，每次提取的時間為10-30分鐘，提取次數(shù)為1-3次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在經(jīng)過水提取過程后，還包括分離步驟， 其中分離步驟包括：離心轉(zhuǎn)速為3000-6000轉(zhuǎn)/分鐘以去除殘渣。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在經(jīng)過分離步驟后，采用超濾膜過濾分離 小麥活性肽粗提液并分離成不同分子量的小麥活性肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，懸濁液中枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的 菌體濃度為1X108個/mL。
【文檔編號】C07K1/16GK104152522SQ201410186555
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】湯江武, 孫宏, 吳逸飛, 姚曉紅, 王新, 柳永 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院