從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，具有簡單、快速、準確、可靠、穩(wěn)定等優(yōu)點，步驟為：1)取待檢測樣品液，點樣于高效薄層硅膠板上，同時，將標準液點樣于同一塊高效薄層硅膠板；展開劑加入展開缸中進行預平衡，后將高效薄層硅膠板放入展開缸中進行二次展開，取出晾干；2)烘烤染色；3)利用薄層掃描儀進行薄層層析掃描，得到胞壁酸Rf(比移值)和峰面積積分值；同時，計算出標準液質(zhì)量和峰面積積分值的關系的回歸方程，然后根據(jù)樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中胞壁酸的質(zhì)量濃度。本發(fā)明還提供了一種從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法，通過洗滌、脫脂、酸解、萃取等對菌渣的各種處理，得到了純化的胞壁酸。
【專利說明】從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法，以及胞壁酸的薄層層析檢測方法。
【背景技術】
[0002]胞壁酸是細菌細胞壁中肽聚糖的組成成分。
[0003]谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)是好氧細菌,棒狀,有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，單個或成八字排列，菌體0.7?0.9微米X 1.0?2.5微米，革蘭氏陽性，無芽孢，可用于微生物發(fā)酵工程生產(chǎn)谷氨酸并進而制取谷氨酸鈉(味精)。谷氨酸發(fā)酵廢醪菌渣是味精工業(yè)的主要副產(chǎn)品，每年產(chǎn)量可達上百萬噸，主要用作肥料和飼料加工，價格低廉。以谷氨酸發(fā)酵廢醪菌渣為原料，檢測并提取純化胞壁酸，可大幅度提升綜合利用價值，提高經(jīng)濟效益和社會效益。目前尚未見到以谷氨酸發(fā)酵廢醪菌渣為原料提取純化胞壁酸的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取純化胞壁酸的方法，本發(fā)明還提供了一種胞壁酸的薄層層析檢測方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0006]一種從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法，步驟如下:
[0007]I)取新鮮谷氨酸棒狀桿菌菌渣(谷氨酸發(fā)酵廢醪菌渣，即原料菌渣)，放在容器中，先用質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水在室溫多次(2?5次)洗滌菌渣，以除去異臭味和易溶物質(zhì)，過濾，得濾渣；
[0008]進一步地，用生理鹽水洗滌后，若濾渣還有異臭味，則向濾渣中加入蒸餾水，在溫度55°C并伴隨攪拌下洗滌菌渣(可通過恒溫磁力攪拌器實現(xiàn))，洗滌2?5次，過濾，得濾渣；
[0009]2)將步驟I)所得濾渣放入封閉容器，加入原料菌渣質(zhì)量3?5倍的質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液，在溫度45?60°C下，攪拌15min?Ih (可通過恒溫磁力攪拌器實現(xiàn)，攪拌速度優(yōu)選中速)，以裂解菌體，去除磷壁酸，過濾，得濾渣；
[0010]3)將步驟2)所得濾渣用蒸餾水洗滌I?2次，以除去三氯乙酸，然后依次用原料菌渣質(zhì)量2?10倍的甲醇、甲醇-氯仿混合液(甲醇、氯仿按體積比1:1混合而成)、氯仿洗滌脫脂，各2次；得脫脂濾渣；
[0011]4)向步驟3)所得脫脂濾渣中加入濃度為5?8mol/L的鹽酸，按每克原料菌渣加入4?10毫升鹽酸，置于水浴中，在溫度90?100°C下酸解4?8h ;酸解后，得棕黑色的酸解液，將酸解液在真空旋轉蒸發(fā)儀上濃縮蒸干(50?65°C )，以盡量揮去鹽酸，得胞壁酸粗品;
[0012]優(yōu)選的，所述將酸解液在真空旋轉蒸發(fā)儀上濃縮蒸干的溫度為50?65°C ；
[0013]5)步驟4)所得胞壁酸粗品，用蒸餾水溶解，加入氯仿，劇烈震蕩搖晃，靜置分液，棄去下層有機相(有機相中含有親脂性和兩性的雜質(zhì))，再加入氯仿萃取I?3次，得上層溶液；
[0014]優(yōu)選的，所述蒸餾水的用量為原料菌渣質(zhì)量的2?4倍，氯仿用量為蒸餾水體積的5?10倍；
[0015]6)將步驟5)所得上層溶液蒸發(fā)揮干，用甲醇溶解，加入活性炭混合吸附I?3次，至溶液變?yōu)闊o色透明，即得胞壁酸溶液，濃縮干燥，得胞壁酸；
[0016]優(yōu)選的，所述活性炭選用型號303糖用活性炭，每次的活性炭用量為原料菌渣質(zhì)量的0.5?1.5倍。
[0017]一種胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，步驟如下:
[0018]I)取待檢測樣品液(即上述方法制備得到的胞壁酸溶液)，點樣于高效薄層硅膠板上，同時，將不同濃度的標準液點樣于同一塊高效薄層硅膠板；展開劑加入展開缸中進行預平衡，后將高效薄層硅膠板放入展開缸中進行二次展開，取出晾干；
[0019]所述高效薄層娃膠板選用IOcmX IOcm的GF254高效薄層娃膠板；
[0020]所述待檢測樣品液的點樣量為10 μ L/點；
[0021]所述標準液為5種不同濃度的標準液，濃度分別為2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mg/ml,點樣量為I μ l/點；
[0022]所述展開劑為甲醇-丙酮-乙酸-水-異丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、異丙醇五者的體積比為4?6:2?4:0.5?1:0.5?1:0.5?2 ;
[0023]所述展開劑預平衡和硅膠板展開過程的溫度為25°C，20分鐘，二次展開，每次展距8cm(每次都是從原點計)。
[0024]2)將質(zhì)量濃度為I %的茚三酮乙醇溶液噴到高效薄層硅膠板上進行烘烤染色；
[0025]進一步地，所述染色的烘烤溫度為110°C，時間5min ；
[0026]3)利用薄層掃描儀進行薄層層析掃描，得到胞壁酸Rf (比移值)和峰面積積分值；同時，計算出標準液質(zhì)量和峰面積積分值的關系的回歸方程(通過薄層色譜儀管理軟件計算出，為常規(guī)手段)，然后根據(jù)樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中胞壁酸的質(zhì)量濃度。
[0027]本發(fā)明在進行薄層層析時，為取得有效效果，對展開劑進行了許多探索，并利用不同的試劑組合:丙酮-水；異丙醇-冰乙酸-水；正丁醇-甲苯-冰乙酸-水；正丁醇-冰乙酸-異丙醇；正丁醇-甲苯-冰乙酸-水；異丙醇:乙酸冰:甲醇和甲醇:丙酮:乙酸冰:異丙醇等。每一種組合，都進行了多次的比例調(diào)試，最后，發(fā)現(xiàn)以甲醇-丙酮-乙酸-水-異丙醇，體積比為4?6:2?4:0.5?1:0.5?1:0.5?2配比的展開劑和展開溫度25°C時展開效果較佳，以甲醇、丙酮、乙酸、水、異丙醇五者的體積比為5:3:1:1:1時最佳。
[0028]本發(fā)明的從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法，除去了菌渣中的雜質(zhì)，得到了純化的胞壁酸。本發(fā)明的胞壁酸的薄層層析檢測方法，具有簡單、快速、準確、可靠、穩(wěn)定等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0030]實施例1提取胞壁酸并進行薄層層析檢測
[0031]提取:取新鮮谷氨酸棒狀桿菌菌渣(原料菌渣)5克，放在150ml燒杯中，先用0.9 %的生理鹽水在室溫下多次洗滌菌渣，除去異臭味，過濾，得濾渣，轉入200ml三角瓶中，加入25mll0%的三氯乙酸溶液，用恒溫磁力攪拌器在55°C、適當轉速下進行攪拌30min，以裂解菌體，去除磷壁酸，過濾，除去濾液，用蒸餾水洗滌殘渣以洗去三氯乙酸，然后依次用50ml甲醇、50ml甲醇-氯仿混合液(甲醇與氯仿按體積比1:1混合而成)、50ml氯仿洗滌脫脂，各2次，得脫脂濾渣；加入6mol/L的鹽酸50ml，在水浴鍋95°C加熱酸解5h，得棕黑色的酸解液；將棕黑色的酸解液在旋轉蒸發(fā)儀濃縮50°C蒸干，以盡量揮去鹽酸，用20ml三蒸水溶解，加入IOOml氯仿，劇烈震蕩搖晃，靜置分液，除去下層親脂性和兩性的雜質(zhì)；再加入氯仿萃取2次，每次氯仿用量為100ml，得上層溶液；蒸發(fā)揮干，用30ml的甲醇溶解，加入5g303糖用活性炭混合吸附3次，至溶液變?yōu)闊o色透明，得胞壁酸溶液。
[0032]檢測:取胞壁酸溶液1ml，稀釋15倍，得樣品液。配制胞壁酸的標準液，濃度分別為:0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/ml。將樣品液(10 μ L/點)和標準液(I μ L/點)點于同一塊GF254高效薄層娃膠板(IOcmXlOcm)上。展開劑為甲醇-丙酮-冰乙酸-水-異丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、異丙醇五者的體積比為5:3:1:1:1。將展開劑加入展開缸(IOcmX 12cmX 15cm)在25°C下預平衡20分鐘。高效薄層板放入展開缸中，在25°C下展開，展距達到8cm時，將硅膠板板取出晾干。然后再次放回展開缸二次(從原點計)展開8cm，展開結束后，將硅膠板板取出晾干。用質(zhì)量濃度為I %的茚三酮乙醇溶液噴板染色,然后置于110°C下烘烤5分鐘。樣品液和標準品對應的點染成紅色。用camag3型薄層掃描儀，以492nm的吸收波長掃描，得到峰面積積分值和胞壁酸遷移值Rf為0.84，薄層掃描儀軟件winCATSl.4.1統(tǒng)計計算峰面積積分值與標準液質(zhì)量的關系的回歸方程，相關性Y =16.854X+4572.2，r = 0.9991RSD = 1.53%。經(jīng)檢測和計算，得谷氨酸棒狀桿菌菌渣中胞壁酸含量為L 10g/100g。
[0033]實施例2提取胞壁酸并進行薄層層析檢測
[0034]提取:取新鮮谷氨酸棒狀桿菌菌渣(原料菌渣)5克，放在150ml燒杯中，先用
0.9 %的生理鹽水在室溫下多次洗滌菌渣，除去異臭味，過濾，得濾渣，轉入200ml三角瓶中，加入15111110%的三氯乙酸溶液,用恒溫磁力攪拌器在45°C、適當轉速下進行攪拌15分鐘，以裂解菌體，去除磷壁酸，過濾，除去濾液，用蒸餾水洗滌殘渣以洗去三氯乙酸，然后依次用IOml甲醇IOml甲醇-氯仿混合液(甲醇與氯仿按體積比1:1混合而成)、IOml氯仿洗滌脫脂，各2次，得脫脂濾渣；加入5mol/L的鹽酸20ml，在水浴鍋90°C加熱酸解4h，得棕黑色的酸解液；將棕黑色的酸解液在旋轉蒸發(fā)儀濃縮50°C蒸干，以盡量揮去鹽酸，用IOml三蒸水溶解，加入50ml氯仿，劇烈震蕩搖晃，靜置分液，除去下層親脂性和兩性的雜質(zhì)；再加入氯仿萃取2次，每次氯仿用量為50ml，得上層溶液；蒸發(fā)揮干，用30ml的甲醇溶解，力口入2.5g303糖用活性炭混合吸附3次，至溶液變?yōu)闊o色透明，得胞壁酸溶液。
[0035]檢測:取胞壁酸溶液1ml，稀釋15倍，得樣品液。配制胞壁酸的標準液，濃度分別為:0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/ml。將樣品液(10 μ L/點)和標準液(I μ L/點)點于同一塊GF254高效薄層娃膠板(IOcmX IOcm)上。展開劑為甲醇-丙酮-冰乙酸-水-異丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、異丙醇五者的體積比為4:2:0.5:0.5:0.5。將展開劑加入展開缸(IOcmX 12cmX 15cm)在25°C下預平衡20分鐘。高效薄層板放入展開缸中，在25°C下展開，展距達到8cm時，將硅膠板板取出晾干。然后再次放回展開缸二次(從原點計)展開8cm，展開結束后，將硅膠板板取出晾干。用質(zhì)量濃度為I %的茚三酮乙醇溶液噴板染色，然后置于110°C下烘烤5分鐘。樣品液和標準品對應的點染成紅色。用camag3型薄層掃描儀，以492nm的吸收波長掃描，得到峰面積積分值和胞壁酸遷移值Rf為0.84，薄層掃描儀軟件winCATSl.4.1統(tǒng)計計算峰面積積分值與標準液質(zhì)量的關系的回歸方程，相關性Y =4113.9915+30.0484*X, r = 0.99953RSD = 3.71%。經(jīng)檢測和計算，得谷氨酸棒狀桿菌菌渣中胞壁酸含量為1.16g/100g。
[0036]實施例3提取胞壁酸并進行薄層層析檢測
[0037]提取:取新鮮谷氨酸棒狀桿菌菌渣(原料菌渣)5克，放在150ml燒杯中，先用
0.9 %的生理鹽水在室溫下多次洗滌菌渣，除去異臭味，過濾，得濾渣，轉入200ml三角瓶中，加入20ml 10%的三氯乙酸溶液，用恒溫磁力攪拌器在60°C、適當轉速下進行攪拌I小時，以裂解菌體，去除磷壁酸，過濾，除去濾液，用蒸餾水洗滌殘渣2次以洗去三氯乙酸，然后依次用30ml甲醇、30ml甲醇-氯仿混合液(甲醇與氯仿按體積比1:1混合而成)、30ml氯仿洗滌脫脂，各2次，得脫脂濾渣；加8mol/L的鹽酸30ml，在水浴鍋100°C加熱酸解8h，得棕黑色的酸解液；將棕黑色的酸解液在旋轉蒸發(fā)儀濃縮65°C蒸干，以盡量揮去鹽酸，用15ml三蒸水溶解，加入90ml氯仿，劇烈震蕩搖晃，靜置分液，除去下層親脂性和兩性的雜質(zhì)；再加入氯仿萃取2次，每次氯仿用量為90ml，得上層溶液；蒸發(fā)揮干，用20ml的甲醇溶解，力口入7.5g303糖用活性炭混合吸附3次，至溶液變?yōu)闊o色透明，得胞壁酸溶液。
[0038]檢測:取胞壁酸溶液1ml，稀釋15倍，得樣品液。配制胞壁酸的標準液，濃度分別為:0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/ml。將樣品液(10 μ L/點)和標準液(I μ L/點)點于同一塊GF254高效薄層娃膠板(IOcmX IOcm)上。展開劑為甲醇-丙酮-冰乙酸-水-異丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、異丙醇五者的體積比為6:4:0.9:0.8:2。將展開劑加入展開缸(IOcmX 12cmX 15cm)在25°C下預平衡20分鐘。高效薄層板放入展開缸中，在25°C下展開，展距達到8cm時，將硅膠板板取出晾干。然后再次放回展開缸二次(從原點計)展開8cm，展開結束后，將硅膠板板取出晾干。用質(zhì)量濃度為I %的水合茚三酮乙醇溶液噴板染色，然后置于110°C下烘烤5分鐘。樣品液和標準品對應的點染成紅色。用camag3型薄層掃描儀，以492nm的吸收波長掃描，得到峰面積積分值和胞壁酸遷移值Rf為0.84，使用實施例1中所得關系回歸方程，經(jīng)檢測和計算，得谷氨酸棒狀桿菌菌渣中胞壁酸含量為1.13g/100g。
【權利要求】
1.一種胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:步驟如下: 1)取待檢測樣品液，點樣于高效薄層硅膠板上，同時，將不同濃度的標準液點樣于同一塊高效薄層硅膠板；展開劑加入展開缸中進行預平衡，后將高效薄層硅膠板放入展開缸中進行二次展開，取出晾干； 所述展開劑為甲醇-丙酮-乙酸-水-異丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、異丙醇五者的體積比為4~6:2~4:0.5~1:0.5~1:0.5~2 ; 2)將質(zhì)量濃度為I%的茚三酮乙醇溶液噴到高效薄層硅膠板上進行烘烤染色； 3)利用薄層掃描儀進行薄層層析掃描，得到胞壁酸Rf(比移值)和峰面積積分值；同時，計算出標準液質(zhì)量和峰面積積分值的關系的回歸方程，然后根據(jù)樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中胞壁酸的質(zhì)量濃度。
2.根據(jù)權利要求1所述的胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述高效薄層硅膠板選用GF254高效薄層硅膠板。
3.根據(jù)權利要求1所述的胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述標準液為5種不同濃度的標準液，濃度分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mg/ml。
4.根據(jù)權利要求1所述的胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述甲醇、丙酮、乙酸、水、異丙醇五者的體積比為5:3:1:1:1。
5.根據(jù)權利要求1所述的胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述展開劑預平衡和硅膠板展開過程的溫度為25°C,時間20min。
6.根據(jù)權利要求1所述的胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述烘烤染色的烘烤溫度為110°C，時間5min。
7.根據(jù)權利要求1所述的胞壁酸的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述樣品液是通過以下方法制備得到的: 1)取新鮮谷氨酸棒狀桿菌菌渣(原料菌渣)，先用質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水在室溫下多次洗滌菌渣，以除去異臭味和易溶物質(zhì)，過濾，得濾渣； 2)步驟I)所得濾渣，加入原料菌渣質(zhì)量3~5倍的質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液，在溫度45~60 °C下,攪拌15min~Ih,過濾,得濾洛； 3)將步驟2)所得濾渣用蒸餾水洗滌I~2次，以除去三氯乙酸，然后依次用濾渣質(zhì)量2~10倍的甲醇、甲醇-氯仿混合液、氯仿洗滌脫脂，各2次；得脫脂濾渣； 4)向步驟3)所得脫脂濾渣中加入濃度為5~8mol/L的鹽酸，按每克原料濾渣加入4~10毫升鹽酸，置于水浴中，在溫度90~100°C下酸解4~8h ;酸解后，得棕黑色的酸解液，將酸解液濃縮蒸干，得胞壁酸粗品； 5)步驟4)所得胞壁酸粗品，用蒸餾水溶解，加入氯仿，劇烈震蕩搖晃，靜置分液，棄去下層有機相，再加入氯仿萃取I~3次，得上層溶液； 6)將步驟5)所得上層溶液蒸發(fā)揮干，用甲醇溶解，加入活性炭混合吸附I~3次，至溶液變?yōu)闊o色透明，即得樣品液。
8.一種從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法，其特征在于:步驟如下: 1)取新鮮谷氨酸棒狀桿菌菌渣(原料菌渣)，先用質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水在室溫下多次洗滌菌渣，以除去異臭味和易溶物質(zhì)，過濾，得濾渣； 2)步驟I)所得濾渣，加入原料濾渣質(zhì)量3~5倍的質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液，在溫度45~60 °C下,攪拌15min~1h,過濾,得濾洛； 3)將步驟2)所得濾渣用蒸餾水洗滌1~2次，以除去三氯乙酸，然后依次用原料菌渣質(zhì)量2~10倍的甲醇、甲醇-氯仿混合液、氯仿洗滌脫脂，各2次；得脫脂濾渣； 4)向步驟3)所得脫脂濾渣中加入濃度為5~8mol/L的鹽酸，按每1克原料菌渣加入4~10毫升鹽酸，置于水浴中，在溫度90~100°C下酸解4~8h ;酸解后，得棕黑色的酸解液，將酸解液濃縮蒸干，得胞壁酸粗品； 5)步驟4)所得胞壁酸粗品，用蒸餾水溶解，加入氯仿，劇烈震蕩搖晃，靜置分液，棄去下層有機相，再加入氯仿萃取1~3次，得上層溶液； 6)將步驟5)所得上層溶液蒸發(fā)揮干，用甲醇溶解，加入活性炭混合吸附1~3次，至溶液變?yōu)闊o色透明，即得胞壁酸溶液，濃縮干燥，得胞壁酸。
9.根據(jù)權利壓球8所述的從谷氨酸棒狀桿菌菌渣中提取胞壁酸的方法，其特征在于:所述活性炭選用型號303糖用活性炭。
【文檔編號】C07H1/08GK103954726SQ201410188150
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權日:2014年5月6日
【發(fā)明者】蔣新英, 劉代成 申請人:山東師范大學