靶向性凝固因子及其使用方法
【專利摘要】提供了靶向性凝固因子，其包含與至少一個特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域連接的凝固因子。所公開的靶向性凝固因子提高凝固因子的效率，并延長其作用的持續(xù)時間，并且如此是用于治療血液學(xué)疾病諸如血友病A的改善。
【專利說明】靶向性凝固因子及其使用方法
[0001] 此案是申請日為2009年5月15日、中國申請?zhí)枮?00980126328. 5、發(fā)明名稱為 "靶向性凝固因子及其使用方法"的發(fā)明申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2008年5月16日提交的美國臨時申請流水號61/053, 932的權(quán)益，通 過提及而將其內(nèi)容完整收入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本申請涉及具有升高的功效的靶向性凝固因子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療凝固因 子缺乏病癥患者的方法，其通過將凝固因子選擇性靶向至其作用的生物學(xué)位置，諸如通過 將凝血因子VIII (FVIII)靶向至紅細(xì)胞和血小板來進(jìn)行。還提供了藥物組合物，其包含依 照本發(fā)明的靶向性凝固因子。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 生物學(xué)藥物的效率常常受到其在患者中的作用持續(xù)時間限制，尤其在疾病需要藥 物的持續(xù)調(diào)控時。因此，藥動學(xué)特性的增強(qiáng)對于治療劑在臨床上的成功通常比藥物效力的 優(yōu)化更重要。一種保護(hù)藥物免于各種清除機(jī)制以延長半衰期的辦法是添加靶向域，其促進(jìn) 藥物結(jié)合至循環(huán)中的長壽命蛋白質(zhì)諸如基質(zhì)蛋白或細(xì)胞（諸如血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞）表面。 例如，已經(jīng)顯示了治療性肽或蛋白質(zhì)定位于血細(xì)胞表面通過阻止正常的清除機(jī)制來延長其 循環(huán)半衰期（Chen等，Bloodl05 (10) :3902-3909, 2005)?？梢允褂脴O其多種分子作為靶向 域。
[0006] 在另一個例子中，在連接蝶（tick)抗凝蛋白的Kunitz型蛋白酶抑制劑（KPI)域 與陰離子磷脂、磷脂酰-L-絲氨酸（PS)結(jié)合蛋白、膜聯(lián)蛋白V(ANV)時，顯示了融合蛋白 (ANV-KPI)比非融合對應(yīng)物更具活性，而且擁有更高的體內(nèi)抗凝血活性（Chen等，2005)。由 于ANV對PS和磷脂酰乙醇胺（PE)具有強(qiáng)親和力，假設(shè)融合蛋白ANV-KPI能特異性靶向至血 栓形成（thrombogenesis)位置處存在的富含PS/PE的陰離子膜結(jié)合的凝固酶復(fù)合物。類似 地，Dong等報告了融合血纖蛋白選擇性吸血蝠 （Desmodus rotundus)唾液PAa l(dsPAa 1) 與尿激酶（uPA)/抗P-選擇蛋白抗體（HuSZ51)以生成完全功能性的融合蛋白，在體外測定 法中具有與非融合對應(yīng)物相似的抗凝血活性。此外，顯示了融合蛋白HuSZ51-dsPAa 1結(jié)合 凝血酶激活的人和犬血小板（Dong等，Thromb. Haemost. 92:956-965, 2004)。
[0007] 已經(jīng)在靶向抗凝血劑中進(jìn)行了其它努力以阻止凝塊和降低與血栓性疾病 有關(guān)的死亡率（參見例如 W094/09034)。Stoll 等（Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27:1206-1212, 2007)表明了新近的開發(fā)，其中經(jīng)由抗LIBS單鏈抗體（scFv抗LIBS)將 凝血因子Xa(FXa)抑制劑，即蜱抗凝血肽（TAP)靶向至GPIIb/IIIa(即一種在血小板表面 上豐富表達(dá)的糖蛋白）上的配體誘導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)。顯示了融合蛋白s CFvauBS-TAP即使在 非靶向性對應(yīng)物失效（fail)的低濃度也擁有有效的抗凝活性。
[0008] 上述靶向性抗凝血劑是設(shè)計用于靶向特定細(xì)胞的融合蛋白。依照Stoll等，靶向 性抗凝血劑應(yīng)當(dāng)是具有在與抗體融合時得到保留的高度有力的凝固抑制活性的小分子。不 討論抗凝血劑自其靶定位置中的融合蛋白的釋放。
[0009] 本發(fā)明聚焦于用于治療血液學(xué)疾病諸如血友病的靶向性治療性蛋白質(zhì)。例如，用 FVIII濃縮物或重組FVIII對血友病A患者的當(dāng)前治療受到這些因子的高成本和其相對較 短的作用持續(xù)時間的限制。目前，通過在需要時靜脈內(nèi)施用FVIII或者作為一周數(shù)次施用 的預(yù)防性療法來治療血友病A患者。對于預(yù)防性處理，一周三次施用FVIII。不幸地，此頻 率對于許多患者而言是成本昂貴的（cost prohibitive)。由于其在人中的短半衰期，必須 頻繁施用FVIII。盡管其在全長蛋白質(zhì)上大于300kD的較大大小，F(xiàn)VIII具有僅約11-18(平 均14)小時的人中半衰期（Gruppo等，Haemophila9:251_260, 2003)。對于那些能負(fù)擔(dān)得起 所推薦的頻繁劑量給藥的人，然而頻繁地靜脈內(nèi)注射蛋白質(zhì)是非常不方便的。對于患者而 言會更方便的是，若可以開發(fā)出具有較長的半衰期，因此需要頻率較少的施用的FVIII產(chǎn) 品。此外，若半衰期得到延長，則可以降低治療成本，這是因為那樣可需要較少的劑量。因 此，想要具有更有效形式的FVIII，其能降低有效劑量或者具有延長的作用持續(xù)時間以顯著 改善血友病患者的治療選項。
[0010] 還有，靶向性FVIII的持續(xù)血漿濃度可以通過降低FVIII的谷至峰水平，如此消除 需要在早期時間點(diǎn)時引入超生理學(xué)水平的蛋白質(zhì)，從而降低不利副作用的程度。因此，想要 具有如下的FVIII形式，其具有持續(xù)不變的持續(xù)時間和比目前銷售的形式更長的半衰期。
[0011] 目前療法的別的缺點(diǎn)是約25-30%的患者形成抑制FVIII活性的抗體（Saenko 等，Haem〇philia8:1-11，2002)?？贵w形成阻止FVIII作為代替療法使用，迫使這組患者尋 找甚至更昂貴的用高劑量重組凝血因子VIIa(FVIIa)的治療和免疫耐受性療法。因此，較 小免疫原性的FVIII代替產(chǎn)品是想要的。
[0012] 一種為血友病患者改善治療的辦法牽涉基因療法。通過在血小板中指導(dǎo)FVIII 表達(dá)來將FVIII異位靶向至血小板在治療血友病A中可以具有治療效果（Shi等，J. Clin. Invest. 116(7):1974-1982, 2006)。
[0013] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供靶向性凝固因子，其與非靶向性蛋白質(zhì)相比具有延長的作用 持續(xù)時間、更大的功效、更少的副作用、和更小的免疫原性。
[0014] 本發(fā)明的另一個目標(biāo)是降低與治療性蛋白質(zhì)施用有關(guān)的副作用，其通過讓蛋白質(zhì) 靶向至期望作用的特定位置，并且由此降低蛋白質(zhì)暴露于可導(dǎo)致不想要副作用的其它潛在 生物學(xué)活性位點(diǎn)來實現(xiàn)。
[0015] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是獲得別的優(yōu)點(diǎn)，其通過設(shè)計靶向性治療性凝固因子來實 現(xiàn)，其中治療性蛋白質(zhì)在緊鄰其體內(nèi)作用位置處自靶向域釋放。可以達(dá)到高局部濃度的非 融合、激活的蛋白質(zhì)。如此，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的治療功效。
[0016] 本發(fā)明還涉及
[〇〇17] 1. 一種靶向性凝固因子，其包含與至少一個特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域 連接的凝固因子。
[0018] 2.項1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
[0019] 3.項1的靶向性凝固因子，其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0020] 4.項1的靶向性凝固因子，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/ Ilia。
[0021] 5.項4的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
[0022] 6.項4的靶向性凝固因子，其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片 段。
[0023] 7.項1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽，而所述域是與 所述FVIII的B域連接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0024] 8.項7的靶向性凝固因子，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗 GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
[0025] 9. -種藥物組合物，其包含治療有效量的項1的靶向性凝固因子和藥學(xué)可接受賦 形劑或載體。
[0026] 10. -種用于治療血液學(xué)疾病的方法，包括對有所需要的患者施用有效量的項1 的靶向性凝固因子。
[0027] 11. -種用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞表面的方法，包括連接所述凝固因子與至 少一種結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域。
[0028] 12.項11的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
[0029] 13.項11的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板或紅細(xì)胞。
[0030] 14.項11的方法，其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0031] 15.項11的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/IIIa。
[0032] 16.項15的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
[0033] 17.項15的方法，其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
[0034] 18.項11的方法，其中所述凝固因子是FVIII，而所述域是與所述FVIII的B域連 接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0035] 19.項18的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗GPIIb/IIIa 抗體的單鏈片段。
[0036] 20.項11的方法，其中進(jìn)一步從所述血細(xì)胞的表面釋放所述凝固因子。
[0037] 發(fā)明概述
[0038] 依照本發(fā)明的靶向性凝固因子包含與至少一個特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì) 的域連接的凝固因子。還提供了包含新公開的靶向性凝固因子的藥物組合物和使用靶向性 凝固因子來治療血液學(xué)疾病的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種通過使用新公開的靶向性凝 固因子來將凝固因子靶向至血細(xì)胞表面以提高用凝固因子治療血液學(xué)疾病的效率的方法。
[0039] 附圖簡述
[0040] 圖1:全長？￥111("全長？￥111)和8域缺失型？￥111(^111-800-了0"）（其中 將靶向域（"TD"）插入B域中，并除去大部分的B域）的示意圖。
[0041] 圖2 :經(jīng)由B域半胱氨酸連接FVIII的經(jīng)修飾的環(huán)肽Integrilin，即"BHRF-1"(A) 和"BHRF-3"⑶的結(jié)構(gòu)。
[0042] 圖3 :BHRF-1和BFRH-3對固定化GPIIa/IIIb的結(jié)合親和力。
[0043] 圖4 :對固定化GPIIa/IIIb的BHRF-1-FVIII結(jié)合測定法。
[0044] 圖5 :與FVIII比較的BHRF-l-FVIII的體外凝固活性。
[0045] 圖6 :BHRF-1-FVIII對人血小板的體外結(jié)合。
[0046] 圖7 :BHRF-1-FVIII對小鼠血小板的體外結(jié)合。
[0047] 發(fā)明詳述
[0048] 本發(fā)明涉及將凝固因子靶向至其作用的一個或多個位置，諸如血細(xì)胞。在一個實 施方案中，提供了靶向性凝固因子，其經(jīng)由連接所述因子與至少一個結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋 白質(zhì)的域來特異性靶向至血細(xì)胞。用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞的域可以不限于對血細(xì)胞 表面上的膜蛋白質(zhì)具有高親和力的抗體片段、抗體、肽、受體配體、碳水化合物、或小分子。 例如，血細(xì)胞是紅細(xì)胞或血小板。
[0049] 如本文中所使用的，"凝固因子"指牽涉凝固級聯(lián)并主要具有促凝血活性的蛋白 質(zhì)。凝固因子是本領(lǐng)域中公知的，并且包括但不限于凝固因子I、II、V、VI、VII、VIII、IX、 父、乂1、乂11、和乂111，及蛋白5。凝固因子可以從血漿濃縮或者可以重組生成。若重組生成， 凝固因子可以具有與天然結(jié)構(gòu)不同的氨基酸結(jié)構(gòu)，只要維持足夠的促凝血活性，使得變體 是治療有用的。在一個實施方案中，凝固因子是功能性FVIII多肽諸如但不限于來自血漿 的FVIII濃縮物或重組生成的FVIII，或凝血因子IX(FIX)。
[0050] 如本文中所使用的，"功能性FVIII多肽"意為能夠在體內(nèi)或在體外改正例如以血 友病A表征的人FVIII缺乏的功能性多肽或多肽組合。FVIII在自然狀態(tài)中具有多種降解 或加工形式。這些是以蛋白水解方式自前體，即單鏈蛋白質(zhì)衍生的。功能性FVIII多肽包 括此類單鏈蛋白質(zhì)，而且還提供了這些各種降解產(chǎn)物，它們具有改正人FVIII缺乏的生物 學(xué)活性?？赡艽嬖诘任蛔儺?。功能性FVIII多肽包括產(chǎn)生FVIII衍生物的所有此類等位 變異、糖基化型式、修飾和片段，只要它們含有人FVIII的功能區(qū)段和本質(zhì)的、特征性的人 FVIII功能活性。可以容易地通過本文中所描述的直接體外測試來鑒定那些擁有必要功能 活性的FVIII衍生物。此外，功能性FVIII多肽能夠在存在凝血因子IXa(FIXa)、鈣、和磷 脂的情況中催化凝血因子X(FX)轉(zhuǎn)化為FXa，以及改正自血友病A受累個體衍生的血漿中 的凝固缺陷。從人FVIII氨基酸序列的公開序列和關(guān)于其功能區(qū)的公開信息看，可以經(jīng)由 對DNA的限制酶切割或?qū)θ薋VIII蛋白的蛋白水解或其它降解衍生的片段對于本領(lǐng)域技術(shù) 人員會是顯而易見的。功能性FVIII多肽內(nèi)明確包括但不限于全長人FVIII (例如SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO: 2)和 B 域缺失型凝血因子 VIII (例如 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4)， 而且具有如W02006/053299中所披露的氨基酸序列。
[0051] FVIII的"促凝血活性"指FVIII在凝固級聯(lián)中的活性。FVIII自身不引起凝固，但 是在凝固級聯(lián)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。FVIII在凝固中的作用是要被激活為FVIIIa，其是一 種用于固有 FX 激活的催化性輔因子（Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29:11-22, 2003)。 FVIII是由凝血酶或FXa以蛋白水解方式激活的，所述凝血酶或FXa將其與馮維勒布蘭德因 子（von Willebrand factor，vWf)解離，并激活其在級聯(lián)中的促凝血功能。在其活性形式 中，F(xiàn)VIIIa在血液凝固的固有途徑中發(fā)揮FX激活酶復(fù)合物的輔因子的功能，并且其在血友 病A患者中是降低的或非功能性的。
[0052] "FIX"指凝固因子IX，其又稱為人凝固因子IX，或血漿促凝血酶原激酶成分。
[0053] 如本文中所使用的，術(shù)語"靶向性凝固因子"指與至少一個特異性結(jié)合血細(xì)胞上的 膜蛋白質(zhì)的域偶聯(lián)的凝固因子。靶向性凝固因子應(yīng)當(dāng)有力地結(jié)合血細(xì)胞，例如以小于ΙΟηΜ 的半最大結(jié)合。結(jié)合對于靶定的血細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是特異性的，例如經(jīng)由結(jié)合靶定細(xì)胞上選擇性 表達(dá)的膜蛋白質(zhì)來實現(xiàn)。如本文中所使用的，"域"或"靶向域"指對靶細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)具 有高親和力的模塊。適合于本發(fā)明的域包括但不限于對血細(xì)胞表面上的膜蛋白質(zhì)具有高親 和力的抗體、抗體片段諸如單鏈抗體（svFv)或FAB片段、抗體模擬物、和肽或小分子。在一 方面，使用單鏈抗體片段或肽，因為其編碼序列可以與FVIII編碼序列連接，而且可以使用 重組技術(shù)來生成融合蛋白。
[0054] 可以以化學(xué)法或通過重組表達(dá)融合蛋白來將凝固因子與所述域偶聯(lián)。可以通過將 凝固因子上存在的化學(xué)模塊與靶向域連接在一起來實現(xiàn)化學(xué)連接，包括使用諸如氨基、羧 基、巰基、羥基基團(tuán)、和碳水化合物基團(tuán)等模塊的化學(xué)連接?？梢允褂枚喾N同和異雙功能接 頭，它們具有活化的，或者可以活化以連接附著這些模塊的基團(tuán)。接頭分子上的一些有用的 反應(yīng)基團(tuán)包括馬來酰亞胺、N-羥基-琥珀酰胺酯和酰肼?？梢允褂迷S多不同化學(xué)組成和長 度的不同間隔物來分開這些反應(yīng)基團(tuán)，包括例如聚乙二醇（PEG)、脂肪族基團(tuán)、亞烴基基團(tuán)、 環(huán)亞烷基基團(tuán)、融合的或連接的芳基基團(tuán)、長度為1至20個氨基酸或氨基酸類似物的肽和 /或肽基模擬物。例如，可以以如下方式連接所述域與凝固因子，使得在體內(nèi)功能形式的凝 固因子會自其靶向域釋放或者在凝固因子在身體中的生物學(xué)活性位置處或附近發(fā)生釋放。
[0055] 因而，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了靶向性凝固因子，其中可以切割或降解 將凝固因子附著至用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞的域的連接，由此自偶聯(lián)物釋放凝固因 子。
[0056] 可以通過將靶向域連接至凝固因子上在其激活過程期間除去的位點(diǎn)，或者通過使 用以受控方式被血液中的酶降解的接頭來實現(xiàn)凝固因子自其偶聯(lián)物形式（即自靶向性凝 固因子）的釋放。例如，可以使用對一般的血液蛋白酶或水解酶易感的糖聚合物或肽。多種 此類技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，而且已經(jīng)用于制備前藥。可以將接頭進(jìn)一步工程化改造成在 最需要凝固因子的位置諸如經(jīng)由外傷觸發(fā)的炎癥或血液凝固的位置處特異性切割。例如， 接頭可以對僅在想要的作用位置處所生成的特定蛋白酶，諸如通過炎癥過程釋放或者通過 血液凝固級聯(lián)生成的蛋白酶易感。治療性蛋白質(zhì)的此選擇性釋放可以降低副作用的潛力， 并且提高蛋白質(zhì)在其作用位置的效率。
[〇〇57] 依照本發(fā)明，可以靶向血細(xì)胞上的多種膜蛋白質(zhì)。為了特異性且有效地將凝固因 子靶向至血細(xì)胞，然而，優(yōu)選的是，靶定的膜蛋白質(zhì)豐富地存在于血細(xì)胞表面上。例如，發(fā)現(xiàn) 糖蛋白GPIIb/IIIa是血小板表面上最豐富表達(dá)的分子之一。
[0058] 因而，在一個實施方案中，經(jīng)由特異性結(jié)合血小板膜蛋白質(zhì)諸如糖蛋白GPIIb/ Ilia的域?qū)⒛桃蜃影邢蛑裂“?。此類將凝固因子靶向至GPIIb/IIIa的域的例子包括 但不限于含有RGD的肽和模擬物（線性肽、蛇毒肽、和環(huán)肽）諸如含有RGD模擬序列（即高 精氨酸、甘氨酸天冬氨酸）的Integrilin9、非肽RGD模擬物、和抗GPIIb/IIIa抗體。若使 用抗體作為靶向域，則可以使用抗體的單鏈片段，諸如svFv或FAB片段。
[0059] 靶向 FVIII 和 FIX
[0060] 將FVIII和FIX靶向至血細(xì)胞諸如血小板或紅細(xì)胞的表面可以用來減緩這些凝 固因子的清除。將FVIII靶向至血小板細(xì)胞的表面是特別感興趣的。FVIII是FIX介導(dǎo)的 FX激活中的一種重要的輔因子，所述FIX介導(dǎo)的FX激活主要在凝塊位置處積累的激活的 血小板細(xì)胞表面上發(fā)生。血小板激活觸發(fā)這些凝固因子結(jié)合其表面以形成促進(jìn)FXa生成的 復(fù)合物。血小板具有約9天的平均循環(huán)壽命。比較而言，血漿中的FVIII (大部分結(jié)合馮維 勒布蘭德氏因子）展現(xiàn)出約14小時的半衰期。如此，F(xiàn)VIII對血小板的結(jié)合具有極大地延 長分子的循環(huán)時間的潛力。經(jīng)由依照本發(fā)明的靶向域?qū)VIII靶向至血小板細(xì)胞表面提高 FVIII作用的效率，而且預(yù)期延長FVIII的半衰期。
[0061] 在GPIIb/IIIa外，血小板上的其它蛋白質(zhì)也可以充當(dāng)靶向性FVIII的受體，諸如 GPla和膜聯(lián)蛋白V。糖蛋白GPIIb/IIIa是優(yōu)選的，因為它是血小板表面上最豐富表達(dá)的分 子之一。血液中的GPIIb/IIIa濃度估計為約75nM，這基于其在血小板上的表面密度得到。 這表示超過治療性應(yīng)用FVIII后達(dá)到的FVIII最大濃度（C max約0. 7nM) 100倍。因此，將 FVIII靶向至血小板會占據(jù)血小板上可用GPIIb/IIIa位點(diǎn)的大約1 %或更小。預(yù)期此低水 平的占據(jù)不會改變血小板功能，這要求封閉很大分?jǐn)?shù)（即大于50-60%)的GPIIb/IIIa分 子。高濃度的GPIIb/IIIa還會驅(qū)動靶向性FVIII對血小板表面的平衡結(jié)合。
[0062] 不以任何方式限制本發(fā)明，認(rèn)為將FVIII靶向至GPIIb/IIIa還可以具有如下的益 處，即一些凝固因子可以通過經(jīng)由血小板的開放管內(nèi)系統(tǒng)（openintracanicular system) 胞吞和再循環(huán)GPIIb/IIIa而內(nèi)在化。這種FVIII可以在alpha顆粒中停止（end up)，并在 血小板激活后再釋放，在其為凝固所需要時提供FVIII源?？梢员Ｗo(hù)靶向至血小板的結(jié)合 的或內(nèi)在化的FVIII免于存在于許多患者中的抑制劑（例如FVIII抗體）。如此，靶向性 FVIII可以為重要的這組患者提供治療選項。
[0063] 對于促進(jìn)凝固的靶向性FVIII，該分子必須能夠被加工為功能形式（FVIIIa)，并 自其GPIIb/IIIa結(jié)合位點(diǎn)釋放。在一個實施方案中，這通過連接GPIIb/IIIa靶向域與 FVIII的B域來實現(xiàn)。在促凝血環(huán)境中通過凝血酶或FXa介導(dǎo)的蛋白酶解來除去B域，生成 成熟的FVIIIa分子。如此，激活后，F(xiàn)VIIIa會自GPIIb/IIIa釋放，而且可用于形成FX激 活復(fù)合物。
[0064] 可以通過使用本文中所描述的交聯(lián)方法來共價結(jié)合靶向域與FVIII上的反應(yīng)基 團(tuán)（包括氨基、巰基、羧基基團(tuán)和羰基基團(tuán)），從而實現(xiàn)FVIII與靶向域之間的連接。還可以 將靶向域與主要存在于FVIII分子的B域上的碳水化合物偶聯(lián)。例如，用高碘酸鹽輕度氧化 FVIII在碳水化合物鏈上生成醛，其然后能與胺或酰肼起反應(yīng)，接著任選地進(jìn)行還原以形成 更穩(wěn)定的連接。
[0065] 可以經(jīng)由用三（2-羧乙基）膦（TCEP)的輕度還原在重組FVIII的B域上選擇性生 成游離的半胱氨酸，這容許B域與靶向域的特異性連接，所述靶向域與游離的半胱氨酸起 反應(yīng)，諸如含有硫醇、三氟甲燒磺酸基（triflate)、三氟乙基磺酸基（tresylate)、氮丙陡 (aziridine)、環(huán)氧乙燒、S-批陡基、或馬來酰亞胺模塊的域。此外，可以修飾FVIII以用半 胱氨酸替換氨基酸殘基，從而為附著至靶向域提供特定位置。若使用B域缺失型FVIII，則 可以使用多種B域缺失型FVIII半胱氨酸突變蛋白（諸如那些披露于W02006/053299的） 來經(jīng)由表面半胱氨酸殘基處的化學(xué)結(jié)合連接FVIII與靶向域?？梢赃M(jìn)行修飾以用半胱氨 酸替換氨基酸殘基的氨基酸殘基的例子包括但不限于81、129、377、378、468、487、491、504、 556、570、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1911、2091、2118、和 2284(氨基酸 殘基以其在全長FVIII序列中的位置指明）。
[0066] 也可以使用重組技術(shù)將凝固因子與靶向域偶聯(lián)?？梢杂冒現(xiàn)VIII和靶向域的融 合蛋白的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，可以將靶向域插入FVIII的B域中，并刪 除大部分B域，其中僅在羧基和氨基端處留下B域的部分以容許對B域的生物學(xué)加工，從而 將其自全長分子刪除。如圖1中所顯示的，規(guī)定B域的剩余部分，其容許在生理學(xué)條件下生 物學(xué)加工并除去B域。
[〇〇67] 宿主細(xì)胞系可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知為可用于生成凝固因子的任何細(xì)胞，對于 FVIII諸如但不限于CH0細(xì)胞、HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、和HKB11細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞系HEK293 和人Burkitt B細(xì)胞淋巴瘤系2B8的雜合物）。
[0068] 許多域可以以化學(xué)法連接至FVIII，或者與FVIII -起重組表達(dá)，從而將FVIII靶 向至血小板表面上的GPIIb/IIIa。此類域的例子包括但不限于針對GPIIb/IIIa的抗體、靶 向GPIIb/IIIa的RGD肽、肽模擬物、或小分子模擬物?？贵w諸如靶向GPIIb/IIIa的單鏈抗 體（svFv)或FAB片段特別可用作祀向域。
[0069] 已經(jīng)顯示了可以在不喪失FVIII功能的情況中除去FVIII的B域。另外，還已 經(jīng)顯示了各種B域截短形式的FVIII和B域與其它蛋白質(zhì)域的融合物可以產(chǎn)生功能活性 FVIII。在一方面，本發(fā)明牽涉可以進(jìn)行工程化改造以插入、替換、或部分替換FVIII的B 域而不阻斷分子產(chǎn)生活性FVIII的正常加工的靶向域。例如，使用重組DNA技術(shù)，可以生 成FVIII分子，其中將單鏈抗體片段融合至FVIII B域的C端?；蛘?，也可以使用svFv 片段來替換整個或部分的FVIII B域。這可以經(jīng)由在B域編碼序列后以符合讀碼框方式 插入編碼svFv片段的DNA序列，或者替換一些或整個B域編碼序列來實現(xiàn)。此策略會保 存FVIII的正常蛋白水解激活所要求的凝血酶切割位點(diǎn)。多種有效定位至血小板的針 對 GPIIb/IIIa 的抗體是已知的（參見例如 Schwarz 等，Circ. Res. 99(1) :25-33, 2006 ; Jacobin 等，Clin. Immunol. 108(3):199-210, 2003 ;Christopoulos 等，Blood Coagul. Fibrinolysis4 (5) : 729-37, 1993 ;及 Chung 等，F(xiàn)ASEB J. 18 (2) : 361-363, 2004)。
[0070] 同樣地，含有RGD或RGD模擬物的肽也是對于靶向FVIII有用的配體，因為許多此 類肽已經(jīng)描述為具有對GPIIb/IIIa的高結(jié)合親和力。這些包括線性肽、蛇毒肽、和環(huán)肽。也 可以使用非肽RGD模擬物。與抗體片段類似，可以以化學(xué)法將RGD肽與FVIII偶聯(lián)?；蛘撸?可以使用重組DNA技術(shù)將RGD序列插入B域編碼序列中或者用于完全或部分替換FVIII的 B域編碼序列并表達(dá)。
[0071] 可以使用類似的方法來制備靶向性FIX。例如，可以將靶向域連接至FIX分子的激 活域（氨基酸殘基191-226或145-180,這取決于偏愛，即+/-信號序列），其在將FIX激活 為FIXa中以蛋白水解方式除去。域可以使用與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)諸如激活域中的巰基、胺、 和羧基基團(tuán)反應(yīng)性的交聯(lián)劑來化學(xué)連接，或者經(jīng)由碳水化合物鏈來連接，如上文針對FVIII 所討論的。也可以使用重組技術(shù)（其中將靶向域的氨基酸序列插入FIX激活肽中），或者替 換激活肽序列的一部分來生成融合分子。插入的靶向域序列可以編碼單鏈抗體，或者其它 血小板結(jié)合肽序列，諸如R⑶結(jié)合肽。
[0072] 藥物組合物和用途
[0073] 本發(fā)明還涉及包含治療有效量的本發(fā)明的靶向性凝固因子和藥學(xué)可接受賦形劑 或載體的藥物組合物。"藥學(xué)可接受賦形劑或載體"是可以添加至活性成分以幫助配制或穩(wěn) 定制劑，而且不對患者引起顯著不利毒物學(xué)效果的物質(zhì)。此類賦形劑或載體的例子是本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的，包括水、糖諸如麥芽糖或蔗糖、清蛋白、鹽等。其它賦形劑或載體記載于 例如 Remington, s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, Pa.,第 20 版，2000)。此類組合物會含有有效量的靶向性凝固因子以及合適量的賦形劑或載體以制備 適合于對有所需要的患者有效施用的藥學(xué)可接受組合物。
[0074] 例如，可以以可隨出血事件的嚴(yán)重性而變化的劑量對罹患血友病A的受試者胃腸 內(nèi)施用偶聯(lián)物。靜脈內(nèi)施用的平均劑量范圍為對于手術(shù)前適應(yīng)癥為每千克40個單位、對于 微小出血為每千克15至20個單位、和對于維持劑量為8小時期間里施用的每千克20至40 個單位。
[0075] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于治療血液學(xué)疾病的方法，包括對有所需 要的患者施用治療有效量的上述靶向性凝固因子。
[0076] 如本文中所使用的，"治療有效量"指在血流或靶組織中提供想要水平的靶向性因 子（或自靶向性形式釋放的相應(yīng)的非偶聯(lián)因子）所需要的靶向性凝固因子量。精確量會取 決于許多因素，包括但不限于治療性組合物的成分和物理特征、預(yù)期的患者群體、個體患者 考慮因素等，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定。
[0077] 如本文中所使用的，"患者"指接受醫(yī)學(xué)護(hù)理和/或治療的人或動物個體。
[0078] 本文中所描述的多肽、材料、組合物、和方法意圖是本發(fā)明的代表性例子，并且要 理解的是，本發(fā)明的范圍不受例子范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)可，本發(fā)明可以用所公 開多肽、材料、組合物和方法的變型實施，并且認(rèn)為此類變型在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0079] 呈現(xiàn)以下實施例來例示本文中所描述的發(fā)明，但是不應(yīng)以任何方式解釋為限制本 發(fā)明的范圍。 實施例
[0080] 為了本發(fā)明可以得到更好的理解，列出了以下實施例。這些實施例僅出于例示目 的，并且不要以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過提及而完整收錄本文中所提及的 所有出版物。
[0081] 實施例1 :對GPIIb/IIIa結(jié)合具有高親和力的經(jīng)修飾的RGD肽
[0082] 已經(jīng)描述了環(huán)肽有力地且選擇性地結(jié)合GPIIb/IIIa。使用一種此類肽，即 Integrilin作為祀向域以與FVIII連接，因為已經(jīng)顯示了 Integrilin能選擇性結(jié)合 GPIIb/IIIa。通過在馬來酰亞胺模塊中添加能選擇性與蛋白質(zhì)中游離的半胱氨酸殘基 偶聯(lián)的短PEG接頭末端來修飾Integri 1 in。經(jīng)修飾的Integri 1 in稱作僅具有接頭的 BHRF-1 (圖2A)，和具有接頭和熒光素（FITC)的BHRF-3(圖2B)。如圖3中所顯示的，經(jīng)修 飾的Integrilin保留對GPIIb/IIIa的親和力，因為它們有力地阻斷血纖蛋白原（Fbn)結(jié) 合固定化的GPIIa/IIIb。
[0083] 使用固相結(jié)合測定法來測量肽對GPIIb-IIIa的結(jié)合，其中測量測試化合 物競爭血纖蛋白原結(jié)合。如下實施測定法。以O(shè).mL/孔Uyg/mU緩沖液A(20mM Tris ρΗ7· 5、0· 15M NaCl、和 ImM 各種 MgCl2、CaCl2、和 MnCl2)中稀釋的）將純化的 GPIIb-IIIa(Innovative Research，Novi，MI)包被至 96 孔 Immulon-B 板上。于 4°C溫育過 夜后，用緩沖液8(50禮1^8?!17.5、0.1]\1似(：1、和各111111%(：1 2、〇3(：12、和]\111(：12)中的3.5% BSA將平板于30°C封閉1小時。用緩沖液B清洗3次后，將稀釋的肽或蛋白質(zhì)溶液與0. 1 % BSA/緩沖液B中的3. 5nM生物素化的血纖蛋白原組合，并添加至孔，于30°C溫育2小時。 清洗（3次，緩沖液B)后，于30°C添加1:4000鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶（HRP) (Pierce Chemical Co.，Rockford, IL)達(dá)1小時。最終的清洗步驟（3次，緩沖液B)后，用 Ultra TMB(3, 3'，5, 5'-四苯基聯(lián)苯胺）（Pierce Chemical Co.，Rockford, IL)將平板顯影 5分鐘，用等體積的2M硫酸停止。于450nm讀取平板吸光度，并使用4參數(shù)Logistic擬合 來測定IC 5(I值。
[0084] 然后，經(jīng)由位于FVIII的B域中的半胱氨酸（Cys)殘基來將經(jīng)修飾的Integrilin 肽（BHRF1)與 FVIII 偶聯(lián)。
[0085] 實施例2 :偶聯(lián)GPIIb/IIIa結(jié)合肽與FVIII
[0086] 全長FVIII的多肽序列是本領(lǐng)域中已知的（參見例如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 和如W02006/053299中所披露的）。
[0087] FVIII的濃縮和游離巰基基團(tuán)的脫帽
[0088] 可以在蛋白質(zhì)表達(dá)過程中通過培養(yǎng)基中存在的半胱氨酸來為位于重組FVIII的B 域中的Cys殘基加帽，但是它容易如下通過還原劑諸如TCEP的處理來除去。將FVIII (20mL) 融化，并在于2000x g (約3153rpm)在低溫（cold)中旋轉(zhuǎn)25分鐘的兩個·Αη--(：〇η?-15筒 (Millipore，Billerica，MA)中濃縮。2. 8mL保留物的濃度是約0. 8-0. 9mg/mL，其通過使用 Nano'Drop? 分光光度計（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)的 A280 得到。然后使用 10mL Zeba脫鹽筒來交換緩沖液，所述10mL Zeba脫鹽筒用50mM Tris、150mM NaCl、2.5mM 〇8(：12和10(^口1117\￥6611方>-80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯）預(yù)平衡。獲得具有0.8811^/ mL濃度的2. 8mL蛋白質(zhì)溶液。然后將TCEP添加至終濃度0. 68mM，并于4°C將混合物溫和地 顛轉(zhuǎn)約3小時。通過兩次連續(xù)的Zeba筒旋轉(zhuǎn)來除去TCEP，并容許FVIII再次氧化至少30 分鐘，之后添加肽。除去TCEP后，F(xiàn)VIII濃度測量為0· 768mg/mL( "KG-R"）。
[0089] R⑶靶向肽的偶聯(lián)
[0090] 為 了將經(jīng)修飾的 Integrilin 肽 BHRF-1 偶聯(lián)至 FVIII，將 0· 294mg 肽（M. W. 1225) 添加至48yL干的二甲亞砜（DMS0)以制備5mM儲備溶液。然后將此儲備溶液（34.4UL) 添加至2. 8mL KG-R。80分鐘后，通過添加等摩爾量的半胱氨酸來淬滅反應(yīng)。然后針對起始 Tris緩沖液（2升）廣泛透析反應(yīng)混合物。BHRF-1-FVIII的終濃度是0. 74mg/mL，而產(chǎn)量是 2mg。也使用類似的方法來制備BHRF-3-FVIII。
[0091] 如圖3中所顯示的，經(jīng)修飾的Integrilin肽，S卩BHRF-1和BHRF-3保留對GPIIb/ Ilia的親和力，因為它們有力地阻斷血纖蛋白原（Fbn)結(jié)合固定化的GPIIa/IIIb。與 BHRF-1偶聯(lián)的FVIII (FVIII-BHRF-1)顯示在抑制血纖蛋白原結(jié)合固定化的GPIIb/IIIa上 的高效力（IC5Q = 0· 043+/-0. 05nM(N = 3))。這甚至比親本BHRF-1肽更有力。表1中顯 示了結(jié)果。
[0092] 表 1
【權(quán)利要求】
1. 一種靶向性凝固因子，其包含與至少一個特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域連接 的凝固因子。
2. 權(quán)利要求1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX;和/ 或其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子；和/或其中所述血細(xì)胞是血小板，而所 述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/IIIa ;和或其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽；和/或其中所述 域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
3. 權(quán)利要求1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽，而所述域是 與所述FVIII的B域連接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
4. 權(quán)利要求3的靶向性凝固因子，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗 GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
5. -種藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1的靶向性凝固因子和藥學(xué)可接受 賦形劑或載體。
6. -種用于治療血液學(xué)疾病的方法，包括對有所需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1 的靶向性凝固因子。
7. -種用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞表面的方法，包括連接所述凝固因子與至少一種 結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX ;和/或其中所述 血細(xì)胞是血小板或紅細(xì)胞；和/或其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子；和/或 其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/IIIa ;和/或其中所述凝固因子是功 能性FVIII多肽；和/或其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段，和/或其 中進(jìn)一步從所述血細(xì)胞的表面釋放所述凝固因子。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述凝固因子是FVIII，而所述域是與所述FVIII的B域連 接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗GPIIb/IIIa 抗體的單鏈片段。
【文檔編號】C07K19/00GK104059155SQ201410228024
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2008年5月16日
【發(fā)明者】理查德.費(fèi)爾德曼, 吉-揚(yáng).金, 蔣海英, 柯克.麥克萊恩, 潘峻亮, 格倫.皮爾斯, 伍國鴻, 趙曉燕 申請人:拜耳醫(yī)藥保健有限公司