一種從石斛中提取毛蘭素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從石斛中提取毛蘭素的方法，該方法包括應(yīng)用堿性有機溶劑提取、非水相有機溶劑混合萃取、小孔徑樹脂分離、有機溶劑結(jié)晶等工藝,制備得到高純度毛藍(lán)素方晶，與現(xiàn)有的有工藝方法相比，具有工藝簡單、粗提溶劑成本低、目標(biāo)物非水相萃取雜質(zhì)少、柱層析陳本低、填料分離精度高可反復(fù)利用，層析溶劑陳本低、對環(huán)境污染相對較輕、毛蘭素得率高、純度高等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】—種從石斛中提取毛蘭素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效、低成本的從石斛中提取毛蘭素的方法，屬于植物活性物質(zhì)提取領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛屬l>endro0iirn Sw.為蘭科最大屬之一，共有1500多種植物,廣泛分布于亞洲、歐洲及大洋洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)。我國約有80多種，主要分布于西南、華東及華南地區(qū)。石斛屬植物為附生植物，生長環(huán)境獨特，對小氣候環(huán)境要求十分嚴(yán)格。多生于溫涼高濕的陰坡、半陰坡微酸性巖層峭壁上，群聚分布，上有林木遮陰，下有溪溝水源，冬春季節(jié)稍耐干旱，但嚴(yán)重缺水時常葉片落盡，裸莖渡過不良環(huán)境，到溫暖季節(jié)重新萌發(fā)枝葉。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，石斛屬多種植物的新鮮或干燥莖被收做藥用，統(tǒng)稱石斛herba dendrobii。2000年以前《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。千年以來它一直和靈芝、人參、冬蟲夏草等一樣被列為上品中藥。其性味:甘淡微咸。性屬清潤，清中有補，補中有清。古人把石斛當(dāng)作藥材。據(jù)《本草備至》敘述，它對人體有驅(qū)解虛熱，益精強陰等療效。
[0003]國產(chǎn)石斛分布于秦嶺、淮河以南，我國的云南、廣西、廣東、貴州、臺灣為國產(chǎn)本屬植物的分布中心。石斛屬植物中主要有效成分為石斛類多糖及生物堿，另外還有酚類、菲類、倍半萜類及香豆素等。石斛多糖是從石斛中提取出來的具有多種生物活性且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖或其復(fù)合物。大量研究證明，石斛聯(lián)芐類成分具有抗腫瘤、增強免疫力、抗鼻咽癌、抗白內(nèi)障等多種作 用。我國目前對石斛菲類的開發(fā)利用并不多，從2006年至今，涉及石斛聯(lián)芐類毛蘭素的文獻技術(shù)不多，關(guān)于石斛毛蘭素的功效研究、產(chǎn)品開發(fā)等還存在著很大的研究價值和空間。
[0004]鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。有人比較了石斛屬的多種植物，發(fā)現(xiàn)聯(lián)芐類化合物是鐵皮石斛的抗癌特征性成分。隨著人們對聯(lián)芐類功效的認(rèn)識增多，已有人發(fā)現(xiàn)聯(lián)芐類化合物中的毛蘭素具有較強的抗腫瘤生物活性?，F(xiàn)代分析化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，石斛中含有石斛菲類、聯(lián)芐類等多種生物活性成分，毛蘭素是其中聯(lián)節(jié)類化合物的一種，其結(jié)構(gòu)式為3-羥基_4，3，4，5，-四甲氧基聯(lián)節(jié)，分子量為318，在石解屬植物中有廣泛分布，其中鼓槌石斛中含量較高、其次流蘇石斛。文獻報道藥效學(xué)研究證實，毛蘭素對肺癌、肝癌、乳腺癌、多種人體腫瘤的生長均有抑制作用，是一種天然低毒的抗肝癌腫瘤藥物?，F(xiàn)有專利報道毛蘭素提取方法有超臨界二氧化碳萃取法，有機溶劑提取氯仿萃取、硅膠柱層析法、液相制備法等。這些提取方法設(shè)備投資成本高，萃取目標(biāo)物雜質(zhì)過多、氯仿萃取法毛蘭素萃取物含量僅能達(dá)到1_10%、提取硅膠柱層析溶劑用量大周期長、填料重復(fù)利用性低，不適宜工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有產(chǎn)業(yè)化分離毛蘭素技術(shù)的不足，提供一種工藝設(shè)備簡單、生產(chǎn)周期短、投資規(guī)模小、對環(huán)境污染相對較輕、制備成本低、得率較高的高純度毛蘭素的提取方法。
[0006]本發(fā)明通過以下方法實現(xiàn)本發(fā)明目的:
(1)取干燥石斛全株粉碎至粒度為40-60目；
(2)石斛粉末用pH=8-10的甲醇溶液回流提取3次，提取溫度為75-80°C，其中第一次回流提取2-3h，第二次提取1.5-2h，第三次提取0.5-lh，合并三次提取液，回收甲醇得到粗提物；
(3)用乙腈超聲溶解粗提物，過濾，不溶殘渣再使用乙腈溶解一次過濾，合并乙腈溶解液，備用；
(4)按體積比1:1-1:2的比例，在乙腈溶解液中加入石油醚二氯甲烷混合溶液或者環(huán)己烷二氯甲烷混合溶液萃取，靜置分層后取上層液，下層液再萃取分層，重復(fù)2-3次，合并上層液，下層液經(jīng)薄層鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)無毛蘭素斑點后丟棄，上層液濃 縮得到油性膏狀物；
(5)采用新配置的pH=10的甲醇溶液回流提取油性膏狀物3次，溫度60-80°C，合并三次提取液，用鹽酸調(diào)節(jié)提取液PH=6后，靜置24后過濾，即得到含有毛藍(lán)素的沉淀，含有毛藍(lán)素的沉淀用甲醇、乙醇或丙醇溶解成上樣液，備用；
(6)取小孔徑分離樹脂加壓裝柱，用體積百分比濃度為35-50%的甲醇、乙醇或丙酮水溶液平衡柱子，然后將上樣液緩慢滴加上樣，上樣完畢靜置1-1.5h后用體積百分比濃度為40-60%甲醇、乙醇或丙酮水溶液加壓洗脫，薄層鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)收集毛蘭素段洗脫液，濃縮回收溶劑，最后用石油醚冰乙酸混合溶液、石油醚丙酮混合溶或丙酮結(jié)晶2次，固體干燥即得到毛蘭素，HPLC檢測含量大于98.0%。
[0007]本發(fā)明方法步驟(2)中pH=8_10的甲醇溶液是指用碳酸氫鈉、氫氧化鈉或氨水調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為50-70%的甲醇溶液的pH為8-10而制得。
[0008]本發(fā)明方法步驟(4)中石油醚二氯甲烷混合溶液是石油醚與二氯甲烷按體積比5:1-7:1的比例混合制得；環(huán)己烷二氯甲烷混合溶液是環(huán)己烷和二氯甲烷按體積比10:1-17:1的比例混合制得。
[0009]本發(fā)明方法步驟(5)中pH=10的甲醇溶液是指用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為40-80%的甲醇溶液的pH為10而制得。
[0010]本發(fā)明方法步驟(6)中小孔徑分離樹脂為市售MCI樹脂、紫杉醇分離專用樹脂R型樹脂Chix)ma-R204 (北京瑞樂康分離科技有限公司)或樹脂PRP5 (北京聚福樹脂廠)。
[0011]本發(fā)明方法石油醚冰乙酸混合溶液是石油醚和冰乙酸按體積比9:2混合制得，石油醚丙酮混合溶是石油醚和丙酮按體積比9:1混合制得。
[0012]本發(fā)明方法的優(yōu)點如下:因毛藍(lán)素結(jié)構(gòu)式上帶有羥基用堿性有機溶劑提取，使毛蘭素成鹽，水溶解性更好，使其在低濃度溶劑中就能充分溶出，無需高濃度有機溶劑提取。萃取時采用乙腈溶解石斛粗提物，石油醚或環(huán)己烷混合二氯甲烷的混合溶劑萃取，薄層鑒別其石油醚二氯甲烷層斑點非常清晰，萃取物雜質(zhì)含量較低，萃取含量檢測毛藍(lán)素含量大于25%，最大的雜質(zhì)為鼓槌菲和流蘇菲。將萃取物堿水回流后去除小極性脂溶性雜質(zhì)后上小孔徑加壓分離樹脂、采用不同濃度丙酮、乙醇或甲醇等為洗脫劑均能較好分離得到TLC上毛蘭素單一斑點。能有效分離開主要雜質(zhì)鼓槌菲和流蘇菲；高精細(xì)分離小孔徑吸附樹脂不會造成對樣品的死吸附，其可重復(fù)利用，洗脫溶劑成本低、上樣量大等優(yōu)點。
[0013]本發(fā)明方法工藝設(shè)備簡單、生產(chǎn)周期短、投資規(guī)模小、對環(huán)境污染相對較輕、制備成本低,毛蘭素得率高、純度高,適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0014]下面通過實施例對本發(fā)明方法作進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護范圍不局限于所述內(nèi)容，實施例中如無特殊說明，使用試劑為常規(guī)市售試劑，或按常規(guī)方法制得的試劑。
[0015]實施例1:本從石斛中提取毛蘭素的方法，具體操作如下:
(1)取云南德宏產(chǎn)干燥鼓槌石斛I公斤粉碎至粒度為60目；
(2)石斛粉末用pH=10的甲醇溶液(用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為60%的甲醇溶液的PH為10而制得)回流提取三次，提取溫度8 0°C，其中第一次5L甲醇溶液回流提取2小時過濾，濾渣用4L甲醇溶液第二次回流提取1.5小時后過濾，濾渣用4L甲醇溶液第三次回流提取0.5小時過濾，合并三次提取液；回收甲醇得黑紅色粗提膏狀物113克；
(3)用乙腈250ml超聲溶解粗提物，過濾，不溶殘渣再使用50毫升乙腈溶解一次，過濾，合并乙腈溶解液得300ml，備用；
(4)在乙腈溶解液300ml中加入300ml石油醚二氯甲烷混合溶液(石油醚與二氯甲烷按體積比5:1的比例混合制得)萃取，靜置分層后取上層液，下層液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分層，重復(fù)3次，合并上層液，下層液萃取三次后經(jīng)薄層鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)無毛蘭素斑點后丟棄，上層液濃縮得到12g油性膏狀物；
(5)使用新配pH=10甲醇溶液(用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為50%的甲醇溶液的pH為10而制得)50ml回流提取油性膏狀物，溫度60°C回流3次；合并三次提取液，用質(zhì)量百分比濃度為0.5%鹽酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH=6后，靜置24后過濾，即得到含有毛藍(lán)素的沉淀3.5g，含有毛藍(lán)素的沉淀用5ml甲醇溶解成上樣液，備用；
(6)取100g小孔徑分離樹脂PRP5(北京聚福樹脂廠)加壓裝柱，用體積百分比濃度為50%的甲醇水溶液平衡柱子，然后將上樣液緩慢滴加上樣，上樣完畢靜置Ih后體積百分比濃度為60%甲醇水溶液加壓洗脫，TLC鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)收集毛蘭素段洗脫液，回收甲醇，最后用石油醚冰乙酸混合溶液(體積比9:2)結(jié)晶2次，固體干燥得毛藍(lán)素0.6克，HPLC檢測含量98.6%。
[0016]實施例2:本從石斛中提取毛蘭素的方法，具體操作如下:
(1)取云南廣南干燥鐵皮石斛I公斤粉碎到50目；
(2)石斛粉末用PH=9的甲醇溶液(用氫氧化鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為70%的甲醇溶液的PH為9而制得)回流提取三次，提取溫度75°C，其中第一次5L甲醇溶液回流提取提取2.5小時后過濾，濾渣用4L甲醇溶液回流提取2小時后過濾，濾渣用4L甲醇溶液回流提取0.6小時后過濾，合并三次提取液；回收甲醇得黑紅色粗提膏狀物71克；
(3)粗提物用乙腈250毫升超聲溶解，過濾，不溶殘渣再使用50毫升乙腈溶解一次，過濾，合并乙腈溶液得300毫升，備用；
(4)在乙腈溶解液300ml中加入450ml石油醚二氯甲烷混合溶液(石油醚與二氯甲烷按體積比7:1的比例混合制得)萃取，靜置分層后取上層液，下層液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分層，重復(fù)3次，合并上層液，下層液萃取三次后經(jīng)薄層鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C )與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)無毛蘭素斑點后丟棄，上層液濃縮得到5g油性膏狀物；
(5)使用新配pH=10甲醇溶液(用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為40%的甲醇溶液的PH為10而制得)50ml回流提取油性膏狀物，溫度70°C回流3次；合并三次提取液，用質(zhì)量百分比濃度為0.5%鹽酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH=6后，靜置24后過濾，即得到含有毛藍(lán)素的沉淀0.9g，含有毛藍(lán)素的沉淀用5ml甲醇溶解成上樣液，備用；
(6)取100g小孔徑分離樹脂MCIGELCHP55Y加壓裝柱，用體積百分比濃度為40%的乙醇水溶液平衡柱子，然后將上樣液緩慢滴加上樣，上樣完畢靜置1.5h后體積百分比濃度為50%乙醇水溶液加壓洗脫，TLC鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)收集毛蘭素段洗脫液，回收乙醇，最后用石油醚冰丙酮混合溶液(體積比9:1)結(jié)晶2次，固體干燥得毛藍(lán)素0.1克，HPLC檢測含量99.1%。[0017]實施例3:本從石斛中提取毛蘭素的方法，具體操作如下:
(1)取云南廣南干燥流蘇石斛I公斤粉碎到40目；
(2)石斛粉末用PH=8的甲醇溶液(用氨水調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為50%的甲醇溶液的pH為8而制得)回流提取三次，提取溫度78°C，其中第一次5L甲醇溶液回流提取提取3小時后過濾，濾渣用4L甲醇溶液回流提取1.5小時后過濾，濾渣用4L甲醇溶液回流提取I小時后過濾，合并三次提取液；回收甲醇得黑紅色粗提膏狀物150克；
(3)粗提物用乙腈250毫升超聲溶解，過濾，不溶殘渣再使用50毫升乙腈溶解一次，過濾，合并乙腈溶液得300毫升，備用；
(4)在乙腈溶解液300ml中加入600ml環(huán)己烷二氯甲烷混合溶液(環(huán)己烷與二氯甲烷按體積比10:1的比例混合制得)萃取，靜置分層后取上層液，下層液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分層，重復(fù)3次，合并上層液，下層液萃取三次后經(jīng)薄層鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)無毛蘭素斑點后丟棄，上層液濃縮得到7g油性膏狀物；
(5)使用新配pH=10甲醇溶液(用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為80%的甲醇溶液的PH為10而制得)50ml回流提取油性膏狀物，溫度80°C回流3次；合并三次提取液，用質(zhì)量百分比濃度為0.5%鹽酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH=6后，靜置24后過濾，即得到含有毛藍(lán)素的沉淀2.4g，含有毛藍(lán)素的沉淀用5ml乙醇溶解成上樣液，備用；
(6)取100g小孔徑紫杉醇分離專用樹脂R型樹脂Chroma-R204加壓裝柱,用體積百分比濃度為35%的丙酮水溶液平衡柱子，然后將上樣液緩慢滴加上樣，上樣完畢靜置1.2h后體積百分比濃度為40%丙酮水溶液加壓洗脫，TLC鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)收集毛蘭素段洗脫液，回收丙酮，最后用丙酮結(jié)晶2次，固體干燥得毛藍(lán)素0.4克，HPLC檢測含量98.0%。
[0018]實施例4:本從石斛中提取毛蘭素的方法，具體操作如下:
(1)取云南廣南干燥流蘇石斛I公斤粉碎到45目；
(2)石斛粉末用PH=IO的甲醇溶液(用氨水調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為55%的甲醇溶液的pH為10而制得)回流提取三次，提取溫度80°C，其中第一次5L甲醇溶液回流提取提取2小時后過濾，濾渣用4L甲醇溶液回流提取1.7小時后過濾，濾渣用4L甲醇溶液回流提取0.8小時后過濾，合并三次提取液；回收甲醇得黑紅色粗提膏狀物120克；
(3)粗提物用乙腈250毫升超聲溶解，過濾，不溶殘渣再使用50毫升乙腈溶解一次，過濾，合并乙腈溶液得300毫升，備用；
(4)在乙腈溶解液300ml中加入350ml環(huán)己烷二氯甲烷混合溶液(環(huán)己烷與二氯甲烷按體積比15:1的比例混合制得)萃取，靜置分層后取上層液，下層液再添加石油醚二氯甲烷混合溶液萃取分層，重復(fù)2次，合并上層液，下層液萃取2次后經(jīng)薄層鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C )與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)無毛蘭素斑點后丟棄，上層液濃縮得到IOg油性膏狀物；
(5)使用新配pH=10甲醇溶液(用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為60%的甲醇溶液的PH為10而制得)50ml回流提取油性膏狀物，溫度65°C回流3次；合并三次提取液，用質(zhì)量百分比濃度為0.5%鹽酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH=6后，靜置24后過濾，即得到含有毛藍(lán)素的沉淀3.0g，含有毛藍(lán)素的沉淀用5ml乙醇溶解成上樣液，備用；
(6)取100g小孔徑紫杉醇分離專用樹脂R型樹脂Chroma-R204加壓裝柱,用體積百分比濃度為45%的丙酮水溶液平衡柱子，然后將上樣液緩慢滴加上樣，上樣完畢靜置1.5h后體積百分比濃度為45%丙酮水溶液加壓洗脫，TLC鑒別(展開劑為石油醚(60~90°C)與乙酸乙酯按體積比6:4混合制得)收集毛蘭素段洗脫液，回收丙酮，最后用丙酮結(jié)晶2次，固體干燥得毛藍(lán)素0.5克，HPLC檢測含量98.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種從石斛中提取毛蘭素的方法，其特征在于按如下步驟進行: (1)取干燥石斛全株粉碎至粒度為40-60目； (2)石斛粉末用pH=8-10的甲醇溶液回流提取3次，提取溫度為75-80°C，其中第一次回流提取2-3h，第二次提取1.5-2h，第三次提取0.5-lh，合并三次提取液，回收甲醇得到粗提物； (3)用乙腈超聲溶解粗提物，過濾，不溶殘渣再使用乙腈溶解一次過濾，合并乙腈溶解液，備用； (4)按體積比1:1-1:2的比例，在乙腈溶解液中加入石油醚二氯甲烷混合溶液或者環(huán)己烷二氯甲烷混合溶液萃取，靜置分層后取上層液，下層液再萃取分層，重復(fù)2-3次，合并上層液，下層液經(jīng)薄層鑒別無毛蘭素斑點后丟棄，上層液濃縮得到油性膏狀物； (5)采用新配置的pH=10的甲醇溶液回流提取油性膏狀物3次，溫度60-80°C，合并三次提取液，用鹽酸調(diào)節(jié)提取液pH=6后，靜置24后過濾，即得到含有毛藍(lán)素的沉淀，含有毛藍(lán)素的沉淀物用甲醇、乙醇或丙醇溶解制備成上樣溶液備用； (6)取小孔徑分離樹脂加壓裝柱，用體積百分比濃度為35-50%的甲醇、乙醇或丙酮水溶液平衡柱子，然后將上樣樣品溶液緩慢滴加上樣，上樣完畢靜置1-1.5h后用體積百分比濃度為40-60%甲醇、乙醇或丙酮水溶液加壓洗脫，薄層鑒別收集毛蘭素段洗脫液，濃縮回收溶劑，最后用石油醚冰乙酸混合溶液、石油醚丙酮混合溶或丙酮結(jié)晶2次，固體干燥即得到毛蘭素。
2.根據(jù)權(quán)利要求 1所述從石斛中提取毛蘭素的方法，其特征在于:步驟(2)中pH=8-10的甲醇溶液是指用碳酸氫鈉、氫氧化鈉或氨水調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為50-70%的甲醇溶液的pH為8-10而制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述從石斛中提取毛蘭素的方法，其特征在于:步驟(4)中石油醚二氯甲烷混合溶液是石油醚與二氯甲烷按體積比5:1-7:1的比例混合制得；環(huán)己烷二氯甲烷混合溶液是環(huán)己烷和二氯甲烷按體積比10:1-17:1的比例混合制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述從石斛中提取毛蘭素的方法，其特征在于:步驟(5)中pH=10的甲醇溶液是指用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)質(zhì)量百分比濃度為40-80%的甲醇溶液的pH為10而制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述從石斛中提取毛蘭素的方法，其特征在于:步驟(6)中小孔徑分離樹脂為MCI樹脂、紫杉醇分離專用樹脂R型樹脂Chix)ma-R204或樹脂PRP5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述從石斛中提取毛蘭素的方法，其特征在于:石油醚冰乙酸混合溶液是石油醚和冰乙酸按體積比9:2混合制得，石油醚丙酮混合溶是石油醚和丙酮按體積比9:1混合制得。
【文檔編號】C07C41/34GK103980099SQ201410233326
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】蔡群虎, 田方 申請人:云南金九地生物科技有限公司