鰩血管生成抑制因子1的適配子及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】鰩血管生成抑制因子1的適配子及其篩選方法和應(yīng)用。一組能識別鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的適配子及其制備方法。寡核苷酸序列包括SEQ?ID?No.2～11，其分別具有較高的親和特異性，可以用于鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的檢測。
【專利說明】鰩血管生成抑制因子1的適配子及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，本發(fā)明涉及一種鰩血管生成抑制因子I適配子及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年來，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是由 SELEX 技術(shù)(Systematic evolut1n of ligands by exponentialenrichment)生物文庫技術(shù)篩選獲得的，該技術(shù)的原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，其隨機(jī)序列長度在20-100個(gè)堿基左右。利用單鏈寡核苷酸分子構(gòu)像靈活多變的特性，將隨機(jī)寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留以空間構(gòu)像與靶分子結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得多種靶分子的特異寡核苷酸適配子，即aptamer。利用SELEX技術(shù)篩選獲得的aptamer識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，核酸類配基具有更多的優(yōu)越性，如不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運(yùn)輸?shù)?。更重要的是，aptamer比抗體具有更高的特異性，甚至能識別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)分子。而且aptamer的靶分子非常廣泛，小至染料分子，大至完整的病毒顆粒和細(xì)菌病原體，甚至完整的細(xì)胞也可以通過消減SELEX技術(shù)篩選出高親和力的寡核苷酸適配子。
[0003]鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)以下簡稱鰩功能區(qū)，鰩血管生成抑制因子I是我們首次從南海海域一種鰩組織中分離出來的蛋白質(zhì)(分子量42KD)。研究結(jié)果顯示:鰩血管生成抑制因子I顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌細(xì)胞誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生成；無論是腹腔注射還是灌胃都顯著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，減少腫瘤組織微血管密度，下凋促血管生成因子VEGF的表達(dá)；對裸小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也有強(qiáng)抑制作用；下調(diào)促轉(zhuǎn)移因子⑶44v6和ErBb2的表達(dá)；與5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果更顯著。鰩血管生成抑制因子I的作用靶點(diǎn)與美國基因技術(shù)研究所開發(fā)出的抗癌新藥Avastin不同。Avastin是基因工程產(chǎn)品，是VEGF的抗體，其作用靶點(diǎn)是VEGF ;鰩血管生成抑制因子I是天然產(chǎn)物，它不僅作用于VEGF，還作用于bFGF和TOGF。因此，針對鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)進(jìn)行特異性的鑒別和篩選是本領(lǐng)域一貫的追求。
[0004]基于以上考慮，本發(fā)明以鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白為目的靶蛋白，采用SELEX技術(shù)獲得了 10條鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白特異的aptamer，組合應(yīng)用能夠迅速、敏感、特異的檢測到鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白。由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性能穩(wěn)定、合成方便且廉價(jià)、經(jīng)修飾后可直接用于熒光或化學(xué)發(fā)光、發(fā)色方法檢測靶綁帶，因此操作簡單、直接。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供不僅具有檢測快速、操作簡單、穩(wěn)定性高于抗體等特點(diǎn)，而且制備方法容易、制備周期較短的一組能識別鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列及其制備方法。
[0006]所述能識別鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列，包括SEQ IDN0.2-11，且采用其中的一條寡核苷酸序列就能完成對鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的識別檢測；
[0007]所述一組能識別鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列的制備方法包括以下步驟:
[0008]1、合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC——
[0009]N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 為 35 個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；
[0010]2、將寡核苷酸文庫分別與鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白混合后進(jìn)行SELEX篩選，獲得適配子富集文庫；
[0011]3、SELEX篩選完成后，對獲得的適配子富集文庫進(jìn)行克隆測序；
[0012]4、選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA，進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證，篩選獲得能識別鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
[0014]1、鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的制備
[0015]采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酵母重組表達(dá)的方式獲得具有與鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白相同生物活性的鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白，該蛋白序列如SEQ IDNO:1所示；蛋白溶液的濃度為15mg/ml。
[0016]2、文庫和引物的合成
[0017]2.1、合成用于篩選的 ssDNA 寡核苷酸文庫(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——
[0018]N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 為 35 個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；
[0019]引物Pl:TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC ；
[0020]引物P2: CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。
[0021]2.2、適配子的SELEX篩選，具體方法如下:
[0022]2.2.1ssDNA與鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的結(jié)合、分離，具體方法如下:
[0023]取100μΜ的ssDNA寡核苷酸文庫4μ L，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至100 μ 1，95 °C變性5min,冰浴1min后加入100 μ I鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白，搖床結(jié)合30min,再6000rpm離心5min,棄上清,然后用IX結(jié)合緩沖液洗沉淀，棄上清；在沉淀中再加入IX結(jié)合緩沖液100 μ L,96°C加熱5min,然后15000rpm離心10min,取上清液,對沉淀再次加熱并離心，合并上清液，則可分離得到與鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白有親和力的ssDNA次級文庫；所述2X結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20 X結(jié)合緩沖液配方為IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM.MgC12、pH7.4。
[0024]2.2.2ssDNA與鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的結(jié)合、分離，具體方法如下:
[0025]將步驟2.2.1分離得到的能與鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白結(jié)合的ssDNA，再與100 μ I鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白搖床結(jié)合30min，后續(xù)步驟同步驟2.2.1，則可分離到與鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白都有親和力的ssDNA次級文庫。
[0026]2.2.3不對稱PCR擴(kuò)增ssDNA，具體方法如下:
[0027]對步驟2.2.2分離獲得的ssDNA次級文庫進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增，總體積為25 μ I的不對稱 PCR 擴(kuò)增體系為:10XPCR 緩沖液:2μ I ；Ρ1(10μΜ):1μ I ；Ρ2(0.2μΜ):1μ I ；dNTP (各 2.5mM):0.4μ I ；MgCl2(25mM):1.2μ I ； ssDNA 模板(0.2 μ g/ μ I):2μ I ；Taq DNA聚合酶(5u/μ I):0.2μ I ；ddH20:17.2μ I ;PCR 反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性 4min，然后進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)94°C變性30s，58。。退火30s，72。。延伸20s，最后72°C延伸7min ；
[0028]2.2.4親和力的測定，具體方法如下:
[0029]2.2.4.1擴(kuò)增:用帶有地高辛標(biāo)記的引物Pl不對稱PCR擴(kuò)增篩選出來的ssDNA次級文庫，擴(kuò)增條件和參數(shù)與步驟2.2.3的不對稱PCR擴(kuò)增體系和參數(shù)相同；
[0030]2.2.4.2與蛋白結(jié)合:取步驟2.2.4.1擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物100μ L，95°C變性5min,冰浴1min后加入100 μ L蛋白中，充分混合,在室溫下結(jié)合30min,然后6000rpm離心，分離蛋白與上清液，蛋白中包含有與蛋白中結(jié)合的帶地高辛標(biāo)記的ssDNA，上清液中是未結(jié)合的ssDNA，同時(shí)做一不加ssDNA的空白，即用2 X結(jié)合緩沖液代替PCR產(chǎn)物，同樣進(jìn)行上述操作；
[0031]2.2.4.3洗滌:將蛋白用IX結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌I次，6000rpm離心，棄上清，
取蛋白；
[0032]2.2.4.4與酶標(biāo)兔抗地高辛抗體結(jié)合:在蛋白中加入100 μ LI: 900TBS稀釋的過量的酶標(biāo)兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)lOmin，使之與蛋白中的地高辛標(biāo)記的ssDNA
結(jié)合；
[0033]所述TBS為0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法為:先水溶8.5~9g NaCl，再加Tris-HCl (0.5M、ρΗ7.6)溶液 100ml,最后加水定容至 IL ；0.5Μ Tris-HCl (ρΗ7.6，100ml)溶液配制方法:稱取Tris6.06g,加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至7.6，定容至10mlo
[0034]2.2.4.5洗滌:6000rpm離心，去上清，再用IX結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌3次，得蛋白；
[0035]2.2.4.6ΤΜΒ (四甲基聯(lián)苯胺)顯色:加入400 μ L雙蒸水重懸蛋白，再加入200 μ LTMB顯色液，避光顯色1min后，以2mol/L H2S04200 μ L終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值0D450，該值即反映與菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即OD結(jié)合，空白同樣進(jìn)行上述步驟
2.2.4.3,2.2.4.4,2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白；
[0036]所述TMB顯色液使用常規(guī)的配制方法配制。
[0037]2.2.4.7測定PCR產(chǎn)物中DNA的摩爾濃度:取步驟2.2.4.1擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物，以已知濃度梯度的初始ssDNA文庫為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳法定量測定PCR產(chǎn)物中的DNA含量，獲得相應(yīng)DNA的摩爾濃度，進(jìn)而可以計(jì)算出100 μ L PCR產(chǎn)物中的DNA摩爾數(shù)。
[0038]2.2.4.8計(jì)算相應(yīng)文庫的親和力:
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種用于適配子篩選的鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白，其序列為SEQ ID NO:1所示。
2.一種識別鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列，其特征在于為SEQ IDN0.2-11任一條序列所示。
3.權(quán)利要求2所示的寡核苷酸序列用于篩選鰩血管生成抑制因子I功能區(qū)蛋白的應(yīng)用 。
【文檔編號】C07K14/46GK104031137SQ201410249737
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】張壘, 張勇 申請人:杭州普英生物科技有限公司