一種高靈敏度的多菌靈完全抗原的合成方法
【專利摘要】一種高靈敏度的多菌靈完全抗原的合成方法，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明中合成了由多菌靈的類似物2-氯苯并咪唑和6-氨基己酸反應(yīng)得到的具有羧基的半抗原H1，與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原；基于異源包被可以進(jìn)一步提高抗體的靈敏度，所以在ELISA操作中，用多菌靈的類似物氨基氯苯并咪唑和6-氨基己酸反應(yīng)得到半抗原H2與OVA偶聯(lián)得到偶聯(lián)物作為包被原。本發(fā)明制備的完全抗原呈現(xiàn)出特異性的多菌靈抗原決定簇，使得篩選出高特異性的多菌靈單克隆抗體成為可能。產(chǎn)生的抗體特異性高、靈敏度高，可用于建立酶聯(lián)免疫吸附分析方法和膠體金試紙快速檢測法，從而用于快速檢測食品中的多菌靈殘留。
【專利說明】一種高靈敏度的多菌靈完全抗原的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高靈敏度的多菌靈完全抗原的合成方法，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]多菌靈是一種廣譜、高效、低毒內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:
【權(quán)利要求】
1.一種多菌靈完全抗原的合成方法，其特征在于步驟如下: (1)前體261的合成:將氨基己酸甲酯鹽酸鹽與等摩爾量的2-氯苯并咪唑混合，于二異丙基乙基胺中微波150°C過夜反應(yīng)13h，得到產(chǎn)物，經(jīng)純化，即得到前體261，產(chǎn)率為10% ； (2)多菌靈半抗原Hl的合成:將步驟(1)制備的前體261溶于四氫呋喃中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，60°C旋蒸除去四氫呋喃，以lmol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6~7，制備色譜純化得多菌靈半抗原Hl ； (3)多菌靈完全抗原的制備:將多菌靈半抗原Hl與載體蛋白上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)，即得到多菌靈完全抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述多菌靈完全抗原的合成方法，其特征在于步驟(1)所述的氨基己酸甲酯鹽酸鹽由氨基己酸和氯化亞砜在甲醇中回流制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述多菌靈完全抗原的合成方法，其特征在于:步驟(2)所述多菌靈半抗原Hl，其結(jié)構(gòu)簡式如下所示:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述多菌靈完全抗原的合成方法，其特征在于:步驟(3) 所述載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、匙孔血藍(lán)蛋白KLH、血藍(lán)蛋白LPH、雞卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述多菌靈完全抗原的合成方法，其特征在于步驟(3)多菌靈完全抗原的制備具體步驟為: O半抗原Hl溶液的活化:取多菌靈半抗原Hl 35mg，加入2mL DMF溶解，再分別加入N-羥基琥珀酰亞胺NHS和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽EDC，其中多菌靈半抗原Hl: NHS: EDC的摩爾比為1: 1.5: 2，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，即得活化的半抗原Hl溶液； 2)蛋白溶液的制備:取160mg載體蛋白，再加入1mL0.1M pH9.6碳酸鹽緩沖液，即得蛋白溶液； 3)反應(yīng):將步驟I)制備的活化的半抗原Hl溶液慢速滴加到步驟2)制備的蛋白溶液中，室溫下反應(yīng)8h ;用PBS緩沖液透析3天，期間換水6次，即得到多菌靈完全抗原。
6.用權(quán)利要求5所述方法制備的多菌靈完全抗原的應(yīng)用，其特征在于:采用多菌靈半抗原Hl制備的完全抗原免疫動(dòng)物得到多克隆抗體或單克隆抗體，并應(yīng)用于快速檢測食品中的多菌靈殘留。
【文檔編號(hào)】C07K1/107GK104017070SQ201410291378
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】徐麗廣, 胥傳來, 嚴(yán)會(huì)娟, 匡華, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)