與磷脂酰絲氨酸結(jié)合的Fc融合構(gòu)建體及其治療用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有不尋常的特性組合的新型結(jié)合磷脂酰絲氨酸的構(gòu)建體，及一系列的其診斷和治療綴合物。所述新型構(gòu)建體有效地結(jié)合疾病中的磷脂酰絲氨酸靶并增強(qiáng)其破壞，并還可以將所附著的成像或治療劑特異性地遞送至疾病位點(diǎn)。還公開了在腫瘤血管靶向、癌癥診斷和治療中使用所述新型構(gòu)建體組合物、治療綴合物及其組合以及用于治療病毒感染和其他疾病的方法。
【專利說明】與磷脂酰絲氨酸結(jié)合的Fc融合構(gòu)建體及其治療用途
[0001] 本申請是申請日為2006年1月24日、申請?zhí)枮?00680007064. 8、發(fā)明名稱為"與 磷脂酰絲氨酸結(jié)合的Fc融合構(gòu)建體及其治療用途"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 本申請要求于2005年1月24日提交的共同未決的美國臨時申請系列號 60/646, 333的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請的公開內(nèi)容，包括說明書、權(quán)利要求、附圖和序列，特別引 入本文作為參考而并未放棄。
[0004] 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及磷脂酰絲氨酸生物學(xué)領(lǐng)域，以及涉及治療腫瘤和病毒感染。它提供了 不尋常的新構(gòu)建體、組合物、方法和組合，其用于腫瘤血管靶向和癌癥治療，和用于治療病 毒感染及其他疾病。本發(fā)明特別提供了具有不尋常的特性組合的新型結(jié)合磷脂酰絲氨酸的 構(gòu)建體，及其診斷和治療綴合物。所述新型構(gòu)建體有效地結(jié)合磷脂酰絲氨酸疾病靶并增強(qiáng) 其破壞，并還可以將治療劑遞送至特定位點(diǎn)，因此提供了一系列用于治療癌癥、病毒感染和 其他疾病的方法。
[0006] 2.相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0007] 腫瘤細(xì)胞對化學(xué)治療劑的抗性在臨床腫瘤學(xué)中是一個重要問題。在腫瘤治療中 要解決的另一主要問題是期望"全部細(xì)胞殺死"，即，殺死所有能不受控制地生長并替代通 過治療可去除的任何腫瘤塊的所謂"克隆形成性"惡性細(xì)胞。盡管在此領(lǐng)域內(nèi)有了一定的 進(jìn)展，但這仍是為何許多普遍形式的人類癌癥依然耐受有效的化學(xué)治療干預(yù)的兩個主要原 因。
[0008] 對于開發(fā)接近"全部細(xì)胞殺死"的療法這一目的而言，某些類型的腫瘤比其他類型 更易受治療的影響。例如，軟組織腫瘤（例如淋巴瘤）以及血液和造血器官腫瘤（例如白 血?。┩ǔ１葘嶓w瘤（例如癌）對化學(xué)療法更具有反應(yīng)性。
[0009] 軟組織腫瘤和基于血液的腫瘤對于化學(xué)療法的易感性的一個原因是淋巴瘤和白 血病細(xì)胞對于化學(xué)治療干預(yù)的更大的可達(dá)性。簡而言之，大部分化學(xué)治療劑到達(dá)實體瘤塊 的所有細(xì)胞比到達(dá)軟組織腫瘤和基于血液的腫瘤的所有細(xì)胞要難得多，因此完成全部細(xì)胞 殺死也要困難得多。增加化學(xué)治療劑的劑量在大部分情況下常常會導(dǎo)致毒副作用，這通常 限制了常規(guī)抗腫瘤劑的效力。
[0010] 另一腫瘤治療策略是使用"免疫毒素",其中用抗腫瘤細(xì)胞抗體將毒素遞送至腫瘤 細(xì)胞。不過，和化學(xué)治療方法一樣，免疫毒素療法在應(yīng)用于實體瘤時也存在著明顯的缺點(diǎn)。 例如，抗原陰性或抗原缺乏性細(xì)胞能存活并再恢復(fù)生成腫瘤或?qū)е逻M(jìn)一步的轉(zhuǎn)移。實體瘤 對基于抗體的療法有耐受性的另一原因是腫瘤塊對于大分子試劑例如抗體和免疫毒素來 說通常是不能滲透的。腫瘤內(nèi)的物理擴(kuò)散距離和間質(zhì)壓力都是對此類型療法的重要限制因 素。
[〇〇11] 一種經(jīng)改良的治療策略是靶向?qū)嶓w瘤的血管結(jié)構(gòu)。靶向腫瘤血管而非腫瘤細(xì)胞本 身具有一定的優(yōu)越之處，即不太可能導(dǎo)致抗性腫瘤細(xì)胞的形成，而且被靶向的細(xì)胞容易接 近。此外，血管的破壞導(dǎo)致抗腫瘤效應(yīng)的擴(kuò)大，因為許多腫瘤細(xì)胞依賴單一血管來提供其氧 氣和養(yǎng)分。示例性的血管靶向劑（VTAs)在美國專利號5, 855, 866、5, 965, 132、6, 261，535、 6, 051，230和6, 451，312中得到描述，這些文獻(xiàn)描述了將抗細(xì)胞劑和毒素靶向遞送至腫瘤 血管結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物。
[0012] 另一有效的血管靶向方法是將凝血因子靶向在腫瘤血管結(jié)構(gòu)或基質(zhì)中表達(dá) 或吸附的標(biāo)記物（Huang等人，1997 ;美國專利號6, 093, 399、6, 004, 555、5, 877, 289和 6, 036, 955)。將促凝劑而非毒素遞送至腫瘤血管結(jié)構(gòu)具有另外的優(yōu)越之處，即降低了免疫 原性，并甚至減少了產(chǎn)生毒副作用的風(fēng)險。如美國專利號5, 877, 289中所公開的，用于此類 腫瘤特異性"凝血配體（coaguligand) "中的優(yōu)選凝血因子是截短形式的人凝血誘導(dǎo)蛋白 質(zhì)，組織因子（TF)，其是血液凝固的主要起始因子。
[0013] 最近，磷脂酰絲氨酸（PS)被鑒別為腫瘤血管結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記物（Ran等人， 1998)。這引起了對用于遞送抗細(xì)胞劑、毒素和凝血因子至腫瘤血管的新型抗PS免疫綴合 物的開發(fā)（美國專利號6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213)。此外，還發(fā)現(xiàn)未綴合的針對 PS的抗體無需與治療劑附著就可發(fā)揮抗癌作用，這已知為用于腫瘤血管靶向和治療的磷脂 酰絲氨酸"裸露抗體"方法（美國專利號6, 406, 693)。
[0014] 盡管前述方法已促進(jìn)了腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展，但仍需要開發(fā)另外的治療和血管靶 向劑以擴(kuò)展治療選擇的數(shù)目和功效。重要的進(jìn)展將是鑒定具有抗癌特性及在其他系統(tǒng)例如 在治療病毒感染中的療效的一組治療劑。產(chǎn)生可以由兩種人組分制備的新型靶向構(gòu)建體， 特別是不依賴于使用用于靶向的抗體的那些構(gòu)建體，將是重要的發(fā)展，其提供了經(jīng)改善的 安全性。設(shè)計和開發(fā)增強(qiáng)患者自身針對疾病的應(yīng)答，即增加宿主效應(yīng)器功能的新試劑，將在 治療應(yīng)答最大化中具有重大價值，特別是其中相同機(jī)制可以影響癌癥及其他疾病例如病毒 感染和疾病。
[0015] 發(fā)明概沭
[〇〇16] 本發(fā)明通過提供新型構(gòu)建體、組合物、方法和組合用于腫瘤血管結(jié)構(gòu)靶向和癌癥 治療和用于治療病毒感染及其他疾病，從而解決了現(xiàn)有技術(shù)的前述和其他需要。本發(fā)明特 別提供了具有不尋常的特性組合的新型結(jié)合磷脂酰絲氨酸的構(gòu)建體，它有效地結(jié)合疾病中 的磷脂酰絲氨酸靶并增強(qiáng)其破壞，例如通過增加宿主效應(yīng)器功能。還提供了一系列的綴合 物組合物，其中所述新型構(gòu)建體附著至其他的生物學(xué)試劑、診斷劑和治療劑，它們可以被特 異地遞送至疾病位點(diǎn)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在腫瘤血管結(jié)構(gòu)靶向、癌癥治療中使用所述新 型構(gòu)建體和綴合物及其組合以及用于治療病毒感染和其他疾病的有效方法。
[0017] 當(dāng)用于整個申請文件各處時，術(shù)語"a"和"an"用于指"至少一種（個）"、"至少第 一種（個）"、"一種（個）或多種（個）"或"眾多"的所提及的組分或步驟，除非在其后特 別說明了上限。因此，如本文所使用的，"a construct"指"至少第一種構(gòu)建體"。正如任何 單一試劑的量一樣，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容將了解各組合的可操作限度和參 數(shù)。
[0018] 受體-抗體（ReceptorBody)和β -抗體（BetaBody):本發(fā)明首先提供了一系列 結(jié)合磷脂酰絲氨酸的構(gòu)建體組合物，其中所述構(gòu)建體包含可操作地附著至至少第一種抗體 Fc區(qū)的至少第一種磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白、多肽或受體。連接磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白、多肽 或"受體"至"抗體" Fc區(qū)產(chǎn)生了術(shù)語"受體-抗體"，這在本文中用于指本發(fā)明的結(jié)合磷脂 酰絲氨酸的Fc構(gòu)建體。
[0019] 本發(fā)明構(gòu)建體或受體-抗體一般包含至少第一種抗體Fc區(qū)，其可操作地附著至至 少第一種磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白或多肽、受體、配體或肽。在本文中簡潔地使用的術(shù)語"磷 脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白"指所有磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白、多肽、受體、配體和肽。
[0020] 在許多實施方案中，"磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白"在附著至抗體Fc區(qū)從而形成本發(fā)明 構(gòu)建體時將保留磷脂酰絲氨酸結(jié)合特性。自然，磷脂酰絲氨酸結(jié)合功能的保留在希望用于 靶向暴露于疾病位點(diǎn)中的磷脂酰絲氨酸的那些構(gòu)建體中是重要的。然而，不是本發(fā)明的所 有實施方案都局限于在附著至抗體Fc區(qū)時保留磷脂酰絲氨酸結(jié)合特性的磷脂酰絲氨酸結(jié) 合蛋白。
[0021] 值得注意的是，本發(fā)明包括了與"帶切口的β 2-糖蛋白I"連接的抗體Fc區(qū)，其中 帶切口的β 2-糖蛋白I不再結(jié)合磷脂酰絲氨酸（參見下文）。因為帶切口的β 2-糖蛋白 I已知是血管發(fā)生的抑制劑（美國專利申請
【發(fā)明者】還考慮到由于最 初施加凝血配體所引起的凝血酶的產(chǎn)生有可能導(dǎo)致中樞血管上進(jìn)一步的VCAM-1誘導(dǎo)作用 (Sluiter等人，1993)，從而產(chǎn)生擴(kuò)大的信號并導(dǎo)致對腫瘤內(nèi)區(qū)域的明顯破壞。這種類型的 凝血配體誘導(dǎo)的其他可靶向標(biāo)記物的表達(dá)以及由此產(chǎn)生的信號放大在美國專利6, 036, 955 中有所描述。
[0189] 正如本文所顯示的，盡管通過施加抗VCAM-1凝血配體觀察到其定位于小鼠心臟 和肺中表達(dá)VCAM-1的血管上，但此構(gòu)建物并未在這樣的非腫瘤部位誘發(fā)血栓形成。而且， 抗VCAM-1凝血配體對小鼠的毒性并不比具有無關(guān)特異性的對照凝血配體更大，再次表明 了 VCAM-1在心臟和肺血管上的組成性表達(dá)不會產(chǎn)生毒性。由于VCAM-1是人類腫瘤血管內(nèi) 皮中天然存在的標(biāo)記物，此結(jié)果對于當(dāng)前凝血配體療法的臨床進(jìn)展尤為重要。另一方面，此 現(xiàn)象還為
【發(fā)明者】提供了獨(dú)一無二的視野，導(dǎo)致了不同的破壞腫瘤血管結(jié)構(gòu)的方法。
[0190] A.發(fā)現(xiàn)用于腫瘤治療的裸露的抗磷脂酰絲氨酸抗體
[0191]
【發(fā)明者】試圖了解抗VCAM-1凝血配體能結(jié)合組成性表達(dá)于心臟和肺血管上的 VCAM-1卻不會在那些血管中引起血栓形成這一現(xiàn)象背后的機(jī)制。對于此只憑經(jīng)驗觀察到的 現(xiàn)象有許多科學(xué)的可能性解釋，通常與腫瘤環(huán)境中的前血栓形成特性以及心臟和肺中任何 血纖維蛋白溶解誘因相關(guān)。
[0192] 一般而言，在凝血系統(tǒng)（纖維蛋白沉積）和纖溶系統(tǒng)（纖維蛋白被酶降解）之間 存在著生物學(xué)平衡。不過，在惡性病，尤其是腫瘤中，此平衡被破壞，導(dǎo)致了凝血的異常激活 (血凝過快或"前血栓形成狀態(tài)")。盡管進(jìn)行了大量的研究，直到最近才了解了腫瘤環(huán)境中 前血栓形成狀態(tài)的明確分子機(jī)制。
[0193] 在詳細(xì)分析許多可能后，
【發(fā)明者】推斷抗VCAM-1凝血配體之所以不會在正常組織 血管內(nèi)引起血栓形成是由于這些血管內(nèi)腔表面缺乏磷脂酰絲氨酸（PS)。因此，為了證實這 一理論，不僅需要證明在這些正常血管上無磷脂酰絲氨酸，還需要證實它們存在于腫瘤相 關(guān)血管的內(nèi)腔側(cè)面上。
[0194] 因此，
【發(fā)明者】用免疫組織化學(xué)染色來確定靜脈內(nèi)注射入患腫瘤小鼠體內(nèi)的單克隆 抗磷脂酰絲氨酸（抗PS)抗體的分布狀態(tài)。這些研究顯示，在心臟和肺中表達(dá)VCAM- 1的 血管缺乏PS，而在腫瘤中表達(dá)VCAM-1的血管也表達(dá)PS。
【發(fā)明者】還發(fā)現(xiàn)結(jié)合PS的膜聯(lián)蛋白 V在體外和體內(nèi)均阻斷抗-VCAM-1 · tTF凝血配體的作用，這進(jìn)一步證實了在凝血配體的作 用中需要表面PS的表達(dá)。
[0195] 因此，至少在某種程度上，抗VCAM-1凝血配體在正常心臟和肺血管上無血栓形成 作用的原因可以解釋為：由于缺乏磷脂酰絲氨酸，意味著正常血管上沒有凝血復(fù)合物組裝 所需要的前凝血表面。在缺乏表面PS的情況下，抗-VCAM-ι *tTF與表達(dá)VCAM-ι的心臟和 肺血管結(jié)合，但不會誘發(fā)血栓形成。相反，在腫瘤中表達(dá)VCAM-1的血管顯示出同時表達(dá)了 表面PS。因此，凝血配體與腫瘤血管結(jié)合，并局部激活了凝血因子，從而形成了堵塞的血栓。
[0196] 除了描述抗VCAM-1凝血配體的腫瘤特異性血栓形成作用外，在腫瘤血管內(nèi)腔表 面上磷脂酰絲氨酸的特異表達(dá)還使
【發(fā)明者】能夠解釋早期研究中觀察到卻不能理解的前血 栓形成表型。PS表達(dá)在腫瘤血管結(jié)構(gòu)的前血栓形成狀態(tài)中起了重要的作用。
[0197] 在他們發(fā)現(xiàn)代表性的氨基磷脂一磷脂酰絲氨酸特異地表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)腔表面 而不表達(dá)于正常血管中后，
【發(fā)明者】推斷其他的氨基磷脂也具有作為治療干預(yù)靶目標(biāo)的可 能。
【發(fā)明者】因此以靶向于磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺（PE)這些氨基磷脂為基礎(chǔ)開發(fā)了 腫瘤血管系統(tǒng)靶向和治療方法。
[0198] -旦磷脂酰絲氨酸作為腫瘤血管結(jié)構(gòu)特異標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)得到證實，
【發(fā)明者】開始 開發(fā)一系列靶向磷脂酰絲氨酸的免疫毒素和凝血配體用于腫瘤治療中。正如美國專利 6, 406, 693中所解釋的，當(dāng)研究在將毒素或凝血劑遞送至腫瘤血管結(jié)構(gòu)時利用磷脂酰絲氨 酸進(jìn)行靶向的可能性時，
【發(fā)明者】意外的發(fā)現(xiàn)在未附加任何效應(yīng)子的情況下裸露的抗PS抗 體對體內(nèi)腫瘤血管具有破壞作用?？拱被字贵w既特異定位于腫瘤血管系統(tǒng)又發(fā)揮伴隨 的破壞作用從而導(dǎo)致腫瘤壞死的能力是根本未曾預(yù)料到的。
[0199] 這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生使用結(jié)合磷脂酰絲氨酸的未綴合的或"裸露的"抗體的腫瘤治療，如 引入本文作為參考的美國專利6, 406, 693中描述的。盡管在本領(lǐng)域公認(rèn)的動物模型中的 抗腫瘤效應(yīng)在美國專利6, 406, 693中得到了證實，并在本文中進(jìn)行了擴(kuò)展，但從美國專利 6, 406, 693之前的研究不能預(yù)測氨基磷脂能夠充當(dāng)腫瘤血管系統(tǒng)的安全且有效的可靶向標(biāo) 記物。
[〇2〇〇] B.使用抗磷脂酰絲氨酸抗體的廣泛的腫瘤治療
[0201] 在不同細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸通常被隔離至質(zhì)膜雙層的內(nèi)表面（Gaffet等人， 1995 Julien等人，1995)，并且這種脂質(zhì)隔離產(chǎn)生不對稱的跨雙層（Williamson和 Schlegel，1994)。本發(fā)明人在較早的時候證實了，PS移位至腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，并 且至少在顯著的程度上，這種現(xiàn)象的發(fā)生與凋亡或其他細(xì)胞死亡機(jī)制無關(guān)（美國專利 6, 406, 693)。因此，在腫瘤環(huán)境中PS的表面表達(dá)不是細(xì)胞死亡的結(jié)果，也不是由它引起了 即時的細(xì)胞破壞。盡管在各種實體瘤中在完整血管內(nèi)皮細(xì)胞上始終可以檢測到PS暴露，腫 瘤血管內(nèi)皮卻不是真正凋亡的，而是形態(tài)學(xué)上完好的（盡管不同于正常組織中的情形），并 且是代謝活躍的。這對于基于PS靶向的治療方法來說是重要的，這意味著在腫瘤血管內(nèi)皮 細(xì)胞中PS向外膜的移位對于PS用作成功治療（利用裸露的抗體或治療性綴合物）的可靶 向?qū)嶓w來說是足夠穩(wěn)定的。
[0202] 通過開發(fā)對不同磷脂具有強(qiáng)特異性的生物學(xué)工具，本發(fā)明人已確定陰離子磷脂在 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上也是上調(diào)的。因此，陰離子磷脂是腫瘤血管系統(tǒng)的特異且穩(wěn)定的標(biāo)記 物，這使得能夠利用可與陰離子磷脂結(jié)合的裸露抗體和免疫綴合物二者進(jìn)行治療干預(yù)。
[0203] 在正常條件下，陰離子磷脂在靜息哺乳動物細(xì)胞表面上基本上是不存在的。磷脂 酰絲氨酸是最豐富的質(zhì)膜陰離子磷脂，其在正常條件下在大部分細(xì)胞類型中被緊密隔離于 質(zhì)膜內(nèi)表面（Williamson 和 Schlegel，1994 ;Zwaal 和 Schroit，1997)。另一種主要的陰離 子磷脂，磷脂酰肌醇（PI)，也主要位于質(zhì)膜的內(nèi)表面（Calderon和DeVires，1997)。次要的 陰離子磷脂，磷脂酸（PA)和磷脂酰甘油（PG)，只在少數(shù)細(xì)胞類型中檢測到，但它們也表現(xiàn) 出主要位于質(zhì)膜的內(nèi)表面（Hinkovska-Galcheva等人，1989)。另一種陰離子磷脂，心磷脂， 存在于線粒體膜上而不存在于質(zhì)膜上（Daum，1985)。
[0204] 中性磷脂也不對稱地分布于質(zhì)膜內(nèi)。磷脂酰乙醇胺（PE)這種中性氨基磷脂主要 位于內(nèi)表面。含膽堿的中性磷脂，磷脂酰膽堿（PC)和鞘磷脂（SM)，主要位于外表面。
[0205] PS的不對稱性通過ATP-依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即氨基磷脂移位酶（Mg2+ATP酶）來維持， 該酶催化氨基磷脂從質(zhì)膜外表面向內(nèi)表面轉(zhuǎn)運(yùn)（Seigneuret和Devaux，1984)。PS不對稱 性的喪失或崩潰是由于質(zhì)膜內(nèi)的這些磷脂向外運(yùn)動所造成的，或者是由于對移位酶的抑制 (Bitbol等人，1987 ;Comfurius等人，1990)、PS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激活和/或爬行酶（Zhao等人， 1998)或ABC-1翻轉(zhuǎn)酶（floppase) (Hamon等人，2000)的激活所引起的，所述爬行酶和翻轉(zhuǎn) 酶是雙向轉(zhuǎn)運(yùn)所有脂質(zhì)的Ca2+依賴性酶。也可激活鞘磷脂酶以產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，其促進(jìn)跨雙 層的脂質(zhì)轉(zhuǎn)位（Contreras等人，2003)。
[0206] 在不同的病理和生理條件下都觀察到了 PS不對稱性的喪失，包括細(xì)胞損傷、程序 性細(xì)胞死亡和凋亡（Blankenberg等人，1998 ;Bombeli等人，1997)、細(xì)胞衰老（Herrmann和 Devaux，1990)、血小板活化（Rote 等人，1993 ;Zwaal 等人，1989)、損傷（Boyle 等人，1996) 和惡性轉(zhuǎn)化（Sugimura等人，1994)。PS的暴露還在成肌細(xì)胞（Sessions和Horwitz，1981) 與營養(yǎng)細(xì)胞（Adler等人，1995)的胞間融合、細(xì)胞遷移（Vogt等人，1996)和細(xì)胞脫粒（Demo 等人，1999)中起作用。內(nèi)皮細(xì)胞對由凝血酶（Qu等人，1996)、|丐離子載體或佛波酯（Julien 等人，1997)、高脂血癥（Lupu等人，1993)和非溶胞濃度的補(bǔ)體蛋白質(zhì)C5b-9 (Christiansen 等人，1997)所誘導(dǎo)的Ca2+流量增加產(chǎn)生應(yīng)答而將PS外在化。在無外源激活劑或細(xì)胞損傷 的情況下在惡性細(xì)胞內(nèi)也觀察到自發(fā)的PS暴露（Utsugi等人，1991)。
[0207] 膜PS暴露后產(chǎn)生幾個主要的后果。有吞噬作用的巨噬細(xì)胞識別、附著并消滅PS 陽性的衰老和凋亡細(xì)胞（McEvoy等人，1986 ;Tait和Smith，1999)。PS還介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞與 凝血酶活化的內(nèi)皮細(xì)胞附著（Qu等人，1996)。補(bǔ)體系統(tǒng)被PS激活并促成PS陽性細(xì)胞的裂 解（Test和Mitsuyoshi，1997)。最后，PS的暴露通過為凝血復(fù)合物的裝配和活化提供帶負(fù) 電荷的脂質(zhì)表面而促使前凝血劑移動至內(nèi)皮上（Williamson和Schlegel，1994 ;Bombeli等 人，1997)。長期以來已對腫瘤內(nèi)皮的促血栓形成特征有所認(rèn)識（Donati和Falanga，2001)。
[0208] 本發(fā)明人認(rèn)識到腫瘤內(nèi)皮的損傷和活化是由以下物質(zhì)引起的：1)腫瘤來源的 細(xì)胞因子，例如白介素-1和腫瘤壞死因子，它們激活內(nèi)皮并誘導(dǎo)細(xì)胞粘附分子的表達(dá) (Shaughnessy等人，1989;0rr等人,2000) ;2)由粘附于內(nèi)皮上的白細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧類 別（R0S) (Orr等人，2000);和3)作為代謝副產(chǎn)物（Shaughnessy等人，1989 ;Soares等人， 1994)或作為暴露于低氧之后又復(fù)氧的結(jié)果（Zulueta等人，1995)由腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生的 R0S。這些觀察結(jié)果暗示，可能由腫瘤內(nèi)皮中的這些應(yīng)激產(chǎn)生Ca2+流量，接著通過爬行酶的 活化或氨基磷脂移位酶的抑制而引起PS暴露。
[0209] 為了檢測細(xì)胞表面陰離子磷脂，本發(fā)明人創(chuàng)造了新的單克隆抗體9D2,它與陰離子 磷脂而非中性磷脂反應(yīng)。9D2因此與普通的氨基磷脂結(jié)合劑區(qū)別開來，因為它與磷脂酰絲氨 酸這種陰離子氨基磷脂結(jié)合，而不與磷脂酰乙醇胺這種中性氨基磷脂結(jié)合。9D2抗體還比天 然配體膜聯(lián)蛋白V更特異于陰離子磷脂，所述膜聯(lián)蛋白V除了與陰離子磷脂結(jié)合外還強(qiáng)烈 結(jié)合 PE (Blankenberg 等人，1998)。
[0210] 正如本申請所詳述的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)9D2和膜聯(lián)蛋白V在經(jīng)靜脈內(nèi)注射到帶有各 種類型實體瘤的小鼠中后特異地定位于腫瘤內(nèi)皮。這個發(fā)現(xiàn)證實了本發(fā)明人的假設(shè)，即磷 脂酰絲氨酸和陰離子磷脂通常在腫瘤血管內(nèi)皮表面變得暴露，且可用作腫瘤治療（和成 像）的靶分子。
[0211] 從本發(fā)明中顯現(xiàn)的主要發(fā)現(xiàn)之一是磷脂酰絲氨酸和陰離子磷脂暴露在腫瘤內(nèi)皮 的表面上（實施例VI ;Ran和Thorpe, 2002 ;Ran等人，2002b)。此現(xiàn)象通過使用下列兩種選 擇性結(jié)合陰離子磷脂的獨(dú)立試劑得到證明：單克隆抗體9D2,這是本發(fā)明人特別為了證明 這點(diǎn)而開發(fā)的，以及膜聯(lián)蛋白V。
[0212] 9D2抗體和膜聯(lián)蛋白V以高親和力和特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸和陰離子磷脂，它 們作為脂質(zhì)體被吸附至塑料，或者被呈現(xiàn)在體外活化或凋亡內(nèi)皮細(xì)胞的膜表面上。9D2與 PS、PA和CL強(qiáng)烈結(jié)合，但與PI和PG的結(jié)合則弱得多。正如過去所發(fā)現(xiàn)的，膜聯(lián)蛋白V除 了結(jié)合 PS、CL、PA、PI 和 PG 之外，還結(jié)合 PE(Andree 等人，1990 ;Schla印fer 等人，1987 ; Boustead等人，1993 ;Blackwood和Ernst, 1990)。9D2抗體對磷脂酰絲氨酸和陰離子磷脂 的識別在血清存在或不存在的情況下都是相同的，這表明結(jié)合不需要血清輔因子。9D2與陰 離子磷脂的結(jié)合不需要Ca2+離子，而膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合則需要Ca 2+。
[0213] 在經(jīng)PS包被的平板上的交叉阻斷研究顯示，9D2和膜聯(lián)蛋白V不會相互阻斷與 PS的結(jié)合。這表明所述兩種試劑識別PS分子上的不同表位，或更有可能識別不同包裝形 式的PS。膜聯(lián)蛋白V被認(rèn)為結(jié)合平坦的PS表面，而抗PS抗體則被認(rèn)為結(jié)合六角形包裝的 PS (Rauch和Janoff，1990)。兩種形式都可能存在于經(jīng)PS包被的平板上。這些實際的交叉 阻斷研究（實施例VI)還用于表明，一旦提供參照抗體（例如9D2)，就能容易地鑒別出有效 地競爭結(jié)合陰離子磷脂的抗體，即與參照抗體結(jié)合基本上相同表位的抗體。
[0214] 本申請還顯示，9D2抗體和膜聯(lián)蛋白V特異性地定位于腫瘤血管和定位于在體內(nèi) 檢測的所有腫瘤的壞死區(qū)域內(nèi)和周圍的腫瘤細(xì)胞（實施例VI)。腫瘤中15 - 40%的血管具 有磷脂酰絲氨酸陽性內(nèi)皮。相反，正常組織中沒有血管具有可檢測的外在化陰離子磷脂。表 達(dá)PS的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞是有活力的。它們?nèi)狈?xì)胞凋亡標(biāo)記物（活性胱天蛋白酶-3，TUNEL)， 在形態(tài)學(xué)上是完整的并且是代謝活躍的，并且血管有輸送血液和溶解物的功能。
[0215] 9D2對腫瘤血管系統(tǒng)的染色特異性通過以下幾點(diǎn)得到證明：1)用對照大鼠 IgM則 無腫瘤血管的染色；2)用由陰離子磷脂制備的脂質(zhì)體可以阻斷體外9D2或膜聯(lián)蛋白V與經(jīng) H202處理的內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，而由中性磷脂制備的脂質(zhì)體則不能；3)發(fā)現(xiàn)用去污劑或有機(jī) 溶劑從腫瘤切片提取出磷脂就消除了染色；和4)9D2或膜聯(lián)蛋白V都不定位于正常器官中 的靜止內(nèi)皮上。
[0216] 腫瘤血管系統(tǒng)中由9D2或膜聯(lián)蛋白V定位的主要陰離子磷脂是磷脂酰絲氨酸，因 為它是最豐富的陰離子磷脂，并且它在細(xì)胞表面上的暴露受環(huán)境變化或損傷的調(diào)控。為了 檢驗?zāi)[瘤內(nèi)皮細(xì)胞上陰離子磷脂暴露的機(jī)制，進(jìn)行了一系列的研究，其中用已知存在于腫 瘤微環(huán)境中的各種因子和條件來處理體外的內(nèi)皮細(xì)胞（實施例VII)。低氧后復(fù)氧、酸性和 凝血酶使PS在活內(nèi)皮細(xì)胞上的暴露提高至當(dāng)所有細(xì)胞均凋亡時所觀察到的水平的10 - 22%。炎性細(xì)胞因子（TNFa和IL-1)也會微弱但明確地誘發(fā)PS暴露。
[0217] 這些發(fā)現(xiàn)與下列可能性相一致：在腫瘤中，低氧/復(fù)氧結(jié)合炎性細(xì)胞因子、凝血酶 和酸性會誘導(dǎo)磷脂酰絲氨酸暴露于血管內(nèi)皮上。盡管對于實施本發(fā)明來說并不需要了解 確切的機(jī)制，但腫瘤細(xì)胞可能以作為代謝的副產(chǎn)物或?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)而產(chǎn)生R〇S(Zulueta等 人，1995)。腫瘤細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可能誘導(dǎo)了內(nèi)皮上的白細(xì)胞粘附分子，其介導(dǎo)活化的 巨噬細(xì)胞、多形核細(xì)胞和血小板與腫瘤內(nèi)皮粘附，和進(jìn)一步的R0S分泌。然后，R0S可能通 過含巰基的轉(zhuǎn)運(yùn)分子的氧化或脂質(zhì)的過氧化來誘導(dǎo)PS移位（Herrmann和Devaux，1990)，這 可能通過引起Ca2+流入或從細(xì)胞內(nèi)C備中釋放Ca 2+而實現(xiàn)（Wang和Joseph, 2000)。事實 上，過氧化物已顯示可在體外通過涉及谷胱甘肽氧化和/或脂質(zhì)過氧化而不是細(xì)胞凋亡的 機(jī)制來誘導(dǎo)活內(nèi)皮細(xì)胞上的PS暴露（van Gorp等人，1999)。
[0218] PS和其他陰離子磷脂的暴露在某種程度上解釋了長久以來認(rèn)識到的腫瘤內(nèi)皮的 促凝血狀態(tài)（Donati和Falanga，2001)。陰離子磷脂提供了用于凝血因子聚集和裝配的表 面（Bevers等人，1985 ;Dachary_Prigent等人，1996)。它還為幫助白細(xì)胞浸潤入腫瘤中的 循環(huán)性巨噬細(xì)胞（McEvoy等人，1986)、T淋巴細(xì)胞（Qu等人，1996)和多形核細(xì)胞提供了附 著位點(diǎn)。
[0219] 在本文中所詳細(xì)描述的進(jìn)一步研究中，本發(fā)明人創(chuàng)造并表征了稱為3G4的單克隆 抗體，其針對磷脂酰絲氨酸和陰離子磷脂。這種抗體還顯示出特異性定位于腫瘤中的血管 內(nèi)皮細(xì)胞，減少腫瘤的血管供應(yīng)（vascularity)和血漿容量并且延緩腫瘤生長。
[0220] 在血清或β 2-糖蛋白I存在下，3G4抗體以高親和力結(jié)合吸收在塑料上的陰離子 磷脂，以及在激活或凋亡的細(xì)胞表面上的陰離子磷脂。細(xì)胞上的3G4結(jié)合模式與針對陰離 子磷脂的膜聯(lián)蛋白Α5或9D2抗體的模式?jīng)]有區(qū)別。所有3種試劑結(jié)合類似于膜泡的質(zhì)膜 簇，這與在用Η 202處理的內(nèi)皮細(xì)胞上的其他觀察一致（van Gorp等人，1999)。如同9D2,3G4 識別所測試的所有陰離子磷脂，包括對氧化有抗性的具有飽和脂肪酸的合成磷脂，和溶血 磷脂。
[0221] 不像9D2,3G4與陰離子磷脂的結(jié)合在血清完全不存在下被部分抑制，并且當(dāng)添加 β2-糖蛋白I時恢復(fù)。因此，3G4識別脂質(zhì)-β2-糖蛋白I復(fù)合物中的表位。無關(guān)地，3G4 當(dāng)施用于動物時顯示是安全的，并且與在文獻(xiàn)中報道的與抗磷脂綜合征（APS)有關(guān)的抗體 的病理學(xué)效應(yīng)不相關(guān)。
[0222] 在注射到帶有同位人乳腺M(fèi)DA-MB-435腫瘤的小鼠中后，3G4特異地定位于腫瘤血 管以及定位于在腫瘤壞死區(qū)域內(nèi)和周圍的腫瘤細(xì)胞。平均40± 10%的血管被3G4結(jié)合。染 色模式類似于本文報道的使用9D2和膜聯(lián)蛋白A5時的那些。正常組織中的血管內(nèi)皮不被 染色。在這點(diǎn)上，3G4與識別腫瘤血管標(biāo)記物的其他抗體不同。大多數(shù)腫瘤血管標(biāo)記物存在 于在卵巢（生理性血管發(fā)生的部位）中或在腎和胰島（其中血管具有高滲透性）中的血管 上（Thorpe,2004)。
[0223] 磷脂酰絲氨酸是主要被3G4檢測的陰離子磷脂。PS是最豐富的陰離子磷脂， 并且是其暴露最熟知受環(huán)境條件或損傷調(diào)節(jié)的陰離子磷脂（Zwaal和Schroit，1997 ; Balasubramanian和Schroit，2003)。在體內(nèi)，腫瘤血管上暴露的PS很可能與血清組分例如 β 2-糖蛋白I復(fù)合，并且3G4很可能結(jié)合這些復(fù)合物。如本研究自始自終所指明的，在未處 理的小鼠中的PS陽性腫瘤血管看起來是完整的并且是有功能的。它們輸送血液并且是可 灌注的。PS陽性血管的血管內(nèi)皮不顯示晚期凋亡的標(biāo)記物（活性胱天蛋白酶3，TUNEL)，是 形態(tài)學(xué)完整的，并且是代謝活躍的，如通過快速周轉(zhuǎn)蛋白（rapidly turned over protein) VCAM-1的共表達(dá)所判斷的。
[0224] 使用3G4的治療延緩了各種鼠類模型中的腫瘤生長，包括已建立的（0. 6 - 0. 7cm 直徑）同位人MDA-MB-231和MDA-MB-435乳癌，大的（1cm直徑）皮下L540人何杰金氏腫 瘤，和小的同系Meth A纖維肉瘤。3G4治療導(dǎo)致這些腫瘤的生長分別延緩75%、65%、50% 和90%。在本申請中的其他研究證實，這些腫瘤被具有暴露的陰離子磷脂的血管系統(tǒng)滋養(yǎng)。
[0225] 3G4的抗腫瘤效應(yīng)至少部分通過損害腫瘤血管系統(tǒng)介導(dǎo)。來自用3G4處理的小鼠 的同位MDA-MB-231腫瘤的組織學(xué)檢查顯示，腫瘤的血管密度和血漿含量明顯減少。3G4至 腫瘤血管的定位在巨噬細(xì)胞結(jié)合腫瘤血管、血管功能損害和壞死發(fā)生之前。血管關(guān)閉和壞 死模式與該首要效應(yīng)位于腫瘤血管上相一致。觀察到腫瘤中心性壞死，而周圍邊緣的腫瘤 細(xì)胞存活。這種模式的腫瘤細(xì)胞殺死是VTAs的特征（美國專利5, 855, 866 ;Th〇rpe，2004)。 認(rèn)為VTAs針對腫瘤內(nèi)部血管是最有效的，因為在這些區(qū)域中的高間隙壓促使血管崩潰。相 反，許多直接作用的腫瘤療法則針對在富氧的腫瘤外周中快速分裂的腫瘤細(xì)胞是最有效 的。本發(fā)明人因此期望，將3G4與抗增殖的抗腫瘤療法組合將會產(chǎn)生另外的或甚至協(xié)同的 抗腫瘤活性，如在實驗性實體瘤中用其他VTAs已觀察到的（美國專利5, 855, 866 ;Burr〇WS 和 Thorpe，1993 ;Siemann 等人，2002 ;Sum 等人，2004)。
[0226] 如同本文使用的其他抗體一樣，3G4療法在用治療劑量（在小鼠中4mg/kg，一周3 次）重復(fù)治療的帶有腫瘤的動物中是良好耐受的。小鼠保留正常的體征、凝血參數(shù)、骨髓細(xì) 胞構(gòu)成、白細(xì)胞計數(shù)和組織學(xué)。沒有觀察到APS的表現(xiàn)，這與使用抗心磷脂抗體所觀察到的 那些相反（Matzinger，1998 ;Fadok 等人，1998 ;Fadok 等人，2001a ;b)。盡管高濃度 3G4 的 效應(yīng)可部分抑制磷脂依賴性凝血途徑，但在治療劑量和延長體內(nèi)凝血時間的劑量之間存在 基本安全范圍。
[0227] 本發(fā)明人已考慮了關(guān)于在非惡性損傷（例如動脈粥樣硬化病變、炎癥部位）中PS 是否會變得暴露在血管內(nèi)皮上的問題，在所述非惡性損傷中細(xì)胞因子、低氧和R0S可能誘 導(dǎo)PS轉(zhuǎn)位（Moldovan等人，1994)。這發(fā)生了，那么這可能可以導(dǎo)致伴隨抗PS抗體的某些 毒性，從而使得排除具有來自治療的這些狀況的患者是合適的。然而，本發(fā)明人的其他研究 顯示，用嵌合形式的3G4抗體治療動脈粥樣硬化的家兔不會加重主動脈的動脈粥樣硬化病 變。
[0228] 采用藥物或凝血劑的血管靶向劑已顯示高度有效，并且有時治愈具有大實體瘤的 小鼠 （Huang 等人，1997 ;Nilsson 等人，2001 ;美國專利 5,660,827、5,776,427、5,855,866、 5, 863, 538、5, 965, 132、6, 004, 554、6, 051，230、6, 261，535、6, 093, 399、6, 004, 555、 5, 877, 289和6, 036, 955)。本發(fā)明人提供了針對磷脂酰絲氨酸的裸露抗體和血管靶向劑以 用于在人類癌癥的診斷和治療中靶向腫瘤血管系統(tǒng)。
[0229] 盡管不需要對針對磷脂酰絲氨酸的裸露抗體如何在腫瘤治療中發(fā)揮作用有準(zhǔn)確 的分子水平的了解以便實踐治療，本發(fā)明人還是考慮了可能造成所觀察到的內(nèi)皮細(xì)胞殺死 現(xiàn)象的幾種機(jī)制。最可能的機(jī)制（尤其是對于本文所述的3G4抗體來說）是Fc結(jié)構(gòu)域介 導(dǎo)的免疫效應(yīng)器功能，例如抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)和抗 體介導(dǎo)的吞噬作用。細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解和/或凋亡、抗體誘導(dǎo)的細(xì) 胞信號傳導(dǎo)和/或?qū)?xì)胞骨架的擾亂也可能涉及在內(nèi)。
[0230] 針對磷脂酰絲氨酸的完整抗體，尤其是3G4,與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的結(jié)合意味著抗 體的Fc部分突入血管的內(nèi)腔中。由于抗體Fc片段激活了補(bǔ)體途徑，所以觀察到的細(xì)胞破 壞可能是補(bǔ)體指導(dǎo)的細(xì)胞裂解的結(jié)果。因此抗體結(jié)合激活了補(bǔ)體依賴性凝血級聯(lián)反應(yīng)，弓丨 起多組分復(fù)合物進(jìn)行裝配并最終產(chǎn)生能穿透靶細(xì)胞的裂解復(fù)合物。"補(bǔ)體激活的ADCC"還 可在破壞中起作用，其中補(bǔ)體與被抗體包被的靶細(xì)胞結(jié)合，并且其中具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞， 如嗜中性粒細(xì)胞，會裂解靶細(xì)胞。
[0231] 當(dāng)裸露或未綴合的抗體，包括其抗原結(jié)合片段，與在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的磷 脂酰絲氨酸結(jié)合時，它們將在內(nèi)腔表面上形成抗體包被層。這可以起到吸引免疫效應(yīng)細(xì)胞 例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或天然殺傷（NK)細(xì)胞的這樣作用，然后免疫效應(yīng)細(xì)胞將在血管內(nèi) 皮細(xì)胞上發(fā)揮細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
[0232] 與磷脂酰絲氨酸結(jié)合的抗體還可誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。盡管尚無 關(guān)于與PS結(jié)合的抗體真正誘導(dǎo)凋亡的已知報道（而非PS是由凋亡產(chǎn)生的標(biāo)記物），本發(fā)明 人仍考慮這可能是所觀察到的抗腫瘤效應(yīng)的另一可能機(jī)制。
[0233] 還可能的是，抗體與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合可引起細(xì)胞的 細(xì)胞骨架組織紊亂。由于細(xì)胞骨架在表面膜的組織中起著重要的作用，且由于抗體結(jié)合可 能擾亂（或進(jìn)一步擾亂）膜，所以抗體與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合可能將變化傳遞至與雙分子 層相互作用的細(xì)胞骨架蛋白。已知細(xì)胞骨架蛋白的空間結(jié)構(gòu)控制膜的穩(wěn)定性和細(xì)胞形狀， 并且有可能某些細(xì)胞骨架平衡狀態(tài)的擾動可能對細(xì)胞的完整性具有深遠(yuǎn)的影響。
[0234] 本發(fā)明另一種作用機(jī)制可能是所述抗體與內(nèi)皮細(xì)胞表面上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合 可能通過目前未確定的途徑起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?？贵w結(jié)合還可能擾亂已知的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例 如通過改變膜受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、膜通道等的構(gòu)象和/或相互作用。關(guān)于細(xì)胞破壞（凋 亡）的信號可能被引發(fā)或模擬，和/或保護(hù)/內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的信號可能被抑制。
[0235] 盡管存在科學(xué)方面的意義，但實施本發(fā)明無需確定針對磷脂酰絲氨酸的裸露抗體 所造成的血管破壞的確切性質(zhì)。既然這些抗體的施用已顯示在體內(nèi)有利地產(chǎn)生了特異性抗 腫瘤效應(yīng)，那么該療法就能應(yīng)用，而不管造成此現(xiàn)象的分子機(jī)制是什么。因此，結(jié)合磷脂酰 絲氨酸的裸露抗體的應(yīng)用代表了腫瘤療法中的一個重要進(jìn)展，其在制備和成本上都具有優(yōu) 勢。
[0236] C. 3G4抗體的詳細(xì)分析
[0237] 如本文所示，3G4是有效且良好耐受的抗腫瘤劑，其通過導(dǎo)向腫瘤血管上的磷脂 酰絲氨酸并引起宿主細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)起作用。因為PS在人和小鼠中是相同分子， 并且在這兩個物種中具有相同的細(xì)胞分布、調(diào)節(jié)和通過R0S的誘導(dǎo)（Balasubramanian和 Schroit，2003 ;Whitworth等人，1990)，所以這些研究進(jìn)一步支持結(jié)合磷脂酰絲氨酸的抗 體和其他構(gòu)建體在人類中治療癌癥的用途。實際上，已制備了嵌合和人源化形式的3G4用 于這個及其他目的。
[0238] 結(jié)合磷脂酰絲氨酸的抗體及其他配體因此可以用于靶向、成像和/或治療腫瘤 血管。由于下列幾個原因，磷脂酰絲氨酸作為腫瘤靶血管是吸引人的：它是豐富的（PS以 3X10 6分子/細(xì)胞的量存在）；它在腫瘤內(nèi)皮的內(nèi)腔表面上，對于通過血液中的血管靶向劑 的結(jié)合來說其是可直接接近的；它在不同實體瘤中在較大百分比的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上存在； 并且它在所有正常組織的內(nèi)皮上基本上不存在。
[0239] 3G4抗體已顯示特異性地定位于腫瘤中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少腫瘤血管供應(yīng)和血 漿容量，并延緩腫瘤生長（本文的實施例；Ran等人，1998 ;Ran和Thorpe，2002 ;Ran等人， 2002b ;Ran 等人，2005 ;Huang 等人，2005)。
[0240] 正在進(jìn)行的研究已顯示，3G4治療抑制了鼠類腫瘤同種異體移植物和人腫瘤異種 移植物的生長（本文的實施例；Ran等人，2005)，包括同位人乳腺腫瘤（實施例XX ;Huang 等人，2005)和同位人胰腺腫瘤（實施例XX ;Beck等人，2005)。3G4還抑制這些腫瘤的轉(zhuǎn)移 擴(kuò)散和生長（實施例XX;Huang等人，2005 ;Beck等人，2005)。當(dāng)組合使用時，3G4增強(qiáng)了分 別用于治療乳腺腫瘤和胰腺腫瘤的化學(xué)治療藥物多西他賽和吉西他濱的治療效用（實施 例 XX ;Huang 等人，2005 ;Beck 等人，2005)。
[0241] 如同本文使用的其他抗體一樣，3G4療法在用治療劑量（在小鼠中4mg/kg，一周3 次）重復(fù)治療的帶有腫瘤的動物中是良好耐受的。小鼠保留正常的體征、凝血參數(shù)、骨髓細(xì) 胞構(gòu)成、白細(xì)胞計數(shù)和組織學(xué)。盡管非常高濃度的3G4的效應(yīng)可部分抑制磷脂依賴性凝血 途徑，但在治療劑量和延長體內(nèi)凝血時間的劑量之間存在基本安全范圍。3G4因此是有效 且良好耐受的抗腫瘤劑，其通過導(dǎo)向腫瘤血管上的陰離子磷脂并引起宿主細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫 瘤效應(yīng)起作用。3G4與在文獻(xiàn)中對于與抗磷脂綜合征有關(guān)的抗體所報道的致病效應(yīng)沒有關(guān) 聯(lián)。
[0242] 抗磷脂綜合征（APS)與稱為"抗心磷脂"抗體和"狼瘡抗凝劑抗體"的自身抗體有 關(guān)。這些綜合征與向著靜脈和動脈血栓栓塞、血小板減少癥和許多神經(jīng)學(xué)綜合征的傾向相 關(guān)聯(lián)。這些患者中的抗磷脂抗體因此是"致病抗體"。在人群中此類抗磷脂抗體存在于全 身性紅斑狼瘡中（Branch 等人，1987 ;Staub 等人，1989 ;Drouvalakis 和 Buchanan，1998 ; Smirnov等人，1995 ;Rauch等人，1986 ;Rauch和Janoff，1990)，并且習(xí)慣性自然流產(chǎn)相關(guān) (Rote 等人，1995 ;Rote，1996 ;Vogt 等人，1996 ; 1997 ;Katsuragawa 等人，1997)。
[0243] 盡管作為"抗磷脂抗體"和"抗PS抗體"被描述了多年，但此類致病抗體事實上 識別結(jié)合心磷脂、PS或兩者的蛋白質(zhì)輔因子，而不是磷脂本身（Galli等人，1990 ;1993 ; McNeil等人，1990 ;Rote，1996)。在致病抗體中存在相當(dāng)大的異質(zhì)性。已報道某些抗心磷 脂抗體識別β2-糖蛋白I上的特定區(qū)域，而狼瘡抗凝劑抗體識別凝血酶原。類似地，在疾 病狀態(tài)下出現(xiàn)的抗ΡΕ抗體結(jié)合與蛋白質(zhì)組合的ΡΕ，所述蛋白質(zhì)為例如低和高分子量激肽 原（ΗΚ)、前激肽釋放酶和因子 XI (Sugi 和 Mchityre，1995 ;1996a ;1996b)。
[0244] 因此，在選擇用于作為治療劑進(jìn)行施用的抗體時，認(rèn)為此類抗體應(yīng)當(dāng)基于不結(jié)合 與蛋白質(zhì)輔因子組合的磷脂酰絲氨酸來進(jìn)行鑒定，而應(yīng)當(dāng)尋找相當(dāng)"真正的"抗磷脂酰絲氨 酸抗體（W02004/006847)。
[0245] 然而，3G4抗體的進(jìn)一步體外研究顯示，與9D2不同，3G4與磷脂酰絲氨酸和陰離子 磷脂的結(jié)合在血清完全不存在下被部分抑制。此外，當(dāng)添加 β2-糖蛋白I(i32GPI)時發(fā) 現(xiàn)結(jié)合恢復(fù)。這促使本發(fā)明人相信，3G4識別脂質(zhì)-β 2GPI復(fù)合物中的表位，從而使得3G4 和PS之間的相互作用依賴于02GPI (于2005年1月24日提交的美國臨時申請序列號 60/646, 333 ;Ran等人，2005)。本發(fā)明人推斷，在體內(nèi)腫瘤血管上暴露的PS很可能與血清 組分例如β 2GPI復(fù)合，并且3G4很可能結(jié)合這些復(fù)合物。
[0246] 3G4結(jié)合PS-β 2GPI復(fù)合物的潛力是非常驚人的，不是至少因為3G4在眾多研究 中當(dāng)施用于動物時已顯示是安全的，且在文獻(xiàn)中對于與APS有關(guān)的抗體所報道的致病效應(yīng) 不相關(guān)，那種抗體已知結(jié)合磷脂-血清蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括PS-β 2GPI復(fù)合物。在任何3G4 治療中沒有觀察到APS的表現(xiàn)，這與使用針對β 2GPI的抗心磷脂抗體所觀察到的那些相反 (Matzinger，1998 ;Fadok等人，1998 ;Fadok等人，2001a ;b)。在延長的時期內(nèi)用高劑量的 3G4治療的小鼠顯示凝血能力沒有改變，然而當(dāng)小鼠注射抗心磷脂或狼瘡抗凝劑抗體時有 APS應(yīng)答。
[0247] 本發(fā)明解決了這個矛盾，闡明了對于結(jié)合具有暴露的PS的內(nèi)皮細(xì)胞所需的3G4和 β 2GPI的相互作用，并解釋了 3G4如何能夠結(jié)合PS-β 2GPI復(fù)合物，而不屈從于與以前已知 的致病抗體相關(guān)的毒性。
[0248] 如實施例XXX中所示，3G4和PS之間的相互作用依賴于β 2GPI。盡管β 2GPI在 生理條件下微弱結(jié)合陰離子磷脂，但本發(fā)明顯示，3G4極大地增強(qiáng)了 β 2GPI與PS陽性內(nèi)皮 細(xì)胞的結(jié)合。數(shù)據(jù)顯示，二價3G4/i3 2GPI復(fù)合物是增強(qiáng)結(jié)合所需的，因為3G4Fab'片段不 結(jié)合具有暴露的PS的內(nèi)皮細(xì)胞。還證實了，人工二聚P2GPI構(gòu)建體無需3G4即可結(jié)合具 有暴露的PS的內(nèi)皮細(xì)胞。總之，這些數(shù)據(jù)暗示，通過經(jīng)由形成二價3G4/i3 2GPI復(fù)合物而增 加 β 2GPI對PS的親和力，3G4靶向PS陽性細(xì)胞，包括腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞。
[0249] 實施例XXX還顯示，3G4結(jié)合i3 2GPI的結(jié)構(gòu)域II。這是重要的，因為來自APS患者 的識別0 2GPI結(jié)構(gòu)域II的抗體不是致病的。相反，一個重要的近期研究證實，從APS患者 分離的致病性抗β 2GPI抗體通常識別β 2GPI的結(jié)構(gòu)域I (de Laat等人，2005a)。3G4抗體 無需結(jié)合β 2GPI結(jié)構(gòu)域I而結(jié)合PS-β 2GPI復(fù)合物的能力對于缺乏抗體所顯示的毒性方 面是重要的。0 2GPI還可與載脂蛋白Ε受體2'（apoER2'）相互作用（Lutters等人，2003)。 另一項近期研究指出，0 2GPI的結(jié)構(gòu)域V與ap〇ER2'相互作用并且涉及血小板的激活，這 導(dǎo)致血小板至膠原的沉積增加 （van Lummel等人，2005)。
[0250] 因此，通過不結(jié)合結(jié)構(gòu)域I或結(jié)構(gòu)域V，3G4抗體可以結(jié)合PS-02GPI復(fù)合物， 并根據(jù)在各種動物模型中進(jìn)行的廣泛毒理學(xué)研究仍顯示沒有毒性。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，結(jié)合 PS-β 2GPI復(fù)合物的其他抗體現(xiàn)在已制備并在各種病狀例如癌癥和病毒感染的治療中安全 使用。選擇不顯著結(jié)合0 2GPI結(jié)構(gòu)域I的抗體目前是主要需求，并且設(shè)想選擇不顯著結(jié)合 β 2GPI結(jié)構(gòu)域I或β 2GPI結(jié)構(gòu)域V的抗體以提供另外的優(yōu)點(diǎn)。
[0251] 在回顧中，新研究已表征了 3G4抗體及其主要陰離子磷脂靶（磷脂酰絲氨酸）之 間的相互作用。數(shù)據(jù)證實3G4和PS之間的相互作用是血清依賴性的。β 2GPI被鑒別為介 導(dǎo)3G4-PS相互作用所需的血清因子。
[0252] 3G4最初通過用鼠類內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠而產(chǎn)生，所述鼠類內(nèi)皮細(xì)胞用Η20 2處理以 誘導(dǎo)PS暴露（Example IV ;Ran等人，2005)。細(xì)胞生長在含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中并可能注射少量 牛β 2GPI，導(dǎo)致產(chǎn)生抗PS/ β 2GPI抗體。在牛血清存在下就與PS的反應(yīng)性篩選初始抗體。 稍后的篩選在血清不存在下進(jìn)行，但如本文所指出的，從SCM純化的抗體與β 2GPI抗原一 起共純化。因此，由于存在污染性的牛0 2GPI，"純化的"抗體在血清不存在下可以結(jié)合PS。 只有當(dāng)3G4在不含血清的培養(yǎng)基中生長并從中純化時，才能鑒定出血清依賴性。其他團(tuán)體 已報道了關(guān)于獲得不含β 2GPI的抗β 2GPI抗體制劑的類似關(guān)注（Roubey等人，1995)。因 此，很可能被報道直接結(jié)合磷脂的許多所謂的"抗磷脂抗體"實際上識別對磷脂具有親和力 的血清蛋白質(zhì)。
[0253] P2GPI是50-kDa的糖蛋白，其以?200yg/mL(4yM)的濃度存在于血漿中 (Cleve等人，1969)。該蛋白質(zhì)是補(bǔ)體調(diào)控蛋白（CCP)家族的成員（Steinkasserer等人， 1991)。β 2GPI具有5個CCP重復(fù)，其中第1個一第4個結(jié)構(gòu)域是由?60個氨基酸組成的有 規(guī)律的重復(fù)。第5個結(jié)構(gòu)域不同于其他4個結(jié)構(gòu)域，因為它具有82個氨基酸，包括一串帶正 電荷的氨基酸（282 - 287)和負(fù)責(zé)β 2GPI與陰離子磷脂結(jié)合的保守性疏水區(qū)（311 - 317) (Steinkasserer 等人，1992 ;Hunt 和 Krilis，1994 ;Sheng 等人，1996 ;Mehdi 等人，2000 ;各 自引入本文作為參考）。
[0254] 關(guān)于β 2GPI的正常生物學(xué)功能知之甚少。提出的功能包括促進(jìn)凋亡細(xì)胞清除 (Balasubramanian 等人，1997b ;Balasubramanian 等人，2005)、血小板功能的調(diào)節(jié)（Nimpf 等人，1985 ;Nimpf 等人，1987)和凝血的抑制（Nimpf 等人，1986 ;Schousboe，1985);然而， 在缺乏β 2GPI的小鼠或患者中沒有觀察到確定的表型（Miyakis等人，2004 ;Yasuda等 人，2000)。
[0255] 相反，眾所周知P2GPI涉及自身免疫性病癥APS，在其中它已被鑒定為對于所 謂的抗磷脂（aPL)抗體與陰離子磷脂表面結(jié)合所需的血漿輔因子（de Laat等人，2004a; Bevers等人，2004)。抗磷脂抗體已知與各種血清蛋白質(zhì)相互作用，但識別β 2GPI的aPL抗 體與APS的臨床癥狀的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)（de Laat等人，2004b)。因此，已廣泛研究了 β 2GPI、抗 β 2GPI抗體和陰離子磷脂膜表面之間的相互作用（Bevers等人，2004)。
[0256] 本研究還檢查了 3G4結(jié)合經(jīng)PS包被的微量滴定板和具有暴露的PS的內(nèi)皮細(xì)胞的 特征。使用活細(xì)胞結(jié)合測定法，確定3G4和0 2GPI都不結(jié)合具有暴露的PS的內(nèi)皮細(xì)胞， 除非兩種分子同時存在（實施例XXX)。這個觀察結(jié)果與基于ELISA的發(fā)現(xiàn)一致，所述發(fā) 現(xiàn)證實3G4在結(jié)合至陰離子磷脂表面方面依賴于i3 2GPI。此外，這個觀察結(jié)果支持了關(guān)于 β 2GPI在生理條件下對陰離子磷脂膜具有低親和力的報道（Willems等人，1996 ;Bevers等 人，2004 fevers等人，2005)，并暗示了 3G4的存在極大地增強(qiáng)了親和力。
[0257] 數(shù)據(jù)還證實，3G4經(jīng)由形成二價β 2GPI復(fù)合物增強(qiáng)了 β 2GPI對陰離子磷脂表面的 親和力。當(dāng)β 2GPI濃度保持不變并且3G4濃度增加時，3G4/β 2GPI與具有暴露的PS的內(nèi) 皮細(xì)胞的結(jié)合在3G4與0 2GPI的比率為2:1時到達(dá)峰值。在3G4濃度更高時，結(jié)合增加。 鐘形曲線暗示單價和二價復(fù)合物之間有競爭，導(dǎo)致總體3G4/0 2GPI復(fù)合物結(jié)合減少。對于 血栓形成模型中的抗β 2GPI抗體已報道了鐘形曲線關(guān)系（Jankowski等人，2003)。在其他 研究中，3G4Fab片段在β 2GPI存在下不結(jié)合具有暴露的PS的內(nèi)皮細(xì)胞，這證實單價3G4/ β 2GPI復(fù)合物不能結(jié)合陰離子磷脂表面。
[0258] 還證實了人工二聚β 2GPI構(gòu)建體無需3G4就可結(jié)合具有暴露的PS的內(nèi)皮細(xì)胞。 因此，抗β 2GPI抗體通過交聯(lián)兩個β 2GPI分子，形成二價β 2GPI復(fù)合物，而增加了 β 2GPI 對陰離子磷脂表面的親和力。
[0259] 重要地，盡管3G4/ β 2GPI復(fù)合物與PS的相互作用很類似來自APS患者的aPL抗 體，但3G4在測試的任何動物模型中都不引起APS的臨床表現(xiàn)。aPL引起APS的機(jī)制大部分 仍是未知的。某些研究提出，aPL/i3 2GPI可以結(jié)合并激活靜止的內(nèi)皮細(xì)胞（其不暴露PS)， 導(dǎo)致它們采取更具有血栓形成性的表型（Simantov等人，1995 ;Pierangeli等人，1999)。 更近期的研究證實，β 2GPI和aPL/β 2GPI復(fù)合物不能結(jié)合和完全激活內(nèi)皮細(xì)胞除非它們 已"預(yù)激活"（Chen等人，2004)。預(yù)激活導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞暴露PS，從而提供了用于結(jié)合aPL/ β 2GPI復(fù)合物的合適的陰離子磷脂表面。
[0260] 在活細(xì)胞測定法中3G4不結(jié)合靜止的ΑΒΑΕ細(xì)胞或HUVEC。此外，3G4不激活靜止 的HUVEC或用低濃度LPS預(yù)激活的HUVEC。近期研究報道了識別患者血清中的β 2GPI結(jié)構(gòu) 域I的aPL抗體存在與APS臨床癥狀之間的高度相關(guān)性（de Laat等人，2005)，并且構(gòu)象變 化可能是抗體結(jié)合所需的（de Laat等人，2005b)。還在患者血清中檢測到識別0 2GPI的 其他結(jié)構(gòu)域的抗體，但其與發(fā)病機(jī)理無關(guān)。重要地，本發(fā)明證實了 3G4識別0 2GPI的結(jié)構(gòu) 域II，這可能解釋了體外內(nèi)皮細(xì)胞激活的缺乏以及體內(nèi)毒性的缺乏。
[0261] 小鼠 P2GPI的結(jié)構(gòu)域II在60個氨基酸中只有7個不同于大鼠、狗、牛、黑猩猩和 人β 2GPI的結(jié)構(gòu)域II。因此，3G4不能在小鼠血清存在下結(jié)合PS或不能通過免疫印跡檢 測鼠類0 2GPI是出人意料的，尤其是考慮到已證明的3G4在小鼠中的抗腫瘤活性（本文的 實施例；Ran等人，2005 ;Huang等人，2005 ;Beck等人，2005)。重要地，使用由SCM純化的 3G4進(jìn)行這些研究。如本文所示，由于牛0 2GPI的共純化，3G4SCM能夠結(jié)合PS。當(dāng)3G4SCM 在SDS-PAGE凝膠上電泳、轉(zhuǎn)移至膜支持物并就牛β 2GPI的存在進(jìn)行探測時，50kDa的條帶 是清晰可見的。此外，在注射3G4SCM后從小鼠收集的血清中存在的3G4結(jié)合PS。因此，牛 β 2GPI能夠介導(dǎo)3G4與PS在小鼠血漿中的結(jié)合并可能促進(jìn)3G4的抗腫瘤效應(yīng)。使用3G4 在小鼠中進(jìn)行的所有腫瘤研究應(yīng)當(dāng)補(bǔ)充?；蛉? 2GPI以確保靶向具有暴露的PS的腫瘤內(nèi) 皮細(xì)胞。
[0262] 將β 2GPI鑒定為3G4和PS之間相互作用所需的重要輔因子極大地增強(qiáng)了這種獨(dú) 特的腫瘤血管靶向劑的了解。通過經(jīng)由形成二聚0 2GPI復(fù)合物而增強(qiáng)0 2GPI對陰離子磷 脂表面的親和力，3G4靶向具有暴露的PS的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞。除了闡明這些特性外，本研究現(xiàn) 在允許開發(fā)第三代抗體，其結(jié)合在具有血清蛋白質(zhì)的復(fù)合物中的氨基磷脂和陰離子磷脂， 而不復(fù)制致病抗體的特性。
[0263] 總之，現(xiàn)在可以選擇在除β 2GPI結(jié)構(gòu)域I內(nèi)以外的位置處，或者在除β 2GPI結(jié) 構(gòu)域I或結(jié)構(gòu)域V內(nèi)以外的位置處結(jié)合PS和β 2GPI的優(yōu)選的"第三代"或"非致病性 PS-β 2GPI抗體"。根據(jù)本文的數(shù)據(jù)，目前最優(yōu)選的抗體是在結(jié)構(gòu)域II內(nèi)結(jié)合β 2GPI的那 些。根據(jù)本文描述的方法和篩選技術(shù)，例如使用圖18Α和圖18Β中的序列信息和實施例XXX 中的結(jié)合測定法可以制備一系列非致病性PS-β 2GPI抗體。此類抗體及其免疫綴合物可以 有利地用于病毒感染的安全且有效的治療以及用于癌癥和其他疾病治療中。
[0264] D.受體-抗體和β-抗體
[0265] 3G4抗體的前述詳細(xì)分析以及特別是3G4與β 2GPI的相互作用（其與 W02004/006847中所闡述的形成對比）還促使本發(fā)明人開發(fā)出本發(fā)明的受體-抗體。重要 地，這個發(fā)明還提供了稱為"受體-抗體"的一系列構(gòu)建體，其結(jié)合磷脂酰絲氨酸并喚起宿 主效應(yīng)器功能。受體-抗體開發(fā)的方面在下文描述。
[0266] 本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示，用針對磷脂酰絲氨酸的抗體靶向腫瘤血管系統(tǒng)在腫瘤治療 中是有效的。針對磷脂酰絲氨酸的抗體也顯示出在治療病毒感染中是有效的?？紤]腫瘤研 究作為例子，本文顯示腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)激條件誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮上的磷脂酰絲氨酸暴露 (實施例VII、實施例II、實施例V和實施例VI)。暴露的磷脂酰絲氨酸提供了用于成像和 治療的腫瘤血管系統(tǒng)的選擇性標(biāo)記（實施例IX、實施例X、實施例XI和實施例XX)。
[0267] 與腫瘤治療相關(guān)聯(lián)，針對磷脂酰絲氨酸的抗體損害腫瘤內(nèi)的血管并引起白細(xì)胞浸 潤（例如，圖1)。此外，此類抗體的施用將巨噬細(xì)胞募集到腫瘤內(nèi)。例如，在使用3G4抗體 的腫瘤治療研究中，可見血液單核細(xì)胞與腫瘤血管內(nèi)皮的廣泛結(jié)合以及巨噬細(xì)胞大量浸潤 到腫瘤間質(zhì)中（例如實施例XXVII ;圖6Α、圖6Β、圖6C和圖6D)。
[0268] 巨噬細(xì)胞浸潤到接受治療的腫瘤中，以及3G4以Fc依賴性方式使骨髓衍生小鼠巨 噬細(xì)胞在體外對表達(dá)PS的細(xì)胞的吞噬速率增加5倍這一發(fā)現(xiàn)，是與抗體例如3G4激起巨噬 細(xì)胞對于腫瘤血管或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性相一致的。此外，3G4不直接抑制表達(dá)PS的內(nèi)皮 細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞增殖，或在體外介導(dǎo)細(xì)胞的補(bǔ)體裂解，這暗示該抗體不是直接細(xì)胞毒性的。
[0269] 因此，本發(fā)明人提出了巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的對于腫瘤血管或腫瘤細(xì)胞的損害的兩種可 行機(jī)制。首先，抗體例如3G4結(jié)合腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞上的陰離子磷脂（主要是磷脂酰絲氨 酸）和血清蛋白質(zhì)的復(fù)合物。隨后，抗體經(jīng)由Fcy受體刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的結(jié)合， 從而增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)和抗體依賴性巨噬細(xì)胞吞噬作用。激活的巨噬細(xì)胞 已長久地被認(rèn)為具有直接的殺腫瘤活性（Whitworth等人，1990)。在對于這一點(diǎn)的支持方 面，Manfredi等人（1998)已報道，抗磷脂抗體可以促進(jìn)具有TNF-α分泌的大量誘導(dǎo)的清 道夫巨噬細(xì)胞對于表達(dá)PS的細(xì)胞的調(diào)理作用。盡管巨噬細(xì)胞具有PS受體并且可以結(jié)合和 吞食表達(dá) PS 的細(xì)胞（Balasubramanian 和 Schroit，2003 ;Utsugi 等人，1991 ;Fadok 等人， 2001a)，但單獨(dú)的PS暴露不足以刺激吞食（Devitt等人，2003)。
[0270] 其次，抗體例如3G4可以阻斷來自表達(dá)PS的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的由PS介導(dǎo)的"靜止 期"信號，這通常將會抑制由結(jié)合腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞的巨噬細(xì)胞所作出的炎癥應(yīng)答（圖 7)。認(rèn)為類似機(jī)制可以解釋巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞對凋亡細(xì)胞缺乏炎癥應(yīng)答（Henson等人， 2001 ;Matzinger，1998 ;Gallucci 和 Matzinger，2001 ;Fadok 等人，2001b)。因此，抗體例如 3G4可以通過激起巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1及其他炎性細(xì)胞因子來引起腫瘤血管損害， 所述細(xì)胞因子直接損害腫瘤內(nèi)皮（圖7)并將更多的宿主細(xì)胞募集到腫瘤中（Fadok等人， 1998)。
[0271] 理想地，上述可能機(jī)制中的每一個應(yīng)當(dāng)符合于腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤 血管發(fā)生這一建議，所述腫瘤血管發(fā)生促進(jìn)腫瘤生長（例如Sunderkotter等人，1994)。 因此，本發(fā)明人推斷，在巨噬細(xì)胞的促血管生成效應(yīng)和其對腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞的直接 細(xì)胞毒性效應(yīng)之間存在平衡，這通過腫瘤微環(huán)境中的局部條件（例如低氧，TGF-β)確定 (Breier等人，2002)。目前設(shè)想，抗體例如3G4以有利于來自巨噬細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性應(yīng)答 的方式改變腫瘤微環(huán)境。
[0272] 考慮到磷脂酰絲氨酸的生物學(xué)，和任選地根據(jù)本文呈現(xiàn)的關(guān)于巨噬細(xì)胞在腫瘤治 療中的行為的數(shù)據(jù)，本發(fā)明人從而提供了一系列有利的結(jié)合磷脂酰絲氨酸并任選結(jié)合其他 陰離子磷脂的構(gòu)建體或"受體-抗體"，和相關(guān)綴合物以及使用方法。
[0273] 本發(fā)明的此類構(gòu)建體或受體-抗體一般將包括識別并結(jié)合磷脂酰絲氨酸并且任 選結(jié)合其他陰離子磷脂的結(jié)合蛋白或多肽、受體、配體或肽，所述結(jié)合蛋白或多肽、受體、配 體或肽連接至抗體或免疫球蛋白Fc區(qū)或結(jié)構(gòu)域。Fc區(qū)修飾所述結(jié)合蛋白或多肽、受體、配 體或肽以增加其生物學(xué)半衰期，但更重要的是，提供具有刺激宿主效應(yīng)器功能的所得構(gòu)建 體以增強(qiáng)疾病治療。
[0274] 本發(fā)明的受體-抗體可以在任何這樣的實施方案中使用，在所述實施方案中可以 使用針對磷脂酰絲氨酸的抗體。此類受體-抗體因此具有多重應(yīng)用，包括結(jié)合腫瘤血管和 腫瘤細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸，導(dǎo)致對腫瘤的由宿主細(xì)胞介導(dǎo)的抗血管和抗細(xì)胞效應(yīng)，和結(jié) 合在病毒或受病毒感染的細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸，導(dǎo)致動物中的抗病毒效應(yīng)。
[0275] 本發(fā)明的這些方面的一個優(yōu)點(diǎn)是，所述受體-抗體使用天然的磷脂酰絲氨酸結(jié)合 蛋白、多肽或受體以達(dá)到特異性結(jié)合。盡管在本文中顯示出使用針對磷脂酰絲氨酸的抗體 在許多治療實施方案中是有效的，但受體-抗體可以具有比抗PS抗體更高的親合力或特異 性。通過在Fc免疫球蛋白區(qū)域上二聚化磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白或多肽（特別是i3 2GPI)， 構(gòu)建體達(dá)到更佳的親合力、穩(wěn)定性、更長的體內(nèi)半衰期，并且可能更好地定位于表達(dá)磷脂酰 絲氨酸的組織，以及刺激體內(nèi)宿主效應(yīng)器功能?？筆S抗體在本文中顯示出在施用給動物 (包括猴子）時是有效且安全的。同樣地，包含天然配體的受體-抗體將是有效且安全的， 并且不會引起抗磷脂綜合征。因此，本發(fā)明的受體-抗體是簡單的、人的、特異的和安全的 治療劑，其可以用于治療一系列腫瘤和病毒感染。
[0276] D1.磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白
[0277] 受體-抗體中的結(jié)合蛋白或多肽、受體、配體或肽可以是幾種磷脂酰絲氨酸結(jié)合 蛋白中的任何一種，包括細(xì)胞來源的受體、因子V、凝血酶原（因子II)等等。使用β 2-糖 蛋白I是更優(yōu)選的。
[0278] 凝血級聯(lián)反應(yīng)中的某些因子也結(jié)合磷脂酰絲氨酸并且因此可以用于本發(fā)明的受 體-抗體中。例如，因子V和凝血酶原（因子II)結(jié)合磷脂酰絲氨酸。在凝血酶原酶復(fù)合 物中，因子Va與陰離子脂質(zhì)表面的結(jié)合促進(jìn)因子Xa的Ca 2+依賴性結(jié)合，所述因子Xa將凝 血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶。在兩種復(fù)合物中，磷脂酰絲氨酸是最有效的陰離子磷脂。因此可以 使用蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、因子ΙΙ/IIa、因子V/Va、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa 這些磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白。
[0279] Fadok等人（2000,特別引入本文作為參考）報道了直接結(jié)合凋亡細(xì)胞的PS受體 的克隆。這種受體表達(dá)于許多細(xì)胞類型中，包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。使用抗 體和PS小泡的研究指明，該受體的確識別細(xì)胞表面上的磷脂酰絲氨酸。因此，這是PS特異 性受體、"PS受體"或"PSr"（登錄號AF304118)。這種受體存在于吞噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞 上，以及還存在于其他細(xì)胞類型上。Fadok等人（2000,特別引入本文作為參考）的PS受體 因此可以用于本發(fā)明的受體-抗體中。
[0280] 可以用于本發(fā)明的受體-抗體中的其他磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白描述 在Balasubramanian和Schroit，2003 (特別引入本文作為參考）中，特別地，參見 Balasubramanian和Schroit，2003,表2,以及描述在本文引用的參考文獻(xiàn)中，其全部特別 引入本文作為參考。這些磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白包括，例如，CD14 ;整合素，例如α 5β 3(玻 連蛋白，CD51/CD61)和 α 5β 3/CD36 ;幾種清道夫受體，例如 SRB(CD36)、SRC(L0X-1、SRCL)、 SRD(CD68、巨噬涎蛋白）和PSOX ;補(bǔ)體受體，例如CR3(CDllb/CD18)(登錄號NM000632)、 CR4(CDllc/CD18)(登錄號 NM000887)和 CD93(cClqr，鈣網(wǎng)蛋白）/CD91(a 2-巨球蛋白受 體）；及其他受體，例如對于表達(dá)PS的凋亡細(xì)胞的Mer/Gas6吞噬細(xì)胞識別配偶體（登錄號 AH010001)。
[0281] 盡管膜聯(lián)蛋白例如膜聯(lián)蛋白V可以用作受體-抗體中的磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白， 但其用途不是本發(fā)明的通用部分。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了其中磷脂酰絲氨 酸結(jié)合蛋白不是膜聯(lián)蛋白的構(gòu)建體。但是，提供下列信息用于其中考慮了膜聯(lián)蛋白的那些 實施方案中。此外，在特別引入本文作為參考的膜聯(lián)蛋白專利文件中的技術(shù)信息，例如關(guān)于 表達(dá)和綴合的信息，可以用于支持本發(fā)明的其他Fc-磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白構(gòu)建體。
[0282] 在哺乳動物組織中已鑒定出膜聯(lián)蛋白家族的至少9個成員（膜聯(lián)蛋白I至膜聯(lián)蛋 白IX)。在這些之中目前優(yōu)選的是膜聯(lián)蛋白V(也稱為PAP-I)。關(guān)于膜聯(lián)蛋白的蛋白質(zhì)和 DNA序列是本領(lǐng)域已知的，這促進(jìn)了容易地生產(chǎn)在本發(fā)明這些方面中使用的重組融合蛋白。
[0283] 引入本文作為參考的美國專利5, 658, 877描述了膜聯(lián)蛋白I、膜聯(lián)蛋白I的有效量 及其藥物組合物。還描述了治療動物以預(yù)防或減輕內(nèi)毒素在肺中的不利作用的方法，其包 括將安全量的33kDa膜聯(lián)蛋白I片段施用到動物的氣道中。
[0284] 膜聯(lián)蛋白V包含一個游離巰基并且不具有任何附著的糖鏈。由cDNA序列推導(dǎo)出 的膜聯(lián)蛋白V -級結(jié)構(gòu)顯示，膜聯(lián)蛋白V包括4個內(nèi)部重復(fù)單元（美國專利4, 937, 324 ;引 入本文作為參考）。美國專利5, 296, 467和W091/07187也各自引入本文作為參考，因為它 們提供了包含膜聯(lián)蛋白的藥物組合物。
[0285] W091/07187提供了膜聯(lián)蛋白的天然、合成或遺傳制備的衍生物和類似物。提供了 具有320個氨基酸的特定膜聯(lián)蛋白，其包含不同氨基酸以及任選地在316-Cys和2-Ala之 間包含二硫橋。
[0286] 美國專利5, 296, 467整體引入本文作為參考，包括所有附圖和序列，用于更進(jìn)一 步描述膜聯(lián)蛋白及其藥物組合物的目的。美國專利5, 296, 467描述了膜聯(lián)蛋白克隆、重組 表達(dá)和制備。還公開了兩個或更多個膜聯(lián)蛋白的聚集物，所述膜聯(lián)蛋白例如通過在各自膜 聯(lián)蛋白上的一個或多個半胱氨酸基團(tuán)之間的二硫鍵而連接起來。適合的膜聯(lián)蛋白起始材料 的另一例子由W095/27903(引入本文作為參考）提供，其提供了用于檢測凋亡細(xì)胞的膜聯(lián) 蛋白。
[0287] 美國專利6, 197, 278特別引入本文作為參考，用于下列目的：進(jìn)一步使得能夠獲 得和提供書面描述以支持一般意義上的膜聯(lián)蛋白、其安全且有效的體內(nèi)施用和成像實施方 案。至它們清楚地描述用于制備本發(fā)明構(gòu)建體的合適膜聯(lián)蛋白起始材料的程度，美國專利 5, 627, 036 ;W095/19791 ;W095/27903 ;W095/34315 ;W096/17618 ;和 W098/04294 的診斷方 法中的每一種也特別引入本文作為參考。這些不同文件還涉及有用的重組表達(dá)載體。
[0288] 還提供了美國專利5, 632, 986,用于進(jìn)一步描述從組織提取物中分離的膜聯(lián)蛋白 (美國專利號4, 937, 324 ;同樣引入本文作為參考）和通過重組方法生產(chǎn)的膜聯(lián)蛋白的目 的。美國專利號5, 632, 986的cDNA克隆和表達(dá)載體因此各自引入本文作為參考。
[0289] 美國專利5, 632, 986也特別引入本文作為參考，用于進(jìn)一步描述膜聯(lián)蛋白分子的 突變體和變體的目的，所述突變體和變體在一個或多個氨基酸殘基上再分或改變，只要磷 脂結(jié)合能力基本上不降低。用于使用的合適膜聯(lián)蛋白因此可以是截短的，例如，以包括一個 或多個結(jié)構(gòu)域或者包含比天然蛋白質(zhì)更少的氨基酸殘基，或者可以包含置換的氨基酸。任 何改變都是可接受的，只要突變蛋白或第二代膜聯(lián)蛋白分子不包含對于氨基磷脂基本上減 少的親和力。相同推論應(yīng)用于除膜聯(lián)蛋白外的其他蛋白質(zhì)。
[0290] 膜聯(lián)蛋白和其他試劑的化學(xué)交聯(lián)也描述在引入本文作為參考的美國專利 5, 632, 986中。簡單地通過用血栓溶解劑置換本文描述的Fc區(qū)，可以調(diào)整所有此類技術(shù)以 適合其用途。因此可以使用脂肪族二胺；琥珀酰亞胺酯；雜雙官能偶聯(lián)劑，例如SPDP ;馬來 酰亞胺化合物；含間隔物的接頭，等等。這些試劑還可與除膜聯(lián)蛋白外的其他蛋白質(zhì)一起使 用。
[0291] 更進(jìn)一步地，美國專利5, 632, 986被特別引入本文作為參考，用于描述包含膜聯(lián) 蛋白的綴合物的重組生產(chǎn)的目的。因此，將合適的核酸序列連接以產(chǎn)生嵌合編碼序列，其從 而產(chǎn)生嵌合蛋白。示例性的表達(dá)載體是pKK233-2(大腸桿菌（E. coli))、DP0T (酵母）和 pDSPl. 1BGH(哺乳動物）。此類教導(dǎo)通過本文提供的進(jìn)一步信息得到補(bǔ)充。
[0292] 美國專利6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213各自特別引入本文作為參考，以用 于下列目的：進(jìn)一步使得能夠獲得和提供書面描述以支持一般意義上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合 蛋白及其安全且有效的體內(nèi)施用。這些專利公開了結(jié)合性配體組合物，其中治療劑可操作 地附著至靶向劑，所述靶向劑結(jié)合磷脂酰絲氨酸，優(yōu)選暴露在血管化腫瘤的血管內(nèi)腔表面 上的磷脂酰絲氨酸，以及使用此類結(jié)合性配體及其組合的癌癥治療方法。盡管這些專利沒 有教導(dǎo)或提出連接至Fc區(qū)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白，但將其涉及磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白、 所附著的治療劑以及安全且有效的體內(nèi)治療方法的公開內(nèi)容特別引入本文作為參考。
[0293] 美國專利6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213特別涉及結(jié)合性配體，其中治療劑 可操作地附著至至少第一種磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白。盡管這些專利中的蛋白質(zhì)連接至治療 劑并用于遞送不含F(xiàn)c區(qū)的治療劑至腫瘤血管系統(tǒng)，因而不誘發(fā)宿主細(xì)胞效應(yīng)器功能，這些 專利特別引入本文作為參考，用于進(jìn)一步使得能夠獲得和描述蛋白質(zhì)綴合物及其安全且有 效的體內(nèi)施用（包括治療癌癥）的目的。使用這些專利中的信息以及本公開內(nèi)容中的教導(dǎo)， 從而可以制備一系列受體-抗體，其中磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白或其磷脂酰絲氨酸結(jié)合性片 段，現(xiàn)在被連接至Fc區(qū)或結(jié)構(gòu)域。
[0294] β 2-糖蛋白Ι(β 2GP1)目前是在本發(fā)明的受體-抗體中使用的優(yōu)選磷脂酰絲氨酸 結(jié)合蛋白質(zhì)。β 2GP1，也稱為載脂蛋白Η，是50kDa血漿糖蛋白，其通過其C末端結(jié)合帶負(fù) 電荷的磷脂（Wurm，1984,特別引入本文作為參考）。提供下列登錄號：人B2GPI(NP000033， AAP72014 和 1C1ZA)和小鼠 B2GPI(AAH53338, NP038503, CAA69401， BAB2721)。體外 和體內(nèi)證據(jù)表明，02GPI在表達(dá)PS的凋亡細(xì)胞的清除中起作用（Chonn等人，1995; Balasubramanian 等人，1997 ;Balasubramanian 和 Schroit，1998)。β 2GPI 與吞噬細(xì)胞的 相互作用在性質(zhì)上是靜電的，并且蛋白質(zhì)糖基化對于吞噬細(xì)胞識別來說不是關(guān)鍵的。因此， 對于在受體-抗體中使用的0 2GPI的重組生產(chǎn)沒有明顯障礙。
[0295] 當(dāng)使用本發(fā)明中的β 2GPI蛋白質(zhì)、多肽或肽時，所得到的Fc-β 2GPI構(gòu)建體稱為 " β -抗體"。如本文圖18Α和圖18Β中所示，β -抗體將優(yōu)選包括來自β 2GPI結(jié)構(gòu)域V的 脂質(zhì)結(jié)合區(qū)。包含整個結(jié)構(gòu)域V的構(gòu)建體可能是優(yōu)選的以確保脂質(zhì)結(jié)合。結(jié)構(gòu)域V可以單 獨(dú)使用，或與其他4個結(jié)構(gòu)域中的一個或多個一起使用。盡管使用全長0 2GPI蛋白質(zhì)是方 便的，但不包含0 2GPI結(jié)構(gòu)域I的β-抗體在某些方面可以是優(yōu)選的，因為來自APS患者 的抗體通常識別β 2GPI的結(jié)構(gòu)域I (de Laat等人，2005a)。
[0296] 其他優(yōu)選的β -抗體是其中兩個β 2GPI多肽在Fc區(qū)上二聚化的那些。此類β -抗 體在本文顯示出在結(jié)合在平板上和暴露在細(xì)胞表面上的磷脂酰絲氨酸中是有效的。然而， 提供了制備二聚化和多聚化的β_抗體的其他方法，例如納米顆粒、脂質(zhì)體及其他分子支 架。
[0297] D2. Fc 區(qū)
[0298] Fc區(qū)將被附著、連接或綴合至磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白或多肽、受體、配體或肽，從 而使得所得到的受體-抗體的所需活性基本上不會由于附著Fc區(qū)而被破壞?？梢圆捎帽?領(lǐng)域已知的任何綴合或接頭技術(shù)，例如在本文相關(guān)部分描述的那些。需要時，可以使用分子 生物學(xué)技術(shù)來制備融合蛋白，其現(xiàn)在對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)，如本文再次示 例的。因此，可以將受體-抗體制備為化學(xué)綴合物或融合蛋白。
[0299] 在免疫球蛋白的重鏈內(nèi)，氨基末端結(jié)構(gòu)域是可變結(jié)構(gòu)域（VH)。重鏈和輕鏈的可變 結(jié)構(gòu)域在抗原結(jié)合中共同發(fā)揮作用。在重鏈中，可變結(jié)構(gòu)域之后為下列3個恒定結(jié)構(gòu)域： CH1、CH2和羧基末端的CH3。在某些抗體中，存在第4個恒定結(jié)構(gòu)域C H4。短的伸展部分，轉(zhuǎn) 換體（switch)，連接重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。鉸鏈連接CH2和C H3 (Fc片段）與抗體的其余部 分（Fab片段）。
[0300] 恒定區(qū)的性質(zhì)決定了除抗原結(jié)合以外的各種作用機(jī)制。基于其恒定區(qū)結(jié)構(gòu)和免疫 功能，抗體分為5個主要類別：IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。相應(yīng)于不同免疫球蛋白類別的重 鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為μ、Y、α、δ和ε。
[0301] 考慮到Fc區(qū)提供的效應(yīng)器功能（Bruggemann等人，1987 ;Riechmann等人，1988 ; Clark，1997 ;Padlan，1994 ;各自特別引入本文作為參考），目前優(yōu)選的Fc區(qū)是用于臨床使 用的人IgGl ( γ 1)和人IgG3 ( γ 3)，以及用于在小鼠中的臨床前測試的小鼠 IgG2a U 2a)和 小鼠 IgG2b(Y2b)。認(rèn)為γ2是沉默的，因此將不選擇來提供效應(yīng)器功能，盡管它仍是用作 二聚化結(jié)構(gòu)域的有用的人蛋白質(zhì)。盡管是根據(jù)效應(yīng)器功能而被選擇出的，但免疫球蛋白的 Fc片還有助于延長的半衰期，這可以由抗體在腎內(nèi)的主動再吸附而產(chǎn)生。
[0302] 盡管Fc區(qū)和結(jié)合構(gòu)建體的重組表達(dá)是方便的，但此類片段還可以通過完整的免 疫球蛋白的蛋白水解而獲得，優(yōu)選通過木瓜蛋白酶這種非特異性巰基蛋白酶。木瓜蛋白酶 消化產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab片段"，它們各自具有單個抗原結(jié)合部位，以 及剩余的"Fc片段"。
[0303] 木瓜蛋白酶首先應(yīng)通過還原在含有半胱氨酸、2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇的活性位 點(diǎn)中的巰基來激活。貯存的酶中的重金屬應(yīng)當(dāng)通過用EDTA(2mM)螯合來去除以確保最大酶 活性。酶和底物通常以1:100的重量比混合在一起。孵育后，反應(yīng)可以通過用碘乙酰胺不 可逆地烷基化巰基或簡單地通過透析來中止。消化的完全性應(yīng)當(dāng)通過SDS-PAGE進(jìn)行監(jiān)控， 并且各個級分通過A蛋白-Sepharose或離子交換層析進(jìn)行分離。
[0304] 在某些實施方案中，可以使用兩個Fc片段，優(yōu)選兩個人Fc片段。在這樣的方面，兩 個結(jié)合蛋白、受體或配體可以與兩個Fc片段相組合以制備另一種類型的二價受體-抗體。 對于制備用于人施用的受體-抗體來說，人Fc片段將是優(yōu)選的。事實上，這是本發(fā)明的優(yōu) 點(diǎn)，因為產(chǎn)生完全人的治療性構(gòu)建體。因此，F(xiàn)c-β 2GPI構(gòu)建體包括完全人的β -抗體治療 劑。
[0305] D3.其他構(gòu)建體和載體
[0306] 盡管連接Fc區(qū)至磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白或多肽是所述受體-抗體發(fā)明的優(yōu)選實 施方案，但磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白還可連接至惰性載體以將長壽命賦予生物活性分子。像 這樣，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含可操作地附著至至少第一種惰性載體的至少第一種氨基磷 脂結(jié)合蛋白（包括0 2GPI)的構(gòu)建體。
[0307] 如本領(lǐng)域已知的，載體蛋白質(zhì)可以用于增加生物學(xué)半衰期，并且示例性蛋白質(zhì)是 白蛋白和球蛋白，例如中性抗生物素蛋白（neutravidin)和鏈霉抗生物素蛋白。非蛋白質(zhì) 載體也可用于增加生物學(xué)半衰期，例如天然或合成的聚合物，包括多糖和PEG。任何這樣的 惰性載體可以附著至本文描述的任何磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白。
[0308] 本發(fā)明的其他方面涉及通過除使用Fc區(qū)以外的方法制備的β 2GPI二聚體組合 物，以及涉及各種使用方法。本發(fā)明特別提供了治療癌癥的方法和治療病毒感染的方法，包 括向有此需要的動物施用治療有效量的0 2GPI二聚體。
[0309] 本發(fā)明的再進(jìn)一步方面是脂質(zhì)體，其包含β 2GPI多肽（無論是否為二聚體形式）， 和包含除附著至Fc區(qū)的那些以外的其他0 2GPI多肽。像這樣，本發(fā)明涉及包含至少第一 種3 2GPI多肽的納米顆粒、脂質(zhì)體、脂質(zhì)載體、復(fù)合物、混合物、超分子結(jié)構(gòu)、多分子聚集物 或基于脂質(zhì)的藥物遞送系統(tǒng)。β 2GPI多肽可以是二聚體，但不必一定是二聚體。β 2GPI多 肽可以附著或不附著至另外的治療劑。此類脂質(zhì)體將優(yōu)選是隱蔽的脂質(zhì)體，并且在脂質(zhì)體 核心中可以包含治療劑。
[〇31〇] 本發(fā)明的再進(jìn)一步的方面涉及P2GPI多肽（除附著至Fc區(qū)的0 2GPI多肽以外） 的組合物，其中所述β 2GPI多肽可操作地附著至至少第一種治療劑，以及涉及各種使用方 法。特別優(yōu)選的是其中0 2GPI多肽可操作地附著至至少第一種細(xì)胞因子例如TNFa、IL-2 或IFNa的組合物。在某些實施方案中，所述0 2GPI多肽將是二聚體，并且二聚的0 2GPI 多肽將可操作地附著至至少第一種治療劑，例如細(xì)胞因子。特別考慮將任何此類0 2GPI細(xì) 胞因子構(gòu)建體或綴合物用于治療疾病，包括病毒感染。
[0311] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療癌癥的方法和治療病毒感染的方法，包括向有此 需要的動物施用治療有效量的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含可操作地附著至至少第一種細(xì)胞因 子優(yōu)選TNFa、IL-2或IFNa的β 2GPI多肽。所述β 2GPI多肽可以是二聚的β 2GPI多 肽。
[0312] Ε.另外試劑的綴合物
[0313] 本發(fā)明的構(gòu)建體和受體-抗體還可用于遞送附著的治療劑至特定靶，例如腫瘤和 腫瘤內(nèi)血管系統(tǒng)、腫瘤細(xì)胞、受病毒感染的細(xì)胞和病毒顆粒。盡管不涉及含有Fc區(qū)的構(gòu)建 體，但美國專利6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213各自特別引入本文作為參考，以為了獲 得其關(guān)于附著至治療劑的氨基磷脂結(jié)合蛋白的一般教導(dǎo)。因為本發(fā)明的構(gòu)建體和受體-抗 體還可在安全且有效的抗病毒療法中使用，所以這些構(gòu)建體還可有利地連接至一系列已知 的抗病毒劑。
[0314] 在本發(fā)明的這些方面，本發(fā)明的任何構(gòu)建體、受體-抗體或抗體可以用于制備 綴合物。在此類綴合物中使用的試劑優(yōu)選包括抗細(xì)胞劑或細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、趨化因 子、V型ΑΤΡ酶抑制劑、蛋白質(zhì)合成抑制劑、化學(xué)治療劑、抗血管生成劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗 微管蛋白藥物、放射性同位素、凝血劑或抗病毒劑。在抗病毒綴合物中，不需要使用第二種 抗病毒劑作為附著的試劑。
[0315] Ε1.抗細(xì)胞劑和細(xì)胞毒性劑
[0316] 在某些應(yīng)用中，治療劑是細(xì)胞毒性劑或藥理活性劑，尤其是能殺死細(xì)胞（特別是 腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或受病毒感染的細(xì)胞）或者抑制其生長或分裂的細(xì)胞毒性劑、細(xì) 胞抑制劑、或者抗細(xì)胞劑。
[0317] 抗細(xì)胞藥劑的范例包括化療劑，以及細(xì)胞毒素?？梢允褂玫幕焺┌ǎ杭に?，諸 如類固醇；抗代謝物，諸如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、或氨基喋呤；蒽環(huán)霉素；絲裂霉 素 C ;長春花生物堿；秋水仙胺；依托泊苷；普卡霉素；抗腫瘤烷化藥劑，諸如苯丁酸氮芥或 苯丙氨酸氮芥。其他實施方案可以包括諸如細(xì)胞因子等藥劑?；旧峡梢允褂萌魏慰辜?xì) 胞藥劑，條件是它能夠以某種方式成功地綴合至構(gòu)建體從而能夠在靶向的細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì) 胞）位點(diǎn)處向血液成分進(jìn)行靶向、內(nèi)在化、釋放、和/或呈遞。
[0318] 可能會有這樣的情況，比如靶抗原沒有通過與有毒化合物的有效去毒一致的途徑 發(fā)生內(nèi)在化，需要靶向化療劑，諸如抗腫瘤藥物、細(xì)胞因子、抗代謝物、烷化劑、激素、等等。 目前多種化療劑和其他藥理活性劑已經(jīng)成功地綴合，并顯示藥學(xué)功能，包括多柔比星、道諾 霉素、氨甲蝶呤、長春花堿、新制癌菌素、大分子霉素、三乙烯亞胺苯醌、和a -鵝膏蕈堿。
[0319] 在其他情況中，可以通過使用DNA合成抑制劑來消除來自基于細(xì)胞毒素療法的任 何潛在副作用，諸如道諾霉素、多柔比星、阿霉素等等。因此這些藥劑是用于本發(fā)明某些方 面的抗細(xì)胞藥劑的優(yōu)選范例。至于抑制細(xì)胞的藥劑，這些化合物通常擾亂靶細(xì)胞的正常細(xì) 胞周期，優(yōu)選使得細(xì)胞退出細(xì)胞周期。
[0320] 已知多種細(xì)胞毒性劑可以綴合。范例包括大量有用的植物、真菌、或細(xì)菌衍生毒 素，例如包括各種A鏈毒素，特別是蓖麻毒蛋白A鏈；核糖體滅活蛋白，諸如皂草素或白樹 毒蛋白；α -帚曲菌素；曲霉素；局限曲霉菌素；核糖核酸酶，諸如胎盤核糖核酸酶；白喉毒 素；和假單胞菌外毒素等等。
[0321] 在此特別地引入眾所周知的由Arthur E. Frankel所編的1992毒素書籍 "Genetically Engineered Toxins"（包括附錄）作為參考以進(jìn)一步描述或使得能夠在目 的構(gòu)建體中使用毒素，所述書籍包括大量毒素的一級氨基酸序列。
[0322] 在毒素中，優(yōu)選使用白樹毒蛋白和蓖麻毒蛋白A鏈。利用白樹毒蛋白作為可與標(biāo) 記結(jié)合的免疫綴合物的效應(yīng)物或毒素部分在美國專利6, 051，230(特別引入本文作為參 考）以及美國專利6, 451，312 (它特別涉及與作為靶向劑的VEGF連接的白樹毒蛋白）中有 描述，其中所述標(biāo)記是血管化腫瘤的腫瘤內(nèi)血管中表達(dá)的，或易于接近而結(jié)合它，吸附或定 位在其上。
[0323] 對于篦麻毒素 A鏈來說，更優(yōu)選的毒素部分常常是經(jīng)處理而修飾或除去碳水化合 物殘基的蓖麻毒蛋白A鏈，即所謂的"脫糖基A鏈"（dgA)。脫糖基蓖麻毒蛋白A鏈?zhǔn)莾?yōu)選 的，因為它極有效力、半衰期較長，而且進(jìn)行臨床等級和規(guī)模的制造在經(jīng)濟(jì)上是可行的。
[0324] 從制藥學(xué)的立場出發(fā)，可能希望采用盡可能小的分子而又提供適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)應(yīng) 答。由此可能希望采用提供適當(dāng)?shù)目辜?xì)胞應(yīng)答的較小A鏈肽。為了這個目標(biāo)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蓖 麻毒蛋白A鏈可以通過Nagarase (Sigama)除去30個N末端氨基酸而"截短"，但仍保留適 當(dāng)?shù)亩舅鼗钚?。建議需要時可以將這種截短的A鏈用于本發(fā)明的綴合物中。
[0325] 或者，可發(fā)現(xiàn)對毒素 A鏈部分應(yīng)用重組DNA技術(shù)可以提供本發(fā)明的額外好處。實 現(xiàn)了有生物學(xué)活性的蓖麻毒蛋白A鏈的克隆和表達(dá)后，現(xiàn)在有可能鑒定并制備仍展示適當(dāng) 毒素活性的更小的肽或變體肽。此外，蓖麻毒蛋白A鏈已被克隆的事實使得能夠應(yīng)用定點(diǎn) 誘變，由此容易的制備并篩選A鏈衍生肽，獲得可用于本發(fā)明的其他有用部分。
[0326] E2.細(xì)胞因子
[0327] 細(xì)胞因子和趨化因子是可與本發(fā)明的構(gòu)建體、受體-抗體或抗體連接的藥 劑的特定實例?？梢允褂靡幌盗械募?xì)胞因子，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-11、IL-13、TGF- β、M-CSF、G-CSF、TNF β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、0SM、 TMF、IFN-a、INF-P。更優(yōu)選的細(xì)胞因子包括 IL-Ια、IL-1P、IL-2、IL-6、IL-10、GM-CSF、 IFN- γ、單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白-1 (MCP-1)、血小板衍生生長因子-BB(H)GF-BB)和C-反應(yīng) 蛋白（CRP)等等。尤其優(yōu)選的例子是TNFa、TNFa誘導(dǎo)物、IL-2、IL-12、IFN-a、INF-β、 IFN-γ 和 LEC。
[0328] TNFa增加了血管的通透性。此藥劑預(yù)計可用于附著本發(fā)明的構(gòu)建體、受體-抗體 或β_抗體，尤其是在所產(chǎn)生的綴合物用于治療癌癥的組合療法中時。所述構(gòu)建體將遞送 附著的TNFa至腫瘤環(huán)境中，且在腫瘤中引起的血管通透性的增強(qiáng)將促進(jìn)第二種抗癌劑滲 透入腫瘤中，因此擴(kuò)大了全面的抗腫瘤效果。
[0329] 例如，IL-12可與構(gòu)建體、受體-抗體或β -抗體連接并用于重新指導(dǎo)宿主防御系 統(tǒng)，從而攻擊腫瘤血管。趨化因子LEC (肝臟表達(dá)的趨化因子，也稱為NCC-4、HCC-4或LMC) 是另一種優(yōu)選的組分（Giovarelli等人，2000)。LEC對于樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK 細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞是趨化性的，因此能增強(qiáng)宿主介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)。
[0330] E3.凝血因子
[0331] 本發(fā)明的構(gòu)建體、受體-抗體或抗體可與能直接或間接刺激凝血的組分 連接形成凝血配體。為了進(jìn)一步描述凝血劑的操作性附著形成凝血配體，將美國專利 6, 093, 399、6, 004, 555、5, 877, 289 和 6, 036, 955 特別引入本文作為參考。
[0332] 本發(fā)明的構(gòu)建體、受體-抗體或β -抗體可以直接連接凝血劑或凝血因子，或者可 以連接可結(jié)合而后釋放凝血劑或凝血因子的第二種結(jié)合區(qū)。如本文所用，術(shù)語"凝血劑"和 "凝血因子"都用于指在適當(dāng)條件下，優(yōu)選當(dāng)?shù)竭_(dá)特定體內(nèi)環(huán)境（諸如腫瘤血管系統(tǒng)）時，能 夠直接或間接刺激凝血的成分。
[0333] 優(yōu)選的凝血因子是組織因子組合物，諸如截短的TF(tTF)、二聚體、多聚體、和突變 TF分子。"截短的TF"（tTF)指通過除去足夠多的實現(xiàn)膜結(jié)合特性改變的氨基酸序列從而 變成膜結(jié)合缺陷型的TF構(gòu)建物。本文中的"足量"指最初足以使TF分子進(jìn)入膜或介導(dǎo)TF 蛋白質(zhì)的功能性膜結(jié)合的跨膜氨基酸序列的量。通過除去"足夠量的跨膜序列"產(chǎn)生了截 短的組織因子蛋白質(zhì)或多肽，其結(jié)合磷脂膜的能力是缺陷的，使得該蛋白質(zhì)是不顯著結(jié)合 磷脂膜的基本上可溶的蛋白質(zhì)。因此，截短的TF在標(biāo)準(zhǔn)TF測定法中基本上不能夠?qū)⒁蜃?VII轉(zhuǎn)變成因子Vila，但是仍然保留所謂的催化活性，包括在存在因子Vila時激活因子X。
[0334] 美國專利 5, 504, 067、6, 156, 321、6, 132, 729 和 6, 132,730(特別引入本文作為參 考）進(jìn)一步描述了這些截短的組織因子蛋白質(zhì)。優(yōu)選用于本發(fā)明這些方面的組織因子通常 不含該蛋白質(zhì)的跨膜和胞質(zhì)區(qū)（第220 - 263位氨基酸）。但是，也不需要將截短的TF分 子局限于長度恰好是219個氨基酸的分子。
[0335] 二聚體的組織因子組合物也是有用的?？梢砸远垠w的形式制備任何截短的、突 變的、或其他組織因子構(gòu)建物以用于本發(fā)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，通過分子生物 學(xué)和重組表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在同一讀碼框中制備兩個編碼區(qū)并由表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，可以 制備這些TF二聚體。同樣，可以將各種化學(xué)綴合技術(shù)用于制備TF二聚體?？梢栽诰Y合前 對各TF單體進(jìn)行衍生化。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的知道所有這些技術(shù)。
[0336] 如果需要，可以經(jīng)生物學(xué)可釋放鍵連接組織因子二聚體或多聚體，諸如可選擇性 切割的接頭或氨基酸序列。例如，可使用包含酶切割位點(diǎn)的肽接頭，所述酶優(yōu)先定位于腫瘤 環(huán)境或在腫瘤環(huán)境內(nèi)有活性。這些肽接頭的例示性形式是供尿激酶、纖溶酶、凝血酶、因子 IXa、因子Xa、或金屬蛋白酶（諸如膠原酶、明膠酶、或溶基質(zhì)素）切割的肽接頭。
[0337] 在某些實施方案中，組織因子二聚體還可以包含受阻的疏水性膜插入部分，以便 日后促進(jìn)組織因子與磷脂酶的功能性聯(lián)合，但是這只發(fā)生于某些特定條件下。正如關(guān)于截 短的組織因子的內(nèi)容中所述，疏水性膜聯(lián)合序列通常是由于其疏水本質(zhì)可驅(qū)動與磷脂環(huán)境 的聯(lián)合的氨基酸段。同樣，脂肪酸可以用于提供潛在的膜插入部分。
[0338] 這些膜插入序列可以位于TF分子的N末端或C末端，或者通常附著于該分子的任 何其他位點(diǎn)，只要它們的附著不阻礙TF構(gòu)建物的功能特性即可。受阻插入部分的意圖是在 TF構(gòu)建物定位于腫瘤環(huán)境前保持無功能，并使得疏水性附著物能夠接近并進(jìn)一步促進(jìn)與膜 的物理學(xué)聯(lián)合。此外，預(yù)計生物學(xué)可釋放鍵和可選擇性切割序列在這方面特別有用，其中所 述鍵或序列只在定位于腫瘤環(huán)境內(nèi)并暴露于特定酶或其他生物活性分子時才受到切割或 修飾。
[0339] 在其他實施方案中，tTF構(gòu)建物可以是多聚體。在此內(nèi)容中，"多聚體構(gòu)建物"包含 3個或更多組織因子構(gòu)建物。"多聚體TF構(gòu)建物"指包含第一 TF分子或衍生物可操作附著 至少第二和第三TF分子或衍生物的構(gòu)建物。多聚體可以包含大約3個一大約20個TF分 子。多聚體中的各TF單元也可以通過可選擇性切割的肽接頭或其他生物學(xué)可釋放鍵相連。 此外，正如上文就TF二聚體所述，可以使用重組操作和表達(dá)或使用標(biāo)準(zhǔn)合成化學(xué)來生成構(gòu) 建物。
[0340] 可用于本發(fā)明的其他TF構(gòu)建物是激活因子VII的能力缺陷的突變體。本文通常 將這些"因子VII激活突變體"定義為可結(jié)合功能性因子VII/VIIa，通過蛋白水解激活因子 X，但是基本上不能通過蛋白水解激活因子VII的TF突變體。因此，這些構(gòu)建物是缺乏因子 VII激活活性的TF突變體。
[0341] 這些因子VII激活突變體促進(jìn)腫瘤特異性凝血的能力基于的是它們對腫瘤血管 系統(tǒng)的特異性遞送和血漿中低水平存在的因子Vila。在施用了這些因子VII激活突變體綴 合物后,突變體將定位于血管化腫瘤的血管系統(tǒng)內(nèi)。在定位前，由于TF突變體不能將因子 VII轉(zhuǎn)變成因子Vila，因此它通常不能夠在任何其他身體部位啟動凝血。但是，在定位于腫 瘤區(qū)并積累后，突變體將遭遇來自血漿的足夠因子Vila，從而起始外在凝血途徑，導(dǎo)致腫瘤 特異性血栓癥。也可以對患者施用外源因子Vila。
[0342] 可以制備多種組織因子VII激活突變體中的一種或多種，并用于本發(fā)明。現(xiàn)在有 了關(guān)于TF上因子VII/VIIa識別位點(diǎn)的充足科技知識。由此可以理解，因子VII活化區(qū)通 常位于TF分子的大約第157位一大約第167位氨基酸之間。但是，預(yù)計該區(qū)域外的殘基也 可能與因子VII激活活性有關(guān)，由此可考慮在TF序列大約第106位一大約第209位氨基酸 之間的任何一個或多個殘基處導(dǎo)入突變（W094/07515 ;W094/28017 ;引入本文作為參考）。
[0343] 如美國專利 6, 093, 399、6, 004, 555、5, 877, 289 和 6, 036, 955 中所述的，多種其他 凝血因子可以用于本發(fā)明，例示性藥劑見下文。凝血酶、因子V/Va及其衍生物、因子VIII/ Villa及其衍生物、因子IX/IXa及其衍生物、因子X/Xa及其衍生物、因子ΧΙ/XIa及其衍生 物、因子ΧΠ /XIIa及其衍生物、因子XIII/XIIla及其衍生物、因子X激活劑、和因子V激活 劑可用于本發(fā)明。
[0344] Russell蝰蛇毒因子X激活劑預(yù)計可用于本發(fā)明。已生成了對Russell蝰蛇毒液 中存在的因子X激活劑具有特異性的單克隆抗體，并可作為雙特異性結(jié)合性配體的一部分 用于特異性遞送藥劑。
[0345] 血栓烷A是由內(nèi)過氧化物通過血小板微粒體中的環(huán)加氧酶和血栓烷合成酶的依 次反應(yīng)形成的。血栓烷4是由血小板產(chǎn)生的，而且由于其能夠引起血小板聚集，它還是有 效的血管收縮劑。血栓烷A 2及其活性類似物預(yù)計可用于本發(fā)明。
[0346] 血栓烷合酶和合成激活血小板的前列腺素的其他酶也可在本文中作為"凝血劑" 使用。針對血栓烷合酶的單克隆抗體和血栓烷合酶的免疫親和純化是已知的，人血栓烷合 酶的cDNA也是已知的。
[0347] α 2-抗纖溶酶或α 2-纖溶酶抑制劑是人血漿中天然存在的蛋白酶抑制劑，能夠有 效抑制由纖溶酶原激活劑誘導(dǎo)的纖維蛋白凝塊的裂解。α2-抗纖溶酶是特別有效的抑制 齊U，預(yù)計可用于本發(fā)明。
[0348] 由于可以獲得α 2-抗纖溶酶的cDNA序列，因此優(yōu)選重組表達(dá)和/或融合蛋白質(zhì)。 還可以獲得針對α 2-抗纖溶酶的單克隆抗體，可用于本發(fā)明的雙特異性結(jié)合性配體實施方 案。這些抗體可用于將外源α2-抗纖溶酶遞送至靶位點(diǎn)或儲存內(nèi)源α 2-抗纖溶酶，并使其 集中在靶區(qū)內(nèi)。
[0349] Ε4.抗微管蛋白藥物
[0350] 一系列藥物可經(jīng)干擾微管蛋白活性來展現(xiàn)其效果。由于微管蛋白的功能是有絲分 裂和細(xì)胞生存所必需的，所以某些"抗微管蛋白藥物"是強(qiáng)有力的化療劑。如本文中所使用 的，"抗微管蛋白藥物"指任何這樣的藥劑、藥物、藥物前體或其組合，其抑制細(xì)胞有絲分裂， 優(yōu)選地通過直接或間接抑制細(xì)胞有絲分裂所需的微管蛋白活性，優(yōu)選微管蛋白聚合化或去 聚合化。
[0351] 目前了解得更清楚也更優(yōu)選用于本發(fā)明的抗微管蛋白藥物包括秋水仙堿；紫杉 烷類，諸如紅豆杉醇；長春花生物堿，諸如長春花堿、長春花新堿、和長春堿酰胺；和考布他 汀。其他合適的抗微管蛋白藥物是細(xì)胞松弛素（包括B、J、E)、多拉司他汀、auristatin ΡΕ、 紫杉醇、ustiloxin D、根霉素、1069C85、秋水仙胺、阿苯達(dá)唑、阿扎毒素和諾考達(dá)唑。
[0352] 如美國專利5, 892, 069、5, 504, 074和5, 661，143 (本文特別引入作為參考）中所 述，考布他汀是通常抑制細(xì)胞有絲分裂的雌二醇衍生物。可用于本發(fā)明的例示性考布他汀 包括基于考布他汀A、B、和/或D的那些和美國專利5, 892, 069、5, 504, 074、和5, 661，143 中所述的那些。考布他汀A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3和B-4是上述類型的 范例。
[0353] 美國專利5, 569, 786和5, 409, 953 (引入本文作為參考）描述了考布他汀A-1、 Α-2、Α-3、Β-1、Β-2、Β-3和B-4的分離、結(jié)構(gòu)表征、和合成，以及使用這些考布他汀來治療腫 瘤生長的制劑和方法。這些考布他汀中的一種或多種都可用于本發(fā)明。
[0354] 如美國專利 5, 892, 069、5, 504, 074、5, 661，143 和 4, 996, 237 (本特別引入文作為 參考）中所述，考布他汀A-4也可用于本文。美國專利5, 561，122 (引入本文作為參考）進(jìn) 一步描述了合適的考布他汀A-4前藥，預(yù)計可與本發(fā)明聯(lián)合使用。
[0355] 美國專利4, 940, 726 (特別引入本文作為參考）特別描述了命名為考布他汀D-1 和考布他D-2的大環(huán)內(nèi)酯，可與本發(fā)明的組合物和方法聯(lián)合使用。美國專利5, 430, 062 (特 別引入本文作為參考）涉及具有抗癌活性、可與本發(fā)明聯(lián)合使用的芪衍生物和考布他汀類 似物。
[0356] E5.抗血管發(fā)生劑
[0357] 抗血管發(fā)生劑可用于附著至本發(fā)明的構(gòu)建體、受體-抗體或β_抗體。許多抗癌 劑作用機(jī)制的一部分是具有抗血管發(fā)生效用。針對聯(lián)合療法所述的任何一種或多種這樣的 藥劑，包括表Ε中的藥劑，都還可以按本文所述與本發(fā)明的構(gòu)建體、受體-抗體或β -抗體 綴合。已發(fā)現(xiàn)、設(shè)計或選擇了某些其他藥劑，它們的主要作用機(jī)制是具有抗血管發(fā)生效用。 所說藥劑的實例描述如下，其中的任一種都還可以用于制備綴合物或分別用于本發(fā)明的聯(lián) 合療法中。
[0358] 現(xiàn)在已知大量的酪氨酸激酶抑制劑可用于治療在多種疾病狀態(tài)中出現(xiàn)的血管發(fā) 生，包括例如美國專利5, 639, 757 (特別引入本文作為參考）描述的4-氨基吡咯并[2, 3-d] 嘧啶，它也可以與本發(fā)明聯(lián)合使用。能夠調(diào)節(jié)經(jīng)VEGFR2受體的酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的有 機(jī)分子的其他范例是美國專利5, 792, 771的喹唑啉化合物和組合物，這項專利在此特別引 入，以便描述可以與本發(fā)明聯(lián)合用于治療血管發(fā)生性疾病的其他組合。
[0359] 其他化學(xué)類化合物也已經(jīng)顯示可抑制血管發(fā)生，而且可用于與本發(fā)明的聯(lián)合。例 如，聯(lián)合療法中可以采用類固醇，諸如美國專利5, 972, 922(特別引入本文作為參考）中描 述的抑血管的4, 9 (11)-類固醇和C21-氧合類固醇。美國專利5, 712, 291和5, 593, 990 (特 別引入本文作為參考）描述了沙利度胺及相關(guān)化合物、前體、類似物、代謝物和水解產(chǎn)物， 它們也可以與本發(fā)明聯(lián)合用于抑制血管發(fā)生。美國專利5, 712, 291和5, 593, 990中的化合 物可以口服施用。表B列出了可用于聯(lián)合療法的其他例示性抗血管發(fā)生劑，其中列出的每 一種藥劑都只是例示而絕非限制。
[0360] 表B.血管發(fā)生的抑制劑和負(fù)調(diào)控劑
[0361]
【權(quán)利要求】
1. 構(gòu)建體，其包含經(jīng)由共價鍵、通過重組表達(dá)為融合蛋白或者經(jīng)由肽或化學(xué)接頭而可 操作地結(jié)合至兩個β2-糖蛋白I(i32GPI)多肽的抗體Fc區(qū)，其中所述02GPI多肽分別至 少包含β 2GPI的完整的結(jié)構(gòu)域V ;所述β 2GPI多肽在結(jié)合至所述Fc區(qū)時結(jié)合磷脂酰絲氨 酸；并且所述Fc區(qū)不包含抗原結(jié)合區(qū)域、抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合片段。
2. 權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其中所述β 2GPI多肽分別至少包含β 2GPI的完整的結(jié)構(gòu)域 V，以及P2GPI的其他四個結(jié)構(gòu)域中的一個或多個。
3. 權(quán)利要求2的構(gòu)建體，其中所述β 2GPI多肽分別至少包含β 2GPI的完整的結(jié)構(gòu)域 V和β 2GPI的結(jié)構(gòu)域I。
4. 權(quán)利要求2的構(gòu)建體，其中所述β 2GPI多肽分別包含β 2GPI的結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域 Π 、結(jié)構(gòu)域III、結(jié)構(gòu)域IV和完整的結(jié)構(gòu)域V。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項的構(gòu)建體，其中所述β 2GPI多肽分別是人β 2GPI多肽。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項的構(gòu)建體，其中所述抗體Fc區(qū)是來自人IgGl(Yl)或人 IgG3U3)抗體的Fc區(qū)。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體進(jìn)一步可操作地結(jié)合至至少一種 診斷劑、成像劑或治療劑。
8. 權(quán)利要求7的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體進(jìn)一步可操作地結(jié)合至至少一種抗血管發(fā)生 齊[J、抗癌劑或抗病毒劑。
9. 包含權(quán)利要求1-8中任一項的構(gòu)建體的組合物，其用于治療。
10. 包含權(quán)利要求1-8中任一項的構(gòu)建體的組合物，其用于治療癌癥。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述組合物用于與第二種治療劑或抗癌劑相組合地或 者與放療相組合地進(jìn)行使用。
12. 包含權(quán)利要求1-8中任一項的構(gòu)建體的組合物，其用于治療病毒感染或病毒疾病。
13. 權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物用于與第二種治療劑或抗病毒劑相組合地 進(jìn)行使用。
14. 權(quán)利要求1-8中任一項的構(gòu)建體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
15. 權(quán)利要求14的用途，其中所述藥物用于與第二種治療劑或抗癌劑相組合地或者與 放療相組合地進(jìn)行使用。
16. 權(quán)利要求1-8中任一項的構(gòu)建體在制備用于治療病毒感染或病毒疾病的藥物中的 用途。
17. 權(quán)利要求16的用途，其中所述藥物用于與第二種治療劑或抗病毒劑相組合地進(jìn)行 使用。
【文檔編號】C07K19/00GK104109209SQ201410301233
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2005年1月24日
【發(fā)明者】P·E·斯奧比, T·A·魯斯特, S·W·金 申請人:得克薩斯大學(xué)體系董事會, 派瑞格恩醫(yī)藥公司