甾體羥化雜質的去除方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及化合物雜質的去除方法，具體涉及甾體羥化雜質的去除方法，本發(fā)明先對生物轉化方法制備得到的粗品進行脫色處理，然后采用體積重量比5-30倍的含氯碳氫化合物溶解粗品，加入脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物溶劑析出結晶，其中脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物與含氯碳氫化合物的體積比為1-2∶1的方法去除甾體化合物生物轉化過程中產生的雙羥化物雜質。本發(fā)明提供一種的甾體雙羥化物的去除方法雜質去除效率高，產品收率高，生產操作方便，對設備、人員要求較低，適于大規(guī)模生產。
【專利說明】甾體羥化雜質的去除方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物雜質的去除方法，具體涉及留體羥化雜質的去除方法。

【背景技術】
[0002] 采用微生物轉化的方法，幾乎可以在留體母核的所有位置進行羥化反應。采用 微生物轉化方法實現(xiàn)留體特定位置的羥化反應較化學合成方法專一性強。但在一些實際 應用中其羥化反應也存在著副反應和副產物的生成，如1998年Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic5中公開了 Anto' nia Jekkel采用雪腐鐮孢轉化得到15α-輕 基-13-乙基-留體-4-烯-3,17-雙酮時，發(fā)現(xiàn)存在7,15雙羥化物的副產物。 申請人:在采 用霉菌轉化制備11 α -羥基-13-乙基-留體-4-烯-3,17-雙酮時發(fā)現(xiàn)最大的副產物為 10,11位雙羥化物。這些雙羥化合物雜質很多都是因為羥化酶的特異性差而產生的。
[0003] 現(xiàn)有技術中留體羥化雜質（單羥化物）的去除方法主要有兩種：
[0004] 一種是重結晶法，其原理是通過目標產物與雜質在某種溶媒中的溶解度差異以及 它們的溶解度隨溫度變化的差異來分離，純化目標產物，最終將雜質留存于母液中，而目標 產物得以結晶析出。采用該方法分離純化羥化物，在重結晶時析出的晶體中，由于雜質的理 化性質的近似，雙羥化物會與目標產物一同析出結晶，從而影響終產品的質量，若通過反復 重結晶終產品的收率將受到很大的影響。
[0005] 另一種是柱層析法，該方法選擇合適的洗脫劑（一般是有固定配比的混合溶媒） 沖洗裝載粗品的硅膠柱，通過目標產物與雜質在硅膠柱中的遷移差異來分離，純化目標產 物。對于柱層析方法，首先需要選擇合適的洗脫劑，雙羥化物和目標產物（留體羥化物）性 質接近，導致洗脫劑的選擇范圍很小，在洗脫過程中經常也不能完全分離，而產生"夾帶"現(xiàn) 象，最終導致了分離效果不佳，產品收率和質量受影響。同時采用柱層析方法，通常對于實 驗室規(guī)模的樣品較為方便可行，在工業(yè)化生產規(guī)模，會遇到諸如洗脫劑使用量和硅膠粉使 用量過于龐大，裝柱操作復雜對操作者技能要求較高等問題，另外在實際操作中還需要經 常檢測洗脫液組分，如采用TLC方法檢測，操作繁瑣，影響效率。
[0006] 綜上所述，在采用微生物方法獲得留體的羥化物的過程中，留體的雙羥化物是經 常出現(xiàn)的主要雜質，而它與目標產物在結構上只有留體某一位置的一個羥基的差異，其溶 解度和極性與目標產物性質很接近，這就導致了采用重結晶或柱層析的分離純化方法難以 有效的去除留體雙羥化物雜質。
[0007] 目前文獻沒有關于留體羥化反應的產物中雙羥化物的分離純化方法的報道。


【發(fā)明內容】

[0008] 為了解決現(xiàn)有技術中留體羥化雜質去除困難的問題，尤其是留體雙羥化物去除困 難的問題，本發(fā)明提供一種雜質去除效率高，產品收率高，生產操作方便，對設備、人員要求 較低，適于大規(guī)模生產的留體雙羥化物的去除方法。
[0009] 實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案為：
[0010] 本發(fā)明提供一種留體雙羥化物的去除方法，包括如下步驟：
[0011] 1)制備粗品
[0012] 通過生物轉化的方法制備粗品；
[0013] 2)粗品的處理
[0014] 對粗品進行脫色處理；
[0015] 3)混合溶媒結晶除雜
[0016] 采用體積重量比5-30倍的含氯碳氫化合物溶解粗品，加入脂肪或環(huán)狀脂肪碳 氫化合物溶劑析出結晶，其中脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物與含氯碳氫化合物的體積比為 1_2 : 1，得到精制品。
[0017] 其中步驟2)的粗品的脫色處理是由于生物轉化得到的留體粗品通常含有色素、 多糖、雜蛋白、細胞破碎物等，這些物質的存在會影響步驟3)的除雜精制效果，所以需要預 先對粗品進行處理，采用活性炭吸附處理可以有效的去除以上的雜質。
[0018] 上述步驟2)中的粗品的處理中脫色處理采用將粗品溶解于體積重量比（V/ M) 20-40倍的含有C1-C4的醇類、酯類或酮類的有機溶媒中，然后加入活性炭進行脫色。
[0019] 其中的C1-C4的醇類為甲醇、乙醇或丙醇；酯類為乙酸乙酯；酮類為丙酮。
[0020] 上述步驟3)中的含氯碳氫化合物為二氯甲烷或氯仿。
[0021] 上述步驟3)中的脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物溶劑為正己烷、環(huán)己烷或甲基環(huán)己 燒。
[0022] 本發(fā)明進一步提供留體雙羥化物的去除方法，包括如下步驟：
[0023] 1)制備粗品
[0024] 經過生物轉化的發(fā)酵液（或菌體）采用常規(guī)方法提取獲得濃縮液，濃縮液經過減 壓濃縮得到粗品；
[0025] 2)粗品的脫色處理
[0026] 粗品溶解于體積重量比（V/M) 20-40倍的含有C1-C4的醇類、酯類或酮類的有機溶 媒中，加熱回流待粗品完全溶解，降溫5-10°C，向體系中投入粗品重量20-50%的活性炭， 再次加熱回流，攪拌回流〇. 5小時，然后趁熱抽濾，得到澄清濾液，將澄清濾液減壓濃縮至 干，得到固體；
[0027] 3)混合溶媒結晶除雜
[0028] 向固體中加入體積重量比（V/M) 5-30倍的含氯碳氫化合物，將固體表面浸沒充分 攪拌溶解，再次過濾得到澄清濾液，將濾液轉移至一具有攪拌和緩慢滴加溶媒的設備中，向 濾液中緩慢滴加脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物溶劑，同時適當攪拌并保持溫度在15_25°C，滴 加至脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物與含氯碳氫化合物的體積比為1-2 : 1，然后緩慢攪拌保 溫0. 5小時，過濾去除析出的白色固體，得到澄清濾液，將濾液減壓濃縮至干得到精制品。
[0029] 上述步驟2)中的C1-C4的醇類為甲醇、乙醇或丙醇。
[0030] 上述步驟2)中的酯類為乙酸乙酯。
[0031] 上述步驟2)中的酮類為丙酮。
[0032] 上述步驟3)中的含氯碳氫化合物為二氯甲烷或氯仿。
[0033] 上述步驟3)中的脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物溶劑為正己烷、環(huán)己烷或甲基環(huán)己 燒。
[0034] 本發(fā)明還提供一種11 α -羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮中10,11雙羥 化物的去除方法，包括如下步驟：
[0035] 1)制備粗品
[0036] 經過生物轉化的發(fā)酵液（或菌體）采用常規(guī)方法提取獲得濃縮液，濃縮液經過減 壓濃縮得到粗品；
[0037] 2)粗品的脫色處理
[0038] 粗品溶解于體積重量比（V/M)20_40倍的含有乙醇或乙酸乙酯，加熱回流待粗品 完全溶解，降溫5-KTC，向體系中投入粗品重量20-50%的活性炭，再次加熱回流，攪拌回 流〇. 5小時，然后趁熱抽濾，得到澄清濾液，將澄清濾液減壓濃縮至干，得到固體；
[0039] 3)混合溶媒結晶除雜
[0040] 向固體中加入體積重量比（V/M)5_30倍的二氯甲烷，將固體表面浸沒充分攪拌溶 解，再次過濾得到澄清濾液，將濾液轉移至一具有攪拌和緩慢滴加溶媒的設備中，向濾液中 緩慢滴加正己烷或環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷，同時適當攪拌并保持溫度在15-25°C，滴加至正己 烷或環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷與二氯甲烷的體積比為1-2 : 1，然后緩慢攪拌保溫0.5小時，過 濾去除析出的白色固體，得到澄清濾液，將濾液減壓濃縮至干得到精制品。
[0041] 上述步驟3)中的正己烷或環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷與二氯甲烷的體積比優(yōu)選 1. 2-1. 5 : 1。
[0042] 本發(fā)明的有益效果為：
[0043] 1、雙羥化物去除率高，產品收率高：從實施例1和3中可以看出，甾體化合物中的 雙羥化合物能從粗品中的30%含量，降低到0. 5%左右，精制品中基本上不含留體雙羥化 物。采用柱層析法去除雙羥化物，目標產物回收率約為82%，而采用本發(fā)明的方法目標產物 的回收率高于90%，回收率大大提高。
[0044] 2、設備要求簡單：本發(fā)明的方法所用到的設備都是比較簡單和常用的設備，易于 工業(yè)化生產。
[0045] 3、操作簡便：柱層析方法在操作中過程繁瑣，需要硅膠粉裝柱、樣品處理（干法上 樣）、上樣、洗脫、點板收集、濃縮等操作，這些操作需要操作人員較好的掌握硅膠柱層析的 常規(guī)操作，操作過程中需要頻繁TLC監(jiān)控洗脫液成份，以分類收集流出液。本發(fā)明的方法操 作過程均為常規(guī)的化工操作，如減壓濃縮、產品溶解、過濾等，操作相對簡單。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 附圖1 :去除11α-羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮中10,11雙羥化物 的薄層色譜圖（實施例1)。

【具體實施方式】
[0047] 實施例1
[0048] 11 α -羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮中10,11雙羥化物的去除方法
[0049] 采用已知的方法能夠實現(xiàn)該產品的生物轉化，例如US2005/0234251A1專利，采用 一株赭曲霉進行1. 2噸體積為的發(fā)酵，加入的13 β -乙基-4-烯-甾核-3,17-二酮的濃度 為3g/L，生物轉化率為55?60 %。
[0050] 發(fā)酵液經過離心分離菌體和清液，其體積約1. 2m3,清液采用1. 5m3乙酸乙酯萃取3 遍，靜置分層，收集有機相，減壓濃縮至干，向濃縮罐中加入約100L水，攪拌30min后離心甩 濾得到粗品，粗品經過常壓60°C干燥4小時。
[0051] 獲得的粗品重量為3kg，HPLC分析其組成為：
[0052] 11 α -羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3, 17-雙酮 58. 0% 10，11α-雙羥基-13-乙基-留體-4-烯-3, 17-雙酮 30.0% 13 3-乙基-4-烯-甾核-3，17-二酮 3.0% 其他留體 9.0%
[0053] 粗品加入30倍重量體積比（90L)的工業(yè)乙醇，加熱攪拌回流溶解（回流溫度 約78°C )，待粗品完全溶解后，停止加熱，降溫至約73°C，加入粗品重量50 %的活性炭 (1. 5kg)，繼續(xù)加熱攪拌回流0. 5小時，然后然后趁熱抽濾，得到澄清濾液，將澄清濾液減 壓濃縮至干，得到固體，稱量重量約2. 7kg ;
[0054] 向固體中加入體積重量比30倍（81L)的二氯甲烷，將固體表面浸沒充分攪拌溶 解，再次過濾得到澄清濾液（約75L)，將濾液轉移至一具有攪拌和緩慢滴加溶媒的設備中， 向濾液中緩慢滴加正己烷，同時適當攪拌并保持溫度在20°C，滴加至正己烷與二氯甲烷的 體積比為1.5 : 1(即正己烷總體積為113L)，然后緩慢攪拌保溫0.5小時，過濾去除析出的 白色固體，得到澄清濾液，將濾液減壓濃縮至干得到精制品，精制品經過常壓60°C干燥4小 時。
[0055] 獲得的精制品重量為1. 3kg，HPLC分析其組成為：
[0056] 11 α -輕基-13-乙基-留體-4-烯-3, 17-雙酮 93. 0% 10, 11α-雙羥基-13-乙基-留體-4-稀-3, 17-雙酮 0.5% 13 β-乙基-4-稀-甾核-3，17-二酮 2.5% 其他甾體 4.0%
[0057] 實施例2
[0058] 15 α -羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮中雙羥化物的去除方法
[0059] 采用已知的方法能夠實現(xiàn)該產品的生物轉化，如文獻Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic51998. 385-387,采用一株雪腐鐮孢進行1. 5噸體積為的發(fā)酵，力口 入的13 β -乙基-4-烯-甾核-3,17-二酮的濃度為2g/L，生物轉化率為75%。
[0060] 發(fā)酵液經過離心分離菌體和清液，其體積約1. 5m3,清液采用1. 8m3乙酸乙酯萃取3 遍，靜置分層，收集有機相，減壓濃縮至總體積約為10L，冷凍至-5°C，析晶8小時，過濾得到 粗品，粗品經過常壓60°C干燥4小時。
[0061] 獲得的粗品重量為2. 5kg，HPLC分析其組成為：
[0062] 15 α-羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮 85.0%
[0063] 7,15-雙羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮 8.0%
[0064] 其他甾體 7.0%
[0065] 粗品加入20倍重量體積比（50L)的甲醇，加熱攪拌回流溶解（回流溫度約65°C)， 待粗品完全溶解后，停止加熱，降溫至約55°C，加入粗品重量20 %的活性炭（0. 5kg)，繼續(xù) 加熱攪拌回流〇. 5小時，然后然后趁熱抽濾，得到澄清濾液，將澄清濾液減壓濃縮至干，得 到固體，稱量重量約2. 38kg ;
[0066] 向固體中加入體積重量比10倍（約24L)的氯仿，將固體表面浸沒充分攪拌溶解， 再次過濾得到澄清濾液（約22L)，將濾液轉移至一具有攪拌和緩慢滴加溶媒的設備中，向 濾液中緩慢滴加環(huán)己烷，同時適當攪拌并保持溫度在15°C，滴加至環(huán)己烷與二氯甲烷的體 積比為1 : 1(即環(huán)己烷總體積為22L)，然后緩慢攪拌保溫0.5小時，過濾去除析出的白色 固體，得到澄清濾液，將濾液減壓濃縮至干得到精制品，精制品經過常壓60°C干燥4小時。 [0067] 獲得的精制品重量為1. 8kg，HPLC分析其組成為：
[0068] 15 α-羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮 95.0%
[0069] 7,15 α-雙羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮 0.2%
[0070] 其他甾體 4.8%
[0071] 實施例3
[0072] 11 α -羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮中10,11雙羥化物的去除方法
[0073] 采用已知的方法能夠實現(xiàn)該產品的生物轉化，例如US2005/0234251A1專利，采用 一株赭曲霉進行1. 2噸體積為的發(fā)酵，加入的13 β -乙基-4-烯-甾核-3,17-二酮的濃度 為3g/L，生物轉化率為55?60 %。
[0074] 發(fā)酵液經過離心分離菌體和清液，其體積約1. 2m3,清液采用1. 5m3乙酸乙酯萃取3 遍，靜置分層，收集有機相，減壓濃縮至干，向濃縮罐中加入約100L水，攪拌30min后離心甩 濾得到粗品，粗品經過常壓60°C干燥4小時。
[0075] 獲得的粗品重量為3kg，HPLC分析其組成為：
[0076] 11 α -羥基-13-乙基-留體-4-烯-3, 17-雙酮 58. 0% 10，11α-雙羥基-13-乙基-留體-4-烯-3, 17-雙酮 30.0% 13 乙基-4-烯-甾核-3，17-二酮 3.0% 其他甾體 9.0%
[0077] 粗品加入40倍重量體積比（120L)的乙酸乙酯，加熱攪拌回流溶解（回流溫度 約77°C )，待粗品完全溶解后，停止加熱，降溫至約72°C，加入粗品重量30%的活性炭 (0. 9kg)，繼續(xù)加熱攪拌回流0. 5小時，然后然后趁熱抽濾，得到澄清濾液，將澄清濾液減壓 濃縮至干，得到固體，稱量重量約2. 7kg ;
[0078] 向固體中加入體積重量比10倍（27L)的二氯甲烷，將固體表面浸沒充分攪拌溶 解，再次過濾得到澄清濾液（約25L)，將濾液轉移至一具有攪拌和緩慢滴加溶媒的設備中， 向濾液中緩慢滴加甲基環(huán)己烷，同時適當攪拌并保持溫度在25°C，滴加至甲基環(huán)己烷與二 氯甲烷的體積比為2 : 1(即甲基環(huán)己烷總體積為50L)，然后緩慢攪拌保溫0.5小時，過 濾去除析出的白色固體，得到澄清濾液，將濾液減壓濃縮至干得到精制品，精制品經過常壓 60°C干燥4小時。
[0079] 獲得的精制品重量為1. 3kg，HPLC分析其組成為： 11 α -羥基-13-乙基-留體-4-烯-3, 17-雙酮 92. 0% 10，11α-雙羥基-13-乙基-留體-4-烯-3, 17-雙酮 0.6%
[0080] 。 13 β_乙基-4-稀-甾核-3，17-二酮 2.6% 其他甾體 4.8%
【權利要求】
1. 一種留體雙羥化物的去除方法，包括如下步驟： 1) 制備粗品 通過生物轉化的方法制備粗品； 2) 粗品的處理 對粗品進行脫色處理； 3) 混合溶媒結晶除雜 采用體積重量比5-30倍的含氯碳氫化合物溶解粗品，加入脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合 物溶劑析出結晶，其中脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物與含氯碳氫化合物的體積比為1-2 : 1， 得到精制品。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征為：步驟2)采用將粗品溶解于體積重量比（V/ M) 20-40倍的含有C1-C4的醇類、酯類或酮類的有機溶媒中，然后加入活性炭進行脫色。
3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征為：C1-C4的醇類為甲醇、乙醇或丙醇；酯類為 乙酸乙酯；酮類為丙酮。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征為：步驟3)中的含氯碳氫化合物為二氯甲烷或 氯仿。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征為：步驟3)中的脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物溶 齊U為正己烷、環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷。
6. -種留體雙羥化物的去除方法，包括如下步驟： 1) 制備粗品 經過生物轉化的發(fā)酵液或菌體采用常規(guī)方法提取獲得濃縮液，濃縮液經過減壓濃縮得 到粗品； 2) 粗品的脫色處理 粗品溶解于體積重量比20-40倍的含有C1-C4的醇類、酯類或酮類的有機溶媒中，力口 熱回流待粗品完全溶解，降溫5-KTC，向體系中投入粗品重量20-50%的活性炭，再次加熱 回流，攪拌回流〇. 5小時，然后趁熱抽濾，得到澄清濾液，將澄清濾液減壓濃縮至干，得到固 體； 3) 混合溶媒結晶除雜 向固體中加入體積重量比5-30倍的含氯碳氫化合物，將固體表面浸沒充分攪拌溶解， 再次過濾得到澄清濾液，將濾液轉移至一具有攪拌和緩慢滴加溶媒的設備中，向濾液中緩 慢滴加脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物溶劑，同時適當攪拌并保持溫度在15_25°C，滴加至脂肪 或環(huán)狀脂肪碳氫化合物與含氯碳氫化合物的體積比為1-2 : 1，然后緩慢攪拌保溫0.5小 時，過濾去除析出的白色固體，得到澄清濾液，將濾液減壓濃縮至干得到精制品。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征為：步驟2)中的C1-C4的醇類為甲醇、乙醇或 丙醇；酯類為乙酸乙酯；酮類為丙酮。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征為：步驟3)中的含氯碳氫化合物為二氯甲烷或 氯仿，脂肪或環(huán)狀脂肪碳氫化合物溶劑為正己烷、環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷。
9. 一種11 α -羥基-13-乙基-甾體-4-烯-3,17-雙酮中10,11雙羥化物的去除方 法，包括如下步驟： 1)制備粗品 經過生物轉化的發(fā)酵液或菌體采用常規(guī)方法提取獲得濃縮液，濃縮液經過減壓濃縮得 到粗品； 2) 粗品的脫色處理 粗品溶解于體積重量比20-40倍的含有乙醇或乙酸乙酯，加熱回流待粗品完全溶解， 降溫5-10°C，向體系中投入粗品重量20-50%的活性炭，再次加熱回流，攪拌回流0. 5小時， 然后趁熱抽濾，得到澄清濾液，將澄清濾液減壓濃縮至干，得到固體； 3) 混合溶媒結晶除雜 向固體中加入體積重量比5-30倍的二氯甲烷，將固體表面浸沒充分攪拌溶解，再次過 濾得到澄清濾液，將濾液轉移至一具有攪拌和緩慢滴加溶媒的設備中，向濾液中緩慢滴加 正己烷或環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷，同時適當攪拌并保持溫度在15-25°C，滴加至正己烷或環(huán)己 烷或甲基環(huán)己烷與二氯甲烷的體積比為1-2 : 1，然后緩慢攪拌保溫0.5小時，過濾去除析 出的白色固體，得到澄清濾液，將濾液減壓濃縮至干得到精制品。
10.根據(jù)權利要求9所述方法，其特征為：步驟3)中的正己烷或環(huán)己烷或甲基環(huán)己烷 與二氯甲烷的體積比為1.2-1. 5 : 1。
【文檔編號】C07J75/00GK104119421SQ201410308749
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權日:2014年6月27日
【發(fā)明者】潘立, 曹青青, 孫新宇, 胡彪, 唐娜 申請人:華潤紫竹藥業(yè)有限公司