一種用于制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原的合成方法
【專利摘要】一種用于制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原的合成方法，屬于免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用突變型沙門氏菌脂多糖（Ra-LPS）缺失了O特異性側(cè)鏈的特點，采用EDC和NHS方法將LPS末端COOH與匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）進(jìn)行偶聯(lián)，免疫得到的小鼠血清對Ra-LPS和完整型LPS均有效價。用不同血清組的沙門氏菌菌體包被檢測小鼠血清均有交叉反應(yīng)，證明該免疫原可以用來制備沙門氏菌交叉型血清或者單克隆抗體。該免疫原的合成方法為制備沙門氏菌交叉型單克隆抗體，從而實現(xiàn)在菌屬水平上檢測沙門氏菌奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種用于制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原的合成方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原的合成方法，屬于免疫分 析【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 沙門氏菌（Salmonella)是一種全球性的食源性致病菌。生物學(xué)上沙門氏菌是一 類兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌，無芽孢，一般無莢膜，主要抗原有0抗原、Η抗原、Vi抗原。動 物性食品如禽肉、蛋類、乳品容易污染沙門氏菌。人體攝入含菌食物后會引起急性腸胃炎， 傷寒，免疫力低下的兒童等人群中甚至出現(xiàn)敗血癥等癥狀。
[0003] 沙門氏菌有2000多種血清型，臨床中常見的血清型主要是腸炎沙門氏菌、鼠傷寒 沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌等。良好規(guī)范的生產(chǎn)操作過程和危害分析與關(guān)鍵點控制 (HACCP)等管理體系的應(yīng)用可以很大程度上減少食源性致病菌的發(fā)生。同時，對原料和生產(chǎn) 過程、產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)測也是保障食品生物安全的重要手段。
[0004] 目前檢測沙門氏菌的方法主要有培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測方法、分子檢測方法。傳 統(tǒng)的生化培養(yǎng)法是檢測沙門氏菌的國標(biāo)方法，盡管權(quán)威可靠，但一般需要5-10天得到結(jié) 果，且操作過程繁瑣，不能適應(yīng)快速檢測的要求；分子檢測方法是基于沙門氏菌脫氧核糖 核酸（DNA)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)建立起來的。目前發(fā)展為傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量PCR (RT-PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。與傳統(tǒng)PCR 相比，RT-PCR具有實現(xiàn)定量檢測目標(biāo)DNA、特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度 高等特點。LAMP方法具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點。LAMP技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測 范圍等方面不亞于常規(guī)PCR技術(shù)，不依賴專門的儀器設(shè)備，可以現(xiàn)場高通量快速檢測，而且 檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。然而，有文獻(xiàn)報道LAMP方法在檢測牛乳中的沙門氏菌時， 會出現(xiàn)假陰性的問題。這可能是與引物受到樣品基質(zhì)影響所引起的。同樣常規(guī)PCR和實時 PCR也面臨著檢測成本高、對操作人員技術(shù)要求較高的問題。
[0005] 免疫學(xué)檢測方法主要有酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA)、免疫層析試紙條（Immuno chromatographic test strip)。ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點成為食 源性致病菌的常規(guī)檢測方法?？贵w的親和力、交叉反應(yīng)、穩(wěn)定性對于ELISA方法的靈敏度和 特異性有著關(guān)鍵性的決定作用。雖然膠體金試紙條具有操作簡單、穩(wěn)定性高、不需要借助專 門儀器、適合現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點，但一般而言，ELISA比膠體金試紙條具有更好的靈敏度， 而且更適合高通量檢測，因此ELISA也具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用空間。
[0006] 由于沙門氏菌有2000多種血清型，一般沙門氏菌的抗體由于免疫原的限制，特異 性較強(qiáng)，因此建立的ELISA方法很難檢測到所有的沙門氏菌。本發(fā)明首次采用突變型的LPS 與載體蛋白KLH進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)合成人工抗原，制備了可以與突變型LPS以及不同血清型沙 門氏菌反應(yīng)的血清，證明該免疫原合成方法可以用來制備沙門氏菌交叉型抗體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于建立一種制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原合成方法，為實現(xiàn) 沙門氏菌屬快速檢測提供了方法和思路。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首次選用突變型沙門氏菌LPS作為 抗原，并用EDC/NHS方法合成了突變型沙門氏菌LPS與載體蛋白的人工抗原。
[0009] 第一步，抗原選擇為突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖（Ra-LPS)，突變型沙門氏菌脂 多糖（Ra-LPS)作為抗原可以避免完整型LPS的0特異性側(cè)鏈引起的免疫反應(yīng)，制備的血清 交叉反應(yīng)更強(qiáng)。
[0010] 沙門氏菌主要抗原有〇抗原、Η抗原。0抗原由0特異性側(cè)鏈、核心多糖、類脂A組 成。不同血清型的沙門氏菌0特異性側(cè)鏈不同，而核心多糖具有一定的保守性，而且也暴露 在菌體外，具有開發(fā)群選型抗體的基礎(chǔ)。一般完整型的脂多糖〇特異性側(cè)鏈較長，合成免疫 原免疫小鼠得到的血清特異性較強(qiáng)，對不同血清型的0抗原交叉較差。本發(fā)明選擇突變型 的鼠傷寒沙門氏菌脂多糖（Ra-LPS，購買于Sigma)作為抗原，可以避免0特異性側(cè)鏈引起的 免疫反應(yīng)，制備的血清交叉反應(yīng)更強(qiáng)。
[0011] 第二步，突變型和完整型LPS核心多糖的結(jié)構(gòu)類似，末端帶有3個C00H，而LPS其 它部分只帶有糖類的0H和Η鍵。利用這一點，采用EDC/NHS方法將突變型LPS的C00H與 載體蛋白的ΝΗ 2偶聯(lián)。這樣偶聯(lián)特點在于人工抗原增加了脂多糖的免疫原性，同時暴露了 沙門氏菌的共同結(jié)構(gòu)--核心多糖。
[0012] 雖然完整型脂多糖分子量在10000到15000之間，突變型脂多糖分子量也在10000 左右，但由于多糖多為重復(fù)性糖鏈結(jié)構(gòu)，免疫原性較差，是胸腺非依賴性抗原（thymus independent antigen , TI-Ag)。因此直接免疫脂多糖效價很低，制備免疫血清或者單克隆 抗體非常困難。本發(fā)明采用化學(xué)偶聯(lián)的方法用EDC和NHS將突變型脂多糖末端的C00H和 載體蛋白KLH的見1 2進(jìn)行偶聯(lián)，反應(yīng)質(zhì)量比為Ra-LPS : KLH=2 : 1。需要指出的是BSA作 為載體蛋白血清效價較低，可能因為KLH的免疫原性更強(qiáng)。
[0013] 一種用于制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原的合成方法，步驟為：取突變型鼠傷 寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS 10mg，用lmL pH為4. 6的0. 01M 2-嗎啉代乙磺酸（MES)緩沖液 溶解；稱取〇. 48mg 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和0. 29mg N-羥基 琥珀酰亞胺（NHS)，均用超純水溶解后滴加到突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS反應(yīng)溶 液中，25°C反應(yīng)8h ;然后稱取5mg鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)并溶解于2倍于MES反應(yīng)溶液體積的 0. 01M的碳酸鹽緩沖液（CB)中，此時將活化后的突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS反應(yīng) 液滴加到KLH溶液中，室溫反應(yīng)過夜，即得沙門氏菌交叉型抗體的免疫原。
[0014] 將沙門氏菌交叉型抗體的免疫原經(jīng)過免疫后得到沙門氏菌交叉型抗體或免疫血 清。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的沙門氏菌脂多糖免疫原的合成方法采用沙門氏 菌突變型LPS，并利用末端核心多糖C00H利用EDC/NHS方法合成了脂多糖人工抗原，免疫 原免疫BALB/c小鼠制備的血清對突變型LPS和完整型LPS均具有效價，同時對不同0抗原 的沙門氏菌菌體有效價。而直接免疫突變型LPS，血清對突變型LPS效價很低，直接免疫完 整型LPS和鼠傷寒沙門氏菌加熱滅活的菌體，血清僅對完整型LPS有微弱的效價，對突變型 LPS無效價。結(jié)果說明合成的突變型LPS人工抗原在制備沙門氏菌交叉型抗體方面具有明 顯的優(yōu)勢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是不同免疫原免疫血清效果對比（Ra-LPS作為包被原)。

【具體實施方式】
[0017] 實施例中所述突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS購自Sigma公司。
[0018] 以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0019] 儀器： TGL-40B臺式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KFL0W純水機(jī)，凱佛隆公司；ZD-9556 水平搖床，太倉科教器材廠；96孔8X12可拆酶標(biāo)板，廈門怡佳美實驗器材有限公司； MuLtiskaMks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司；可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems 公司； 渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠。
[0020] 試劑： 四甲基聯(lián)苯胺（TMB)，上海晶純實業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純試劑。
[0021] 步驟如下： 1、免疫原的制備： 取突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS 10mg，用lmL pH為4. 6的0. 01M MES緩沖液溶 解；稱取〇. 48mg EDC和0. 29mg NHS，均用超純水溶解后滴加到突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多 糖Ra-LPS反應(yīng)溶液中，25°C反應(yīng)8h ;然后稱取5mg KLH并溶解于2倍于MES反應(yīng)溶液體積 的0. 01M的CB液中，此時將活化后的突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS反應(yīng)液滴加到 KLH溶液中，室溫反應(yīng)過夜，即得沙門氏菌交叉型抗體的免疫原。
[0022] 2、免疫血清或抗體的制備 (1) 實驗動物：選5只，7周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫； (2) 抗原配置：將免疫原用生理鹽水稀釋，配成lmg/mL的溶液； (3) 乳化：將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全 后皮下多點注射小鼠； (4) 免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競爭法測定效價，效價達(dá)到 要求后，進(jìn)行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進(jìn)行融合； (5) 采血：第三次免疫后1周進(jìn)行斷尾采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效 價。
[0023] 3、ELISA 反應(yīng)過程： (1) 抗體效價測定步驟： 將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100 μ L/孔，于4 °C冰箱過夜。次 日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200 μ L PBST溶液，搖床上振蕩3min，用力甩掉洗滌液，在 吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方法相同； (2) 充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200 μ L/孔，于37 °C溫育箱內(nèi)溫育2 h后 取出烘干待用； (3) 將陽性血清系列稀釋對應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清，100 μ L/ 孔，37°C孵育lh后洗滌、拍干； (4) 每孔加入10(^1^，1:3000稀釋的!11^標(biāo)記的羊抗鼠186,37 1：孵育111后洗滌、拍 干； (5) 每孔加入100 μ L顯色液（TMB與底物液比例為1:5)，暗處37 °C反應(yīng)15 min，取出 后每孔加入100 μ L終止液（2 mol/L的硫酸），用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)45(l。具體結(jié)果如圖1 所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原的合成方法，其特征在于步驟為：取突 變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS 10mg，用lmL pH為4. 6的0. 01M 2-嗎啉代乙磺酸MES緩 沖液溶解；稱取〇. 48mg 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC和0. 29mg N-羥 基琥珀酰亞胺NHS，均用超純水溶解后滴加到突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS反應(yīng)溶 液中，25°C反應(yīng)8h ;然后稱取5mg鑰孔血藍(lán)蛋白KLH并溶解于2倍于MES反應(yīng)溶液體積的 0. 01M的碳酸鹽緩沖液中，此時將活化后的突變型鼠傷寒沙門氏菌脂多糖Ra-LPS反應(yīng)液滴 加到KLH溶液中，室溫反應(yīng)過夜，即得沙門氏菌交叉型抗體的免疫原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備沙門氏菌交叉型抗體的免疫原的合成方法，其特征在 于：將沙門氏菌交叉型抗體的免疫原經(jīng)過免疫后得到沙門氏菌交叉型抗體或免疫血清。
【文檔編號】C07K16/12GK104059142SQ201410314040
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】胥傳來, 王文彬, 匡華, 徐麗廣, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學(xué)