一種利于皮膚或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利于皮膚或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，采用弱酸溶液浸提鹿茸天然多肽，剩余的副產(chǎn)物采用中性蛋白酶酶解，結(jié)合超濾精制制得，獲得更高的溶解度；本發(fā)明提取的鹿茸多肽接近于人的皮膚耐受pH值，在配置產(chǎn)品時(shí)易于獲得較大的溶解度，并且本工藝提取的多肽pH值對皮膚的刺激小。采取了酸解和酶解兩步法提取鹿茸多肽，大大提高了鹿茸多肽的提取率，對原材料的利用效率更高，1000Da以下的多肽提取率由0.44%提高至2.64%，并且其副產(chǎn)物酶解制得的多肽具有生物學(xué)活性。采用分級超濾精制，制得的多肽90%為分子量低于1000Da的多肽，利于人的皮膚和粘膜的吸收。為鹿茸多肽在化妝品或在皮膚外用制劑中的應(yīng)用提供了廣泛范圍用途。
【專利說明】一種利于皮膚或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種利于皮膚或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，屬于生物技術(shù)提 取【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 鹿茸生長迅速（生長速度為1?2 cm/d)，并且具有再生特點(diǎn)，是天然的細(xì)胞生長 因子庫。隨著對鹿茸研究的深入，人們已開始重視對鹿茸中具有生物活性的多肽、蛋白質(zhì)即 生長因子的開發(fā)利用。中國專利CN 100339387C公布了采用pH3. 5酸解后40-60%乙醇浸提 多肽的工藝，獲得了 4%提取率的500 000 Da以下的提取物，但在實(shí)際應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)該提取 物在PH3. 5酸性溶液中易于溶解，卻不易溶解于中性或堿性溶液中。皮膚可承受的pH范圍 為5. 5-7. 5,而以上制備方法獲得的產(chǎn)物在此pH范圍內(nèi)多為難溶或溶解后易于產(chǎn)生沉淀， 同時(shí)，高濃度的乙醇不僅大大增加了處理體積，還引入了有機(jī)溶劑污染，增加了對皮膚的刺 激，極大的限制了該制品作為化妝品原料或應(yīng)用于皮膚外用制劑。中國專利CN 101068556 B采用水浸提鹿茸，制得了提取率為4. 42%的500-500 000 Da的水溶性提取物，雖然該技術(shù) 解決了溶解性的問題，但以上兩個(gè)專利制備的多肽中絕大部分為不易被皮膚吸收的分子量 大于1 000 Da的分子，而其中易于被皮膚吸收的1 000 Da以下的多肽僅占其中的1%以下。 2011年，廣州皇莎化妝品有限公司（申請?zhí)枺?02225967 A)提出了采用pH7. 2緩沖液粗提后 50-75%乙醇浸提的策略，文內(nèi)未提及制備的多肽分子量范圍、提取率及溶解性，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)檢 測，發(fā)現(xiàn)乙醇醇沉獲得的多肽仍然存在難穩(wěn)定溶解于中性溶劑和分子量分布廣泛等限制于 其應(yīng)用于皮膚的弊端。霍玉書（CN 1104095 A)采用pH5-9的條件浸提鹿茸多肽，超濾精制 獲得分子量5 000-50 OOODa的鹿茸生長因子，該制品溶解性好，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，但 其制品的分子量范圍卻嚴(yán)重限制了其在皮膚外用中的有效利用率。此外，專利CN 1481814A 公布了酸溶性凍干鹿茸提取物的提取方法，專利CN 1425387A公布了 pHl-3的酸解提取方 法，專利CN101554473A經(jīng)強(qiáng)電場萃取制得含IGF-1的鹿茸多肽，存在在中性溶液中溶解性 不好，有機(jī)溶劑污染等弊端。
[0003] 鹿茸多肽的酶解制品，新近才見報(bào)道，中國專利CN 102286561 A采用堿性蛋白酶 在pH9-12 65°C條件下降解6 h，之后95°C 15 min滅酶，該酶解條件劇烈，極大的損失了 不耐熱的成分。在后續(xù)的精制中，將該制品溶解于PH2-5的溶液中，強(qiáng)酸性陽離子交換樹 脂浸泡18-20 h，溶劑pH的反差巨大，損失了大部分鹿茸多肽的酶解產(chǎn)物。中國專利CN 103169942 A公布了一種制備鹿茸膠原蛋白的酶解方法，pH6-8,20-35°C條件下，采用復(fù)合 生物催化劑水解獲得了澄清金黃色鹿茸水解液，但未進(jìn)行制品的超濾精制，制品中仍存留 有未水解充分的大分子物質(zhì)，嚴(yán)重影響了其透皮吸收的有效利用。
[0004] 以上等專利技術(shù)所用的方法均為一次性提取，未能充分利用原料，剩余原料殘?jiān)?中仍然含有大量多肽類生長因子，造成資源的極度浪費(fèi)。關(guān)于鹿茸活性成分的系列提取，僅 見專利CN 1771993 A，采用的是超臨界0)2萃取鹿茸中脂溶性成分，該技術(shù)重點(diǎn)解決的是鹿 茸蛋白質(zhì)和肽類以外的活性成分的制備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開一種利于皮膚或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，采用弱酸溶液浸 提鹿茸多肽，鹿茸粉碎的殘?jiān)八崽崛《嚯牡娜扛碑a(chǎn)物利用中性蛋白酶酶解，分級超濾 制備分子量低于1 〇〇〇 Da的酸解多肽和酶解多肽，制品有利于皮膚或粘膜的吸收，并避免 了殘留的強(qiáng)酸或醇對皮膚的刺激。
[0006] 本發(fā)明所述的一種利于皮膚或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，其技術(shù)解決方 案如下： 1) 材料預(yù)處理： 新鮮或冰鮮鹿茸稱重、切片； 2) 提?。?加入預(yù)冷的ΚΓ30倍體積pH 4. 2~4. 8的醋酸一醋酸鈉水溶液，置于4 °C環(huán)境下攪拌提 取4~8h，10(Tl 000目濾布粗濾，取上清液即為酸解多肽粗提取液，濾渣用于后續(xù)的酶解提 ??； 3) 將步驟2)制得的酸解多肽粗提取液分級超濾精制：1 μ m濾膜粗濾(濃縮液用于后 續(xù)的酶解提取)，濾液經(jīng)10 〇〇〇Da濾膜超濾(濃縮液用于后續(xù)的酶解提取)，濾液進(jìn)行300 Da 納濾濃縮； 4) 合并步驟2)的濾渣，步驟3的1 μ m濾膜和10 OOODa濾膜超濾濃縮液，測得體積和 濃度，計(jì)算質(zhì)量； 5) 加入2倍體積的蒸餾水，攪拌均勻，用1 Μ的NaOH溶液調(diào)pH至5. 5-7. 5,加入中性 蛋白酶（ΚΚΚΓ2000) M/g，在水浴溫度45-65°C下酶解提取2-4 h ; 6) 濾布粗濾后，步驟5)制得的酶解多肽提取液分級超濾精制：1 μπι濾膜粗濾，透過液 經(jīng)10 OOODa濾膜超濾，透過液進(jìn)行300Da濾膜納濾濃縮，取濃縮液即為酶解多肽提取液； 7) 酸解多肽和酶解多肽的納濾濃縮液加2-4%甘氨酸冷凍干燥（-45 °C預(yù)凍1 h，-80 °C，4.5 Pa冷凍干燥約12~24 h至成粉末狀)，得酸解多肽和酶解多肽。
[0007] 鹿茸中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)或多肽是與結(jié)合蛋白或受體結(jié)合的方式存在于體內(nèi)的， 已知解離蛋白質(zhì)和其partner的方法有酸性凝膠層析和酸醇抽提法，可以去除85-90%的 結(jié)合蛋白。傳統(tǒng)的提取技術(shù)一般采用pH 1.0-3. 5的強(qiáng)酸進(jìn)行蛋白質(zhì)和其partner的解離， 本發(fā)明采用弱酸溶液進(jìn)行解離，在獲得理想的提取效率的同時(shí)，有效的解決了制品在中性 溶液中的溶解度低問題。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽制品往往能夠較好的溶解于提取的pH值 或其臨近pH條件下，在其他的pH值條件下，即使暫時(shí)溶解也會出現(xiàn)久置后出現(xiàn)沉淀的現(xiàn) 象，成為制約鹿茸多肽制品產(chǎn)品質(zhì)量和皮膚外用的一個(gè)嚴(yán)重限制因素。采用PH4. 2以上的 弱酸解離與partner結(jié)合著的鹿茸多肽，適當(dāng)延長解離時(shí)間，既可以有效制得鹿茸多肽，又 使得制品在皮膚耐受pH (5. 5-7. 5)條件下獲得良好的溶解度，同時(shí)，會避免酸解過度而破 壞最重要的天然多肽的活性；醋酸-醋酸鈉溶液無毒無副，易揮發(fā)去除；沒有采用酸醇抽提 法，避免了有機(jī)溶劑的污染，減少了處理體積和凍干之前除醇的步驟。
[0008] 在生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，超濾的透過液分子量范圍一般為濾膜提示分子量的1/3或 以下，皮膚吸收物質(zhì)的分子量范圍一般為1000 Da以下；本發(fā)明采用選用10 OOODa的濾膜 超濾，在濾過液中可以有效收集分子量低于1000 Da的天然肽類因子，又去除了制品中分子 量較大的成分，使得制品的分子量較小，易于皮膚和粘膜的吸收，有效提高多肽的利用率。
[0009] 中性蛋白酶消化蛋白質(zhì)的原理為切斷蛋白質(zhì)內(nèi)部肽鍵，可以有效的將大分子蛋白 水解為肽。此外，該酶反應(yīng)條件溫和，一般在PH5. 5-7. 5范圍內(nèi)可以有效水解，使得制備的 多肽易于溶解于中性溶劑也是選用該酶的重要原因。
[0010] 本發(fā)明的積極效果在于： 采用弱酸溶液浸提鹿茸天然多肽，剩余的副產(chǎn)物采用中性蛋白酶酶解，結(jié)合超濾精制 制得，獲得在中性pH溶液中更高的溶解度；本發(fā)明提取的鹿茸多肽采用的pH值接近于人的 皮膚耐受pH值，在配置產(chǎn)品時(shí)易于獲得較大的溶解度，并且本工藝提取的多肽對皮膚的刺 激小。采取了酸解和酶解兩步法提取鹿茸多肽，大大提高了鹿茸多肽的提取率，對原材料的 利用效率更高，1 〇〇〇Da以下的多肽制得率由0. 44%提高至2. 64%，并且其副產(chǎn)物酶解制得 的多肽具有生物學(xué)活性。采用分級超濾精制，制得的酸解多肽99. 1%以上為分子量低于1 OOODa的多肽，而酶解多肽88. 03%以上為分子量低于1 OOODa的多肽，利于皮膚和粘膜的吸 收。為鹿茸多肽在化妝品或在皮膚外用制劑中的應(yīng)用提供了廣泛范圍用途。
[0011] 本發(fā)明制備工藝簡便，分別制得酸解多肽和酶解多肽，提高了鹿茸多肽提取率的 同時(shí)有效的解決了鹿茸多肽在中性pH溶劑中難溶解的問題，避免了殘留的強(qiáng)酸或醇對皮 膚的刺激。對儀器設(shè)備要求低，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為MTS法檢測鹿茸酸解多肽作用于HaCaT細(xì)胞并且促進(jìn)細(xì)胞增殖柱形圖； 圖2為流式細(xì)胞技術(shù)檢測鹿茸酸解多肽作用于HaCaT細(xì)胞并抑制細(xì)胞凋亡柱形圖； 圖3為MTS法檢測鹿茸酶解多肽作用于HaCaT細(xì)胞并且促進(jìn)細(xì)胞增殖柱形圖； 圖4為流式細(xì)胞技術(shù)檢測鹿茸酶解多肽作用于HaCaT細(xì)胞并抑制細(xì)胞凋亡柱形圖； 圖5為鹿茸酶解多肽對于增強(qiáng)HaCaT細(xì)胞CAT活力的作用； 圖6為鹿茸酶解多肽對于提高HaCaT細(xì)胞hyp含量的作用； 圖7為鹿茸酶解多肽標(biāo)準(zhǔn)品； 圖8為本發(fā)明鹿茸酸解多肽分子量范圍； 圖9為本發(fā)明鹿茸酶解多肽分子量范圍。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改 動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0014] 實(shí)施例1 購置冰鮮鹿茸，將鹿茸切片，粉碎后稱重，共l〇89g，加入20倍的預(yù)冷的pH4. 2的醋 酸-醋酸鈉緩沖液，制成勻漿，置于4 °C環(huán)境下用增速攪拌器勻速攪拌提取4 h，500目濾布 過濾(收集此步濾渣用于后續(xù)的酶解提取)，濾出液分級超濾精制：1 μπι濾膜粗濾(收集此 步濃縮液用于后續(xù)的酶解提取)，濾液經(jīng)10 〇〇〇Da濾膜超濾(收集此步濃縮液用于后續(xù)的酶 解提取)，濾液進(jìn)行300 Da納濾濃縮至1 000 mL。納濾濃縮液加4%凍干保護(hù)劑（40 g)冷 凍干燥（-45 °C預(yù)凍1 h，-80 °C，4. 5 Pa冷凍干燥約12 h至成粉末狀)，至此制得酸解多肽 凍干粉末2. 7 g，酸解多肽得率為0. 24%。
[0015] 合并以上步驟的濾布濾渣，1 μ m濾膜和10 OOODa濾膜超濾濃縮液，測得體積和 濃度，計(jì)算質(zhì)量為440 g，加入2倍體積的蒸餾水，攪拌均勻，用1 Μ的NaOH溶液調(diào)pH至 6. 5,加入中性蛋白酶1 000 M/g，在水浴溫度65°C下酶解提取2 h。濾布粗濾后，分級超 濾精制：1 μ m濾膜粗濾，濾液經(jīng)10 OOODa濾膜超濾，透過液進(jìn)行300 Da納濾濃縮至1 000 mL，取濃縮液即為酶解多肽提取液。加4%甘氨酸（40 g)作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥（-45 °C 預(yù)凍1 h，-80 °C，4. 5 Pa冷凍干燥約12 h至成粉末狀)，至此制得酶解多肽凍干粉27 g， 酶解多肽得率為2. 4%。
[0016] 實(shí)施例2 購置冰鮮鹿茸，將鹿茸切片，粉碎后稱重，共l〇13g，加入20倍的預(yù)冷的pH4. 6的醋 酸-醋酸鈉緩沖液，制成勻漿，置于4 °C環(huán)境下用增速攪拌器勻速攪拌提取6h，100目濾布 過濾(收集此步濾渣用于后續(xù)的酶解提取)，濾出液分級超濾精制：1 μπι濾膜粗濾(收集此 步濃縮液用于后續(xù)的酶解提取)，濾液經(jīng)10 〇〇〇Da濾膜超濾(收集此步濃縮液用于后續(xù)的酶 解提取)，濾液進(jìn)行300 Da納濾濃縮至1 000 mL。納濾濃縮液加4%凍干保護(hù)劑（40 g)冷 凍干燥（-45 °C預(yù)凍1 h，-80 °C，4. 5 Pa冷凍干燥約12 h至成粉末狀)，至此制得酸解多肽 凍干粉末2. 9 g，酸解多肽得率為0. 28%。
[0017] 合并以上步驟的濾布濾渣，1 μ m濾膜和10 OOODa濾膜超濾濃縮液，測得體積和 濃度，計(jì)算質(zhì)量為510 g，加入2倍體積的蒸餾水，攪拌均勻，用1 Μ的NaOH溶液調(diào)pH至 6. 5,加入中性蛋白酶1500 M/g，在水浴溫度55°C下酶解提取3h。濾布粗濾后，分級超濾 精制：1 μ m濾膜粗濾，濾液經(jīng)10 OOODa濾膜超濾，濾液進(jìn)行300Da納濾濃縮至1 000 mL， 取濃縮液即為酶解多肽提取液。加 4%甘氨酸（40 g)作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥（-45 °C預(yù) 凍1 h，-80 °C，4. 5 Pa冷凍干燥約12 h至成粉末狀)，至此制得酶解多肽凍干粉22 g，酶 解多肽得率為2. 1%。
[0018] 實(shí)施例3 購置新鮮鹿茸，將鹿茸切片，粉碎后稱重，共998 g，加入30倍的預(yù)冷的pH4. 8的醋 酸-醋酸鈉緩沖液，制成勻漿，置于4 °C環(huán)境下用增速攪拌器勻速攪拌提取8 h，1000目濾 布過濾(收集此步濾渣用于后續(xù)的酶解提取)，濾出液濾布粗濾，分級超濾精制：1 μπι濾膜 粗濾(收集此步濃縮液用于后續(xù)的酶解提取)，濾液經(jīng)10 〇〇〇Da濾膜超濾(收集此步濃縮液 用于后續(xù)的酶解提取)，透過液進(jìn)行300 Da納濾濃縮至1000 mL。納濾濃縮液加4%凍干保 護(hù)劑（40 g)冷凍干燥（-45 °C預(yù)凍1 h，-80 °C，4. 5 Pa冷凍干燥約12 h至成粉末狀)，至 此制得酸解多肽凍干粉末3. lg，酸解多肽得率為0. 31%。
[0019] 合并以上步驟的濾布濾渣，1 μ m濾膜和10 OOODa濾膜超濾濃縮液，測得體積和 濃度，計(jì)算質(zhì)量為497 g，加入2倍體積的蒸餾水，攪拌均勻，用1 Μ的NaOH溶液調(diào)pH至 6. 5,加入中性蛋白酶2000 M/g，在水浴溫度45°C下酶解提取2 h。濾布粗濾后，分級超濾 精制：1 μ m濾膜粗濾，濾液經(jīng)10 OOODa濾膜超濾，濾液進(jìn)行300Da納濾濃縮至1000 mL，取 濃縮液即為酶解多肽提取液。加4%甘氨酸（40 g)作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥（-45 °C預(yù)凍 1 h，-80 °C，4. 5 Pa冷凍干燥約12 h至成粉末狀)，至此制得酶解多肽凍干粉20 g，酶解多 肽得率為2. 0%。
[0020] 通過以下實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明提取的鹿茸酸解多肽及酶解多肽的體外活性 試驗(yàn)例1 鹿茸酸解多肽和酶解多肽制品分子量分布范圍見圖7和表1，分子量低于lOOODa的多 肽分別占99. 1%和88. 03%以上。
[0021] 表1鹿茸酸解多肽和酶解多肽制品分子量分布范圍

【權(quán)利要求】
1. 一種利于皮膚或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，包括以下步驟： 1) 材料預(yù)處理： 新鮮或冰鮮鹿茸稱重、切片； 2) 提取： 加入預(yù)冷的ΚΓ30倍體積pH 4. 2~4. 8的醋酸一醋酸鈉水溶液，置于4°C環(huán)境下攪拌提 取4~8h，10(Tl 000目濾布粗濾，取上清液即為酸解多肽粗提取液，濾渣用于后續(xù)的酶解提 ??； 3) 步驟2)制得的酸解多肽粗提取液分級超濾精制：1 μ m濾膜粗濾(濃縮液用于后續(xù) 的酶解提取)，濾液經(jīng)10 〇〇〇Da濾膜超濾(濃縮液用于后續(xù)的酶解提取)，濾液采用截留分子 量300 Da的納濾膜納濾濃縮； 4) 合并步驟2)的濾渣，步驟3)的1 μ m濾膜和10 OOODa濾膜超濾濃縮液，測得體積 和濃度，計(jì)算質(zhì)量； 5) 加入2倍體積的蒸餾水，攪拌均勻，用1 Μ的NaOH溶液調(diào)pH至5. 5-7. 5,加入中性 蛋白酶（1 00(T2 000)M/g，在水浴溫度45-65°C下酶解提取2-4 h; 6) 濾布粗濾后，步驟5)制得的酶解多肽提取液分級超濾精制：1 μπι濾膜粗濾，濾液經(jīng) 10 OOODa濾膜超濾，濾液進(jìn)行300Da濾膜納濾濃縮，取濃縮液即為酶解多肽提取液； 7) 將步驟3)制備的酸解多肽和步驟6)制備的酶解多肽的納濾濃縮液加2-4%甘氨酸 冷凍干燥，得酸解多肽和酶解多肽。
【文檔編號】C07K1/34GK104087640SQ201410323399
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】郝林琳, 李思明, 劉松財(cái), 陸超, 焦安龍, 張鑫, 丁克祥 申請人:吉林大學(xué)