卡貝縮宮素和制法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種縮宮素類似物，特別是涉及一種卡貝縮宮素，更特別地涉及一種具有優(yōu)良制藥性能的卡貝縮宮素原料藥。本發(fā)明卡貝縮宮素其可用于選擇性硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后，以預(yù)防子宮收縮乏力和產(chǎn)后出血。本發(fā)明還涉及卡貝縮宮素的制備方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及使用卡貝縮宮素為原料藥的制備得到的藥物組合物特別是注射液。本發(fā)明可作為藥用原料藥的卡貝縮宮素，其醋酸含量不超過(guò)5.0％，含水分不超過(guò)6.0％，含C45H69N11O12S為95.0％～105.0％。
【專利說(shuō)明】卡貝縮宮素和制法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種縮宮素類似物，特別是涉及一種卡貝縮宮素， 更特別地涉及一種具有優(yōu)良制藥性能的卡貝縮宮素原料藥。本發(fā)明卡貝縮宮素其可用于選 擇性硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后，以預(yù)防子宮收縮乏力和產(chǎn)后出血。本發(fā)明還涉及卡貝縮 宮素的制備方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及使用卡貝縮宮素為原料藥的制備得到的藥物組 合物特別是注射液。

【背景技術(shù)】
[0002] 卡貝縮宮素（Carbetocin)，分子式 C45H69N11012S，分子量 988. 16, CAS 登記號(hào) 37025-55-1，化學(xué)名稱：去氨-2-氧-甲基酪氨酸-1-κ縮宮素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式：
[0003]

【權(quán)利要求】
1. 作為藥用原料藥的卡貝縮宮素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的卡貝縮宮素，其特征在于以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)： (1) 其照【醋酸含量測(cè)定】法測(cè)定，其中醋酸含量不超過(guò)5.0% ; (2) 其照【水分測(cè)定】法測(cè)定，其中含水分不超過(guò)6. 0%，例如不超過(guò)5. 0%，例如不超過(guò) 4. 5% ； ⑶其照【含量測(cè)定：!法測(cè)定，其以無(wú)水與無(wú)醋酸物計(jì)算，含C45H69N11012S為95. 0%? 105. 0%，例如為97?103%，例如為98?102% ; (4) 其照【有關(guān)物質(zhì)檢查法】法測(cè)定，按雜質(zhì)峰面積與主峰峰面積之比所得的百分?jǐn)?shù)表 示，計(jì)算雜質(zhì)的含量，其中[D-Cys6]-卡貝縮宮素小于1.0%、[D-Asn 5]-卡貝縮宮素小于 1. 0%、[Gly90H]_卡貝縮宮素小于1. 0%、卡貝縮宮素亞砜I小于0. 3%、和/或卡貝縮宮 素亞砜II小于0. 4% ; (5) 其照【有關(guān)物質(zhì)檢查法】法測(cè)定，按雜質(zhì)峰面積與主峰峰面積之比所得的百分?jǐn)?shù)表 示，計(jì)算雜質(zhì)的含量，其中[D-Cys6]-卡貝縮宮素小于0.8%、[D-Ssn 5]-卡貝縮宮素小于 0. 8%、[Gly90H]_卡貝縮宮素小于0. 8%、卡貝縮宮素亞砜I小于0. 25%、和/或卡貝縮宮 素亞諷II小于0. 35% ; (6) 其照【有關(guān)物質(zhì)檢查法】法測(cè)定，按雜質(zhì)峰面積與主峰峰面積之比所得的百分?jǐn)?shù)表 示，計(jì)算雜質(zhì)的含量，其中[D-Cys6]-卡貝縮宮素小于0.5%、[D-Ssn 5]-卡貝縮宮素小于 0. 5%、[Gly90H]_卡貝縮宮素小于0. 5%、卡貝縮宮素亞砜I小于0. 2%、和/或卡貝縮宮 素亞砜II小于0. 3%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2的卡貝縮宮素，其是通過(guò)包括以下步驟的方法制備得到的： 1) 以氨基樹(shù)脂為載體，脫保護(hù)； 2) 通過(guò)縮合反應(yīng)將Fmoc-Gly-OH的羧基與樹(shù)脂的氨基相連，得到Fmoc-Gly-氨基樹(shù) 脂； 3) 照步驟1)和2)的方式，通過(guò)脫保護(hù)反應(yīng)和縮合反應(yīng)依次依序列固相合成剩余保護(hù) 氨基酸； 4) 脫除半胱氨酸的側(cè)鏈保護(hù)基； 5) 在半胱氨酸的巰基上接入溴丁酸； 6) 去末端氨基Fmoc保護(hù)； 7) 進(jìn)行固相環(huán)化； 8) 切割，得到卡貝縮宮素粗肽； 9) 通過(guò)制備型HPLC純化得到卡貝縮宮素純品；和任選的 10) 對(duì)所得卡貝縮宮素純品轉(zhuǎn)化成醋酸鹽以及進(jìn)一步地冷凍干燥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的卡貝縮宮素，其特征在于以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)： (1) 步驟1)中的氨基樹(shù)脂為Rink Amiide MBHA樹(shù)脂； (2) 步驟1)中的氨基樹(shù)脂為Rink Amiide MBHA樹(shù)脂，樹(shù)脂替代度為0. 8?1. 2mmol/ g ; (3) 步驟 3)中保護(hù)氨基酸分別是 Fmoc-Gly，F(xiàn)moc-Leu，F(xiàn)moc-Pro，F(xiàn)moc-cys(Trt), Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Tyr (Me),4-Br-butyric acid ； (4) 步驟1)和3)中縮合試劑為TBTU/HOBt/DIEA ; (5) 步驟1)和3)中保護(hù)氨基酸以及縮合試劑的投料量是樹(shù)脂的2?5倍當(dāng)量； (6) 其接氨基酸過(guò)程中的每一步都經(jīng)Kaiser Test，顏色呈陰性則依次接保護(hù)氨基酸； (7) 其脫除半胱氨酸側(cè)鏈保護(hù)基的試劑是1% TFA/DCM ; (8) 步驟5)中，溴丁酸是在DIEA/DMF作用下、與半胱氨酸的疏基反應(yīng)； (9) 其中所述方法中，步驟5)中，其環(huán)化試劑是TCTU/DIEA，溶劑為DMF; (10) 步驟5)中，裂解試劑是按TFA:十二烷基硫醇：水：甲酸=95 : (0.5? 2.5) : (0.5?2.5) : (0.5?2. 5)的體積比配制而成； (11) 步驟9)中，純化所用的制備型HPLC的純化條件為： 流動(dòng)相A :0.2 %醋酸水溶液， 流動(dòng)相B :0. 2 %醋酸甲醇溶液， 流動(dòng)相C:1M醋酸氨溶液； 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18)柱，5 μ m，50 X 250mm; 進(jìn)樣量:6L ; 流速：l〇〇ml/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm ; 梯度：
(12) 步驟10)中，使前一步驟所得樣品溶液通過(guò)脫鹽柱，使用流動(dòng)相0.2%醋酸水溶 液，收集最后主峰；將經(jīng)脫鹽柱收集到的樣品溶液放入凍干機(jī)中，低溫（_60°C )結(jié)冰，凍實(shí)； 在真空下控制溫度上升至_8°C，水線消失后將溫度緩慢拉升至60°C凍干24小時(shí)，即得的可 作為藥用原料藥的貝卡縮宮素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的卡貝縮宮素，其是通過(guò)包括以下步驟的方法制備得到的： 步驟1 :制備Fmoc-Gly-樹(shù)脂 將100. 00g的Fmoc-Rink Amide MBHA resin加入到玻璃反應(yīng)柱中，該樹(shù)脂的替代 度為1. Ommol/g ;加入500ml的DMF溶脹，然后加入DCM的500ml/次洗滌3次，再加入 DMF500ml/次洗滌3次；向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反 應(yīng)30min，抽除反應(yīng)液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；保護(hù)氨基酸以及縮合試劑的投料量為3倍當(dāng)量，稱 取 Fmoc-Gly-0H89. 19g 及 TBTU96. 32g、H0Bt40. 54g、DIEA38. 77g，加入 DMF 攪拌溶解，攪拌 均勻后加入到玻璃反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)24小時(shí)；KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成； 反應(yīng)完畢后，抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌3次，再用DCM500ml/次洗滌3次，抽干，倒 出，放入真空干燥箱干燥12小時(shí)； 步驟2 :制備Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂 將104. 4g的Fmoc-Gly-樹(shù)脂加入到玻璃反應(yīng)柱中，加入DCM500ml/次洗滌3次，再加入 DMF500ml/次洗滌3次；向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng) 30min，抽除反應(yīng)液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)做檢測(cè)，顯藍(lán) 色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Leu-0H94. 00g及TBTU85. 41g、H0Bt35. 94g、 DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入到反應(yīng)柱內(nèi)， 攪拌反應(yīng)3小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽去 反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 3 :制備 Fmoc-Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30mm，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯藍(lán) 色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Pr〇-0H89. 75g及TBTU85. 41g、H0Bt35. 94g、 DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入到反應(yīng)柱內(nèi)， 攪拌反應(yīng)3小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽去反 應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 4 :制備 Fmoc-Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱收Fmoc-Cys(Trt)-0H155. 80g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)5小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng) 完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 5 :制備 Fmoc-Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Asn (Trt)) -0H158. 72g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)5小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反 應(yīng)完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 6 :制備 Fmoc-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Gln(Trt)-0H162. 45g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)6小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反 應(yīng)完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 7 :制備 Fmoc-Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯藍(lán) 色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Ile-0H97. 73g及TBTU85. 41g、H0Bt35. 94g、 DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入到反應(yīng)柱內(nèi)， 攪拌反應(yīng)3. 5小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽 去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 8 :制備 Fmoc-Tyr (Me) -Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反 應(yīng)液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)， 顯藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Tyr (Me)-OHlll. 06g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)4小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng) 完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 9 :制備 Fmoc-Tyr (Me) -Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys-Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的1% TFA/DCM溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng)液， 加入DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 10 :制備 Fmoc-Tyr (Me) -Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (CH2CH2CH2C00H) -Pro-Leu -Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入溴丁酸44. 42g及DIEA34. 38g，加入500mlDMF攪拌溶解，反應(yīng)30 分鐘；取樣，用DMF洗滌6次，用Ellman反應(yīng)監(jiān)測(cè)巰基反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽去反應(yīng) 液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 11 :制備 H-Tyr (Me) -Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (CH2CH2CH2C00H) -Pro-Leu-Gl y_樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次； 步驟12 :環(huán)化 稱取TCTU94. 57g及DIEA34. 38g加入1100ml中攪拌溶解，完全溶解后加入到反應(yīng)柱 內(nèi)，氮?dú)獯禂嚪磻?yīng)90min ;反應(yīng)完畢后，取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度， 直至反應(yīng)完成；抽去反應(yīng)液，用DMFllOOml/次洗滌3次，再用DCMllOOml/次洗滌3次，抽 干，倒出； 步驟13 :裂解 將環(huán)化后的樹(shù)脂加入到圓底燒瓶中，加入配制好的裂解試劑（TFA :十二烷基硫醇：水： 甲酸=95 :2 :1 :2)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 :1 :2 :2)、 或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 :2 :2 :1)、或者裂解試劑（裂 解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 5 :2. 5 :2)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA : 十二烷基硫醇：水：甲酸=95 :2. 5 5 :2)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇： 水：甲酸=95 :2. 5 :2 :0. 5)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 : 1. 5 :1 :2. 5) 2200ml，攪拌反應(yīng)120min ;過(guò)濾，樹(shù)脂用TFA洗滌3次；合并濾液，緩慢沉降至IJ 20000ml的無(wú)水乙醚中；靜置2h后開(kāi)始離心，離心完畢后用冰無(wú)水乙醚2200ml/次離心洗 滌6次，將得到的粗肽放入冰箱過(guò)夜，冷凍干燥，即得卡貝縮宮素粗品； 步驟14 :純化 使用制備型HPLC法進(jìn)行純化，純化條件為： 流動(dòng)相A :0.2 %醋酸水溶液， 流動(dòng)相B :0. 2 %醋酸甲醇溶液， 流動(dòng)相C:1M醋酸氨溶液； 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18)柱，5 μ m，50 X 250mm; 進(jìn)樣量:6L ; 流速：l〇〇ml/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm ; 梯度：
將得到的粗肽餾分減壓干燥后加水30000ml溶解，溶液用0. 45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾；濾 液按照純化條件上樣，收集目的峰溶液，并將收集的溶液濃縮； 步驟15 :轉(zhuǎn)鹽和凍干 將步驟14得到的樣品溶液通過(guò)脫鹽柱，使用流動(dòng)相0. 2%醋酸水溶液，收集最后主峰； 將上述經(jīng)脫鹽柱收集到的樣品溶液放入凍干機(jī)中，低溫（_60°C )結(jié)冰，凍實(shí)；在真空下 控制溫度上升至_8°C，水線消失后將溫度緩慢拉升至60°C凍干24小時(shí)，即得可作為藥用原 料藥的貝卡縮宮素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3至5的卡貝縮宮素，其中所述方法中，所述Kaiser Test檢測(cè)的測(cè)定 方法如下： 試劑的配制：（l)lg茚三酮溶于20ml無(wú)水乙醇，（2)3.2g苯酚溶于4ml無(wú)水乙醇， (3)0. 4ml KCN 儲(chǔ)液（0· 01M KCN)溶于 19. 6ml 吡啶； 檢測(cè)方法：在待檢測(cè)的樹(shù)脂中將上述三種試劑按1 :1 :1比例依次各滴加2滴，通過(guò)顏 色觀察來(lái)判斷反應(yīng)是否完全，此法靈敏度達(dá)到99%以上；若溶液及樹(shù)脂為黃色，則表明樹(shù) 脂上無(wú)殘留一 NH2 ;若溶液及樹(shù)脂為紫色、淡藍(lán)色或藍(lán)色，則表明樹(shù)脂上仍有殘留的一 NH2， 顏色越深，表明殘留的一 NH2越多，肽的耦聯(lián)反應(yīng)越不完全，需延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。
7. 制備卡貝縮宮素的方法，其包括以下步驟： 1) 以氨基樹(shù)脂為載體，脫保護(hù)； 2) 通過(guò)縮合反應(yīng)將Fmoc-Gly-OH的羧基與樹(shù)脂的氨基相連，得到Fmoc-Gly-氨基樹(shù) 脂； 3) 照步驟1)和2)的方式，通過(guò)脫保護(hù)反應(yīng)和縮合反應(yīng)依次依序列固相合成剩余保護(hù) 氨基酸； 4) 脫除半胱氨酸的側(cè)鏈保護(hù)基； 5) 在半胱氨酸的巰基上接入溴丁酸； 6) 去末端氨基Fmoc保護(hù)； 7) 進(jìn)行固相環(huán)化； 8) 切割，得到卡貝縮宮素粗肽； 9) 通過(guò)制備型HPLC純化得到卡貝縮宮素純品；和任選的 10) 對(duì)所得卡貝縮宮素純品轉(zhuǎn)化成醋酸鹽以及進(jìn)一步地冷凍干燥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)： (1) 步驟1)中的氨基樹(shù)脂為Rink Amiide MBHA樹(shù)脂； (2) 步驟1)中的氨基樹(shù)脂為Rink Amiide MBHA樹(shù)脂，樹(shù)脂替代度為0. 8?1. 2mmol/ g ; (3) 步驟 3)中保護(hù)氨基酸分別是 Fmoc-Gly，F(xiàn)moc-Leu，F(xiàn)moc-Pro，F(xiàn)moc-cys(Trt), Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Tyr (Me),4-Br-butyric acid ； (4) 步驟1)和3)中縮合試劑為TBTU/HOBt/DIEA ; (5) 步驟1)和3)中保護(hù)氨基酸以及縮合試劑的投料量是樹(shù)脂的2?5倍當(dāng)量； (6) 其接氨基酸過(guò)程中的每一步都經(jīng)Kaiser Test,顏色呈陰性則依次接保護(hù)氨基酸； (7) 其脫除半胱氨酸側(cè)鏈保護(hù)基的試劑是1% TFA/DCM ; (8) 步驟5)中，溴丁酸是在DIEA/DMF作用下、與半胱氨酸的疏基反應(yīng)； (9) 步驟5)中，其環(huán)化試劑是TCTU/DIEA，溶劑為DMF ; (10) 步驟5)中，裂解試劑是按TFA:十二烷基硫醇：水：甲酸=95 : (0.5? 2.5) : (0.5?2.5) : (0.5?2.5)的體積比配制而成； (11) 步驟9)中，純化所用的制備型HPLC的純化條件為： 流動(dòng)相A :0.2 %醋酸水溶液， 流動(dòng)相B :0. 2 %醋酸甲醇溶液， 流動(dòng)相C:1M醋酸氨溶液； 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18)柱，5 μ m，50 X 250mm; 進(jìn)樣量:6L ; 流速：l〇〇ml/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm ; 梯度：
(12) 步驟10)中，使前一步驟所得樣品溶液通過(guò)脫鹽柱，使用流動(dòng)相0.2%醋酸水溶 液，收集最后主峰；將經(jīng)脫鹽柱收集到的樣品溶液放入凍干機(jī)中，低溫（_60°C )結(jié)冰，凍實(shí)； 在真空下控制溫度上升至_8°C，水線消失后將溫度緩慢拉升至60°C凍干24小時(shí)，即得的可 作為藥用原料藥的貝卡縮宮素。
9.根據(jù)權(quán)利要求7-8的方法，其是由包括以下步驟的方法制備得到的： 步驟1 :制備Fmoc-Gly-樹(shù)脂 將100. 00g的Fmoc-Rink Amide MBHA resin加入到玻璃反應(yīng)柱中，該樹(shù)脂的替代 度為1. Ommol/g ;加入500ml的DMF溶脹，然后加入DCM的500ml/次洗滌3次，再加入 DMF500ml/次洗滌3次；向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反 應(yīng)30min，抽除反應(yīng)液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；保護(hù)氨基酸以及縮合試劑的投料量為3倍當(dāng)量，稱 取 Fmoc-Gly-0H89. 19g 及 TBTU96. 32g、H0Bt40. 54g、DIEA38. 77g，加入 DMF 攪拌溶解，攪拌 均勻后加入到玻璃反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)24小時(shí)；KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成； 反應(yīng)完畢后，抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌3次，再用DCM500ml/次洗滌3次，抽干，倒 出，放入真空干燥箱干燥12小時(shí)； 步驟2 :制備Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂 將104. 4g的Fmoc-Gly-樹(shù)脂加入到玻璃反應(yīng)柱中，加入DCM500ml/次洗滌3次，再加入 DMF500ml/次洗滌3次；向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng) 30min，抽除反應(yīng)液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)做檢測(cè)，顯藍(lán) 色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Leu-0H94. 00g及TBTU85. 41g、H0Bt35. 94g、 DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入到反應(yīng)柱內(nèi)， 攪拌反應(yīng)3小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽去 反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 3 :制備 Fmoc-Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30mm，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯藍(lán) 色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Pr〇-0H89. 75g及TBTU85. 41g、H0Bt35. 94g、 DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入到反應(yīng)柱內(nèi)， 攪拌反應(yīng)3小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽去反 應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 4 :制備 Fmoc-Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱收Fmoc-Cys (Trt)-0H155. 80g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)5小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng) 完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 5 :制備 Fmoc-Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Asn (Trt))-0H158. 72g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)5小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反 應(yīng)完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 6 :制備 Fmoc-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯 藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Gln (Trt)-0H162. 45g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)6小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反 應(yīng)完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 7 :制備 Fmoc-Ile-Gln (Trt)-Asn (Trt)-Cys (Trt)-Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)，顯藍(lán) 色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Ile-0H97. 73g及TBTU85. 41g、H0Bt35. 94g、 DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入到反應(yīng)柱內(nèi)， 攪拌反應(yīng)3. 5小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽 去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 8 :制備 Fmoc-Tyr (Me) -Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50 %哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反 應(yīng)液，加入DMF500ml/次洗滌6次；取少量樹(shù)脂利用茚三酮反應(yīng)（Kaiser Test)做檢測(cè)， 顯藍(lán)色；若不顯藍(lán)色，則需重新進(jìn)行此步；稱取Fmoc-Tyr(Me)-〇Hlll. 06g及TBTU85. 41g、 H0Bt35. 94g、DIEA34. 38g，加入DMF攪拌溶解；完全溶解后，將配制好的氨基酸偶聯(lián)液加入 到反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)4小時(shí)；取樣，用DMF洗滌6次，KaiserTest監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度，直至反應(yīng) 完成；抽去反應(yīng)液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 9 :制備 Fmoc-Tyr (Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys-P;r〇-Leu-Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的1% TFA/DCM溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng)液， 加入DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 10 :制備 Fmoc-Tyr (Me) -Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (CH2CH2CH2C00H) -Pro-Leu -Gly-樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入溴丁酸44. 42g及DIEA34. 38g，加入500mlDMF攪拌溶解，反應(yīng)30 分鐘；取樣，用DMF洗滌6次，用Ellman反應(yīng)監(jiān)測(cè)巰基反應(yīng)程度，直至反應(yīng)完成；抽去反應(yīng) 液，用DMF500ml/次洗滌6次； 步驟 11 :制備 H-Tyr (Me) -Ile-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (CH2CH2CH2C00H) -Pro-Leu-Gl y_樹(shù)脂 向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的50%哌啶/DMF溶液500ml，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng) 液，加入DMF500ml/次洗滌6次； 步驟12 :環(huán)化 稱取TCTU94. 57g及DIEA34. 38g加入1100ml中攪拌溶解，完全溶解后加入到反應(yīng)柱 內(nèi)，氮?dú)獯禂嚪磻?yīng)90min ;反應(yīng)完畢后，取樣，用DMF洗滌6次，Kaiser Test監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度， 直至反應(yīng)完成；抽去反應(yīng)液，用DMF1100ml/次洗滌3次，再用DCM1100ml/次洗滌3次，抽 干，倒出； 步驟13 :裂解 將環(huán)化后的樹(shù)脂加入到圓底燒瓶中，加入配制好的裂解試劑（TFA :十二烷基硫醇：水： 甲酸=95 :2 :1 :2)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 :1 :2 :2)、 或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 :2 :2 :1)、或者裂解試劑（裂 解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 5 :2. 5 :2)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA : 十二烷基硫醇：水：甲酸=95 :2. 5 5 :2)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇： 水：甲酸=95 :2. 5 :2 :0. 5)、或者裂解試劑（裂解試劑TFA :十二烷基硫醇：水：甲酸=95 : 1. 5 :1 :2. 5) 2200ml，攪拌反應(yīng)120min ;過(guò)濾，樹(shù)脂用TFA洗滌3次；合并濾液，緩慢沉降到 20000ml的無(wú)水乙醚中；靜置2h后開(kāi)始離心，離心完畢后用冰無(wú)水乙醚2200ml/次離心洗 滌6次，將得到的粗肽放入冰箱過(guò)夜，冷凍干燥，即得卡貝縮宮素粗品； 步驟14 :純化 使用制備型HPLC法進(jìn)行純化，純化條件為： 流動(dòng)相A :0.2 %醋酸水溶液， 流動(dòng)相B :0. 2 %醋酸甲醇溶液， 流動(dòng)相C :1M醋酸氨溶液； 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18)柱，5 μ m，50 X 250mm; 進(jìn)樣量:6L ; 流速：l〇〇ml/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm ; 梯度：
將得到的粗肽餾分減壓干燥后加水30000ml溶解，溶液用0. 45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾；濾 液按照純化條件上樣，收集目的峰溶液，并將收集的溶液濃縮； 步驟15 :轉(zhuǎn)鹽和凍干 將步驟14得到的樣品溶液通過(guò)脫鹽柱，使用流動(dòng)相0. 2%醋酸水溶液，收集最后主峰； 將上述經(jīng)脫鹽柱收集到的樣品溶液放入凍干機(jī)中，低溫（_60°C )結(jié)冰，凍實(shí)；在真空下 控制溫度上升至_8°C，水線消失后將溫度緩慢拉升至60°C凍干24小時(shí)，即得可作為藥用原 料藥的貝卡縮宮素。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9的方法，其特征在于以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)： (1) 所述Kaiser Test檢測(cè)的測(cè)定方法如下： 試劑的配制：（l)lg茚三酮溶于20ml無(wú)水乙醇，（2)3.2g苯酚溶于4ml無(wú)水乙醇， (3)0. 4ml KCN 儲(chǔ)液（0· 01M KCN)溶于 19. 6ml 吡啶； 檢測(cè)方法：在待檢測(cè)的樹(shù)脂中將上述三種試劑按1 :1 :1比例依次各滴加2滴，通過(guò)顏 色觀察來(lái)判斷反應(yīng)是否完全，此法靈敏度達(dá)到99%以上；若溶液及樹(shù)脂為黃色，則表明樹(shù) 脂上無(wú)殘留一 NH2 ;若溶液及樹(shù)脂為紫色、淡藍(lán)色或藍(lán)色，則表明樹(shù)脂上仍有殘留的一 NH2， 顏色越深，表明殘留的一 NH2越多，肽的耦聯(lián)反應(yīng)越不完全，需延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間； (2) 其所制備得到的卡貝縮宮素，照【醋酸含量測(cè)定】法測(cè)定，其中醋酸含量不超過(guò) 5. 0% ； (3) 其所制備得到的卡貝縮宮素，照【水分測(cè)定】法測(cè)定，其中含水分不超過(guò)6.0%，例 如不超過(guò)5. 0%，例如不超過(guò)4. 5% ; ⑷其所制備得到的卡貝縮宮素，照【含量測(cè)定】法測(cè)定，其以無(wú)水與無(wú)醋酸物計(jì)算，含 C45H69N11012S 為 95. 0%?105. 0%，例如為 97 ?103%，例如為 98 ?102% ; (5) 其所制備得到的卡貝縮宮素，照【有關(guān)物質(zhì)檢查法】法測(cè)定，按雜質(zhì)峰面積與主峰 峰面積之比所得的百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算雜質(zhì)的含量，其中[D-Cys 6]-卡貝縮宮素小于1.0%、 [D-Asn5]-卡貝縮宮素小于1.0%、[Gly90H]_卡貝縮宮素小于1.0%、卡貝縮宮素亞砜I小 于0. 3%、和/或卡貝縮宮素亞砜II小于0. 4% ; (6) 其所制備得到的卡貝縮宮素，照【有關(guān)物質(zhì)檢查法】法測(cè)定，按雜質(zhì)峰面積與主峰 峰面積之比所得的百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算雜質(zhì)的含量，其中[D-Cys 6]-卡貝縮宮素小于0.8%、 [D-Asn5]-卡貝縮宮素小于0. 8%、[Gly90H]_卡貝縮宮素小于0. 8%、卡貝縮宮素亞砜I小 于0. 25%、和/或卡貝縮宮素亞砜II小于0. 35% ; (7) 其所制備得到的卡貝縮宮素，照【有關(guān)物質(zhì)檢查法】法測(cè)定，按雜質(zhì)峰面積與主峰 峰面積之比所得的百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算雜質(zhì)的含量，其中[D-Cys 6]-卡貝縮宮素小于0.5%、 [D-Asn5]-卡貝縮宮素小于0. 5%、[Gly90H]_卡貝縮宮素小于0. 5%、卡貝縮宮素亞砜I小 于0. 2%、和/或卡貝縮宮素亞砜II小于0. 3%。
【文檔編號(hào)】C07K1/06GK104086631SQ201410331088
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】方專, 江威, 王敬, 張蓮蓮, 余茹, 伍隆霞, 趙東明 申請(qǐng)人:成都天臺(tái)山制藥有限公司